α-突触核蛋白的生物学功能及其在帕金森病中的作用

α-Synuclein is identified as a constant component of dopaminergic neuronal pale eosinophilic inclusions "the Lewy bodies" in Parkinson’s disease. In fact, normal α-synuclein has lots of biological functions, which regulates synaptic plasticity, integrates presynaptic signaling, regulates dopamine level in the synapse, modulates microglial activation and lipid metabolism, and exerts heat shock protein-like function. However, abnormal α-synuclein leads to pathological lesion. Many studies show that pathological α-synuclein levels are elevated under the condition of its gene mutation, certain posttranslational modifications, dysfunction of molecular chaperones or ubiquitin proteasome system. The pathological α-synuclein plays an important role in neurodegeneration, in particular, Parkinson’s disease because it interrupts integrity of synaptic vesicles, ER-Golgi traffic and axonal transport, inhibits histone acetylation and chaperone-mediated autophagy, stabilizes itself against proteasomal degradation, and leads to neuroinflammation and abnormal phosphorylation of tau.     

α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的研究进展

帕金森病（PD）是最常见的神经系统退行性疾病,路易小体（LBs）是其最典型的病理改变。LBs的主要成分是α-突触核蛋白（α-syn）,其被认为是PD的致病因子。传递假说认为,病理性α-syn可由受损神经元转运到正常神经元,导致受体神经元中α-syn也产生病理性错误折叠和聚集,导致级联式神经细胞受损。肠脑轴假说认为,病理性α-syn可由肠道产生,经由迷走神经上传至中枢神经系统。本文就α-syn在PD发病机制中的作用进行概述,以期为PD的干预靶点的研究提供参考。     

α-突触核蛋白与帕金森病相互关系研究进展

α-突触核蛋白是一种可溶性小分子蛋白主要在中枢神经系统的突出前末梢表达。近年来关于α-突触核蛋白和帕金森病等神经退行性病的密切关系被广泛报道越来越多。在本综述中,详细介绍了α突触核蛋白的构成、生理功能和作用、病理生理、聚合机制等方面的研究进展,从α-突触核蛋白的角度理解帕金森病的发生机制。     

α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰

背景：α-突触核蛋白翻译后修饰后形成的聚集体是帕金森病主要的病理学改变。α-突触核蛋白可通过血脑屏障由中枢进入外周血分布至机体各部,这成为帕金森病病理播散的重要途径。因此研究血液中的α-突触核蛋白变化对揭示帕金森病的机制以及早期诊断尤为重要。目的：拟分析α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰位点及生成聚集体间的结构稳定性的差异。方法：构建重组人α-突触核蛋白原核表达系统,亲和层析法纯化蛋白,采用SDS-PAGE电泳和Western blot方法检测α-突触核蛋白单体纯度和特异性。收集北华大学附属医院神经内科住院的26例帕金森病患者血清和26例正常人血清,完成各组血清中α-突触核蛋白聚集体的制备;采用质谱SWATH方法检测帕金森病患者血清中α-突触核蛋白发生磷酸化修饰的修饰位点,并对不同位点的蛋白聚集体进行定量分析。将不同磷酸化修饰的蛋白聚集体免疫亲和层析法纯化后,Western blot方法检测帕金森病患者血清中各磷酸化修饰后聚集体的稳定性。结果与结论：(1)实验通过SDS电泳和Western blot方法检测显示得到纯度较高、特异性较高的α-突触核蛋白单体。(2)质谱SWAT...     

α-突触核蛋白磷酸化参与小鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的　研究α-突触核蛋白(α-SYN) 129位点磷酸化修饰是否具有神经元保护作用。方法　应用反转录病毒感染小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D,通过实时定量PCR检测各组细胞内α-SYN过表达情况,并通过免疫细胞化学方法检测野生型α-SYN (WT/α-SYN)及129位点磷酸化α-SYN (S129D/α-SYN)过表达后α-SYN在细胞内聚集情况,应用CCK-8检测细胞活力,观察WT/α-SYN及S129D/α-SYN对MN9D的细胞毒性,从而明确S129D/α-SYN对多巴胺能神经元的影响。 结果　实时定量PCR结果显示,WT/α-SYN及S129D/α-SYN在MN9D细胞内均过表达（P<0.01）。WT/α-SYN过表达组细胞活力明显下降（P<0.01）,共聚焦显微镜观察未见明显的α-SYN聚集;S129D/α-SYN过表达组细胞内可观察到明显的α-SYN聚集体,同WT/α-SYN组相比细胞活力有明显提高（P<0.01）。结论　129位点丝氨酸的磷酸化修饰在一定程度上减轻了WT/α-SYN过表达所引起的细胞毒性。     

转染α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞增强对鱼藤酮毒性的耐受

目的探讨α-突触核蛋白(α-synuc le in)在鱼藤酮处理的人类多巴胺能SH-SY5Y细胞内的作用。方法用脂质体转染的方法将-αsynuc le in基因转染入SH-SY5Y细胞内,并筛选稳定表达-αsynuc le in的细胞。经过不同浓度的鱼藤酮处理后,测定细胞活力、细胞内氧化应激和抗氧化能力。结果经鱼藤酮处理后,所有的细胞均表现为细胞活力下降和细胞内氧化应激增强。与正常SH-SY5Y细胞相比,过表达-αsynuc le in的细胞表现为较高的细胞活力和抗氧化能力(P<0.01)。结论α-synuc le in过表达可能通过增强SH-SY5Y细胞活力和抗氧化能力,来部分对抗鱼藤酮的毒性作用。     

氯胺酮对帕金森病小鼠模型α-突触核蛋白表达的影响

目的:观察氯胺酮(ketamine,Ket)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的帕金森病(Parkinson's disease,PD)小鼠模型黑质-纹状体区α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)异常表达的影响。方法:选取48只健康雄性小鼠随机分为3组:对照组(NaCl组)、模型组(MPTP组)和治疗组(MPTP+Ket组)。采用rotarod实验和gait analysis system评价3组小鼠行为学差异;免疫组化染色观察黑质区酪氨酸羟化酶阳性神经元数目变化;免疫荧光染色和Western blot检测小鼠脑黑质-纹状体区α-Syn的表达。结果:(1)Rotarod实验及gait analysis system结果显示,MPTP组较NaCl组转棒仪圈数减少,步距减小(P0.05),MPTP+Ket组较MPTP组转棒仪圈数增加,步距增宽(P0.05);(2)免疫组化及免疫荧光实验结果表明,MPTP组较NaCl组多巴胺能神经元数目减少,黑质-纹状体区荧光强度增加(P0.05),MPTP+Ket组较MPTP组多巴胺能神经元数目增多,荧光强度减少(P0.05);(3)Western blot实验结果显示,MPTP组较NaCl组黑质-纹状体区的α-Syn表达增多(P0.05),而MPTP+Ket组较MPTP组的α-Syn表达量减少(P0.05)。结论:氯胺酮对PD小鼠黑质-纹状体区α-Syn异常表达具有抑制作用。     

α-突触核蛋白在大鼠脑神经元中的亚细胞定位

目的 研究α-突触核蛋白(α-SYN)在大鼠脑神经元的亚细胞分布.方法 利用2种新的识别不同表位的抗α-SYN单克隆抗体2E3和3D5,应用免疫组织化学、免疫荧光标记和Western blot分析法对α-SYN在大鼠脑神经元的分布进行观察.结果 2E3单抗检测到α-SYN主要存在于神经元的突触前终末;3D5单抗除了能够检测到突触前终末的α-SYNCh,还可以检测到α-SYN在神经细胞核的大量存在.Western blot分析表明,2种抗体在胞质和核组分中均可以检测到一个19 ku的蛋白,与α-SYN的表观分子质量一致.结论 α-SYN免疫活性物质不仅存在于脑神经元的突触前神经末梢,而且也存在于核中,但识别不同表位的抗体对不同亚细胞部位的α-SYN的结合能力不同.     

MPTP对小鼠中脑α-突触核蛋白线粒体表达和线粒体形态改变的影响

目的:观察MPTP对中脑黑质神经元线粒体表达α-突触核蛋白及线粒体形态改变的影响。方法:运用腹腔注射MPTP诱导C57/BL小鼠中脑黑质神经元损伤,以生理盐水腹腔注射小鼠作为对照组。运用线粒体纯化结合Western Blot分析线粒体α-突触核蛋白的水平,运用免疫组织化学标记结合激光共聚焦方法观察线粒体结构的改变。运用MPP+干预原代培养的多巴胺能神经元,观察线粒体形态的改变。结果:MPTP可以诱导小鼠中脑线粒体α-突触核蛋白的水平升高,并导致线粒体出现碎片化,碎片化的线粒体结构与α-突触核蛋白共定位。运用MPP+处理原代培养的中脑腹侧神经元,发现MPP+可以选择性地诱导多巴胺能神经元的线粒体碎片化。定量研究显示:多巴胺能神经元经MPP+处理后,线粒体的长度显著降低(P0.01)。结论:MPTP可以在体诱导多巴胺能神经元的线粒体碎片化,线粒体α-突触核蛋白水平的升高可能与其碎片化密切相关。     

α-突触核蛋白调控大鼠线粒体复合体I活性

目的研究α-突触核蛋白（α-SYN）在大鼠不同脑区线粒体的表达及对线粒体呼吸链复合体I活性的影响。方法用免疫印迹方法检测不同脑区线粒体中α—SYN表达量的变化并测定α-SYN向分离线粒体的转运；通过观察340nm处NADH吸收值的变化测定线粒体呼吸链复合体I的活性。结果线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同。人重组α-SYN与分离线粒体进行孵育后，以剂量依赖的方式转运到线粒体内。将不同浓度人重组α-SYN与线粒体孵育后，线粒体复合体I活性下降，并且呈明显的量．效关系。结论线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同。线粒体的α—SYN有可能来源于胞质α-SYN向线粒体的转运，并调节复合体I的活性。     

α-突触核蛋白调控大鼠线粒体复合体Ⅰ活性

目的 研究α-突触核蛋白(α-SYN)在大鼠不同脑区线粒体的表达及对线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性的影响.方法 用免疫印迹方法检测不同脑区线粒体中α-SYN表达量的变化并测定α-SYN向分离线粒体的转运;通过观察340 nm处NADH吸收值的变化测定线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性.结果 线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同.人重组α-SYN与分离线粒体进行孵育后,以剂量依赖的方式转运到线粒体内.将不同浓度人重组α-SYN与线粒体孵育后,线粒体复合体Ⅰ活性下降,并且呈明显的量-效关系.结论 线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同.线粒体的α-SYN有可能来源于胞质α-SYN向线粒体的转运,并调节复合体Ⅰ的活性.     

氧化应激诱导多巴胺能MES23.5细胞α-突触核蛋白C-末端片段核转位

目的研究α-突触核蛋白（α-Syn）和氧化应激的相互作用关系。方法用200μmol／L H2O2,处理多巴胺能MES23．5神经细胞作为氧化应激的细胞模型。采用免疫荧光、硫磺素S组织化学染色和免疫印迹技术检测细胞氧化应激反应中α-突触核蛋白的表达状态和亚细胞定位。结果200μmol／L H2O2处理可诱导α-突触核蛋白从细胞浆转位到细胞核内,而且转位到细胞核内的是约10kD的α-突触核蛋白C-末端片段,而存在于细胞浆内的是完整的α-突触核蛋白。硫磺素S染色显示,转位到细胞核内的α-突触核蛋白C-末端片段呈非聚集状态。结论氧化应激可诱导多巴胺能MES23．5神经细胞α-突触核蛋白C末端约10kD的片段核转位。     

帕金森病中关键致病因子α突触核蛋白的研究进展

帕金森病（PD）是中老年常见的慢性神经系统变性疾病，患病率和致残率均较高，是危害老年人健康的主要疾病之一。α突触核蛋白（α-Syn）的突变和异常聚集与PD的发生、发展密切相关，但尚未明确其致病机制。α-Syn是可溶性小分子蛋白，主要集中在脑部神经细胞中表达，     

α-突触核蛋白在正常大鼠脑神经元中的亚细胞定位

目的研究α-突触核蛋白（α-synuclein）在正常大鼠脑神经元中的亚细胞定位,为阐明其正常的生理功能提供线索.方法超小金标记结合银增强免疫电镜技术.结果α-突触核蛋白不仅存在于神经细胞的突触前终末,也见于神经细胞的轴突、胞浆与核中.在突触前终末,α-突触核蛋白的分布与突触小泡无明显的关系.在神经细胞核内,靠近核膜部分α-突触核蛋白的分布较为密集,细胞核中心部位α-突触核蛋白则较为稀疏.在胞浆和轴突中,α-突触核蛋白散在分布.另外,在线粒体中也有该蛋白表达.结论α-突触核蛋白广泛分布于神经元的各个部位,可能参与神经元的多种生理功能.     

小泛素样修饰蛋白-1对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)-1对α-synuclein基因过表达或突变诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响.方法 构建野生型(WT)、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型、K96R-A...     

小泛素样修饰蛋白-1对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)-1对α-synuclein基因过表达或突变诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响.方法 构建野生型(WT)、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型、K96R-A53T突变型α-synuclein真核表达质粒.应用脂质体介导转染方式将构建好的质粒转入HEK293细胞;48 h后Hoechst 33258染色,采用Axiovert200型倒置荧光显微镜观察对细胞的影响,应用四甲基偶氮唑盐检测细胞活力,Annexin V-PE流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 将构建所得真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实;将WT型、A53T型、K96R型、K96R-A53T型α-synuclein真核表达质粒转染HEK293细胞,48 h后伊红染色显示转染野生型α-synuclein- pEGFP组及A53T突变型组某些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体(类Lewy小体)形成,分别占细胞总数的9.4％和11.7％,转染K96R及K96R-A53T融合表达载体组细胞内嗜酸性小体形成比率为10.2％和9.8％,两两相比差异无统计学意义(P＞0.05).Hoechst染色结果显示,WT组、A53T组细胞核变大,出现着色不均,染色质聚集成斑点状,未见核浓缩或核碎裂.K96R组及K96R-A53T组胞核着色基本均匀.采用四甲基偶氮唑盐法结果显示转染空质粒组细胞活力为96.2％,转染WT组、A53T组细胞活力下降至53.4％及56.1％,转染K96R组及K96R-A53T组细胞活力为72.3％和69.8％;转染48 h后,WT组、A53T组细胞凋亡率分别为32.2％和34.1％,转染K96R组及K96R-A53T突变组细胞凋亡率下降为19.4％和20.3％,两两相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SUMO-1对α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞包涵体的形成无明显影响;SUMO-1可加强α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞毒性及细胞凋亡,提示SUMO-1参与了细胞凋亡过程.     

α-突触核蛋白各结构域与MN9D细胞线粒体的关系

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)各结构域与MN9D细胞线粒体的关系.方法 用PCR方法获得α-synuclein/1～65(N),α-synuclein/61～95(A)及α-synuclein/96～140(C)基因片段,克隆入真核表达质粒pLNCX2,经测序正确后以脂质体转染PT-67细胞,挑取单克隆并扩增,收集上清感染MN9D细胞,分别用Real Time PCR检测细胞基因表达水平,免疫组织化学染色检测蛋白表达,激光扫描共焦显微镜检测蛋白与线粒体共定位,流式细胞术检测细胞状态及线粒体膜电位状态.结果 成功构建了pLNCX2/N、pLNCX2/NAC及pLNCX2/C基因片段的重组真核表达质粒,获得了可稳定表达α-synuclein各基因片段的MN9D细胞株.通过激光扫描共焦显微镜观察,可见α-synuclein/N端与线粒体存在共定位关系;α-synuelein/NAC主要在核内聚集表达;α-synuclein/C端在胞质和胞核内均有表达.JC1染色流式细胞术检测显示,过表达α-synuclein/N实验组细胞线粒体膜电位降低.结论 α-synuclein的N端可能定位于线粒体,并参与调节线粒体功能;α-synuclein/NAC虽具有疏水性但却能穿过核膜,聚集在核仁周围;α-synuclein的C端定位于胞质和核内可能参与多种细胞功能.     

α-突触核蛋白过表达对黑质多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶表达的影响

目的 研究α-突触核蛋白(α-synuclein，α-SYN)过表达对多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法 在α—SYN基因转染的MES 23．5大鼠黑质多巴胺能神经元细胞系，分别用免疫组织化学、免疫荧光、Western blot等方法分析α-SYN和TH的表达以及两者之间的关系。通过绘制生长曲线和MTT测试细胞氧化还原活性，观察α—SYN基因转染细胞的生长和损伤情况。结果 α-SYN过表达明显抑制MES 23．5多巴胺能神经元的TH表达，但对该细胞的生长和增殖无明显影响，也不引起该细胞损伤。结论 α-SYN过表达对多巴胺能神经元的TH表达具有抑制作用。     

Toll样受体4在帕金森病中的研究进展

帕金森病(Parkinson disease,PD)是由中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性、丢失引起的神经退行性疾病.PD患者主要表现为以静止性震颤、运动减少、肌强直、姿势步态异常等为主的运动症状,还多伴有以认知障碍、睡眠障碍、感觉障碍等为主的非运动症状[1].PD的发病率与年龄呈正相关.一项荟萃分析...     

影响人α-突触核蛋白基因在原核细胞中表达因素的研究

目的　研究影响人α 突触核蛋白 (α synuclein)基因在原核细胞中表达的常见因素 ,以提高其在原核细胞中的表达量。　方法　将重组质粒ProEXNACP转化进入到DH5α 大肠杆菌体内 ,观察诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度、诱导培养基、诱导初始菌浓度及诱导中pH值变化等因素对蛋白表达产量的影响 ,用SDS PAGE梯度胶电泳分析 ,考马斯亮蓝染色进行比较研究 ,同时检测pH值 ,观察其变化。　结果　诱导剂IPTG浓度对诱导蛋白产生的影响不大 ,诱导过程中pH值变化较小 ,而诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类对诱导产生α 突触核蛋白有较大影响。其中 ,以LB培养基 ,37℃ ,180r min诱导 1～ 2h产生α 突触核蛋白的量最大。　结论　诱导剂IPTG诱导ProEXNACP/DH5α大肠杆菌产生α 突触核蛋白的量与诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类有明显的关系。初始菌A590 =0 5～ 0 8,LB培养基 ,37℃ ,大通氧量 (180r min以上 ) ,1～ 2h诱导可作为大量提取、纯化α 突触核蛋白的首选条件。