HBcAg显性失活突变体质粒的构建及体外表达

目的探讨HBcAg显性失活突变体质粒pCDNA4-C-GFP的构建及体外表达.方法选择编码乙肝核心抗原C基因片段及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因片段,利用基因重组技术构建成DNA质粒pCDNA4-CGFP,并将该质粒转染肝癌细胞株HepG2.结果通过RT-PCR检测到其RNA的表达,Confocal观察到GFP绿色荧光.结论HBcAg显性失活突变体质粒pCDNA4-C-GFP的构建成功可以进行对HBV作用的研究.     

活化型及失活型n-Src真核表达载体的构建及活性鉴定

目的 构建神经型酪氨酸蛋白激酶n-Src的活化型（aSrc,SrcY535F）及失活型（iSrc,SrcK303R）真核表达载体并鉴定其在HEK293T细胞中的表达及活性.方法 以野生型pRc/CMV-n-Src真核表达载体为模板,采用PCR定点突变技术分别扩增活化型及失活型pRc/CMV-n-Src全长序列,并转染入HEK293T细胞,通过免疫印迹检测n-Src的蛋白表达及其自身磷酸化水平.结果 aSrc及iSrc目的 基因成功扩增,且测序结果与预期结果一致.免疫印迹分析显示,aSrc及iSrc均能在HEK293T细胞中表达,aSrc自身磷酸化水平显著升高.结论 成功构建活化型及失活型n-Src真核表达载体,并能于HEK293T细胞中高效表达.     

胃癌中RUNX3基因表达失活及临床意义的研究

目的:研究胃癌中RUNX3的表达情况并分析临床意义,评价RUNX3基因能否作为胃癌的抑癌基因.方法:基于RT PCR方法检测RUNX3基因,在mRNA水平上胃癌细胞株SGC7901、60例胃癌组织及50例癌旁正常组织中表达的差异、并分析其与临床病理参数的关系等.结果:RT-PCR结果表明RUNX3 mRNA在SGC7901细胞株中没有表达,在79.3%(47/60)的胃癌组织中没有表达或表达明显下降,而在50例癌旁正常组织中正常表达.统计学结果显示,与癌旁正常组织相比,RUNX3 mRNA在癌组织的表达有显著性差异(P<0.001).本研究结果表明,胃癌淋巴结转移和TNM分期与RUNX3 mRNA的表达异常下降有明显关系,而RUNX3 mRNA的表达与患者性别和年龄、是否有饮酒史与家族史、以及肿瘤大小和分化程度等无显著相关(P>0.05).结论:RUNX3基因在胃癌组织及细胞株SGC7901中表达异常下降,RUNX3基因的表达下降与胃癌TNM分期及淋巴结转移呈显著相关,RUNX3可以作为胃癌的新抑癌基因.     

SET-EGFP重组表达质粒的构建及表达

目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体（EGFP）的融合表达质粒pEGFP—N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和KpnI酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA，以逆转录后cDNA为模板，PCR扩增获得SET基因片段，经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP—N2载体中，获得重组质粒pEGFP—N2-SET。以Lipofectamine^TM2000为载体，将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果。经DNA测序鉴定证实，pEGFP—N2-SET重组质粒构建成功，经荧光倒置显微镜观察，证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

pQE-EGFP原核表达载体的构建及其表达和鉴定

目的:利用分子克隆技术构建原核表达载体pQE-EGFP,在大肠埃希菌中高效表达与鉴定。方法:以质粒pEGFP-N2为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,将其克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,用异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定表达蛋白质。结果:PCR扩增得到了EGFP全长结构基因。所构建的pQE-EGFP重组质粒经酶切及测序鉴定结果与设计序列一致;转化大肠埃希菌JM109,经IPTG诱导后,目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE、Western blotting初步测定目的蛋白的相对分子质量约为28 500,与理论预期值一致。结论:pQE-EGFP重组质粒的成功构建、表达和鉴定为TAT-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

研究活细胞生命现象的新途径──绿色荧光蛋白基因的重组与表达

绿色荧光蛋白（ｇｒｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ，简称ＧＦＰ）是从发光水母（ＡｅｇｕｏｒｅａＶｉｃｔｏｒｉａ）分离出来的一种荧光蛋白，它在蓝光或近紫外光的激发条件下，不需加入任何反应底物就可发射绿色荧光，并由此而命名。纯化了的ＧＦＰ由２３...     

NF2基因突变体真核表达载体的构建和表达

目的构建NF2突变体真核表达载体,并观察其在人胚肾细胞HEK293中的表达。方法采用分子生物学方法构建NF2突变体,将突变体克隆入真核表达载体pEGFP—N1中,进行筛选和鉴定,然后在脂质体介导下,将重组载体转染至真核细胞HEK293中,应用Western blot法检测蛋白的表达。结果通过使用重叠延伸PCR法定位突变,从野生型NF2基因cDNA模板中扩增得到预期大小的NF2突变体条带,DNA测序证实NF2突变体序列的正确性。重组载体转染HEK293后能产生merlin蛋白。结论本研究成功构建重组载体pEGFP—N1-NF2突变体,其转染HEK293后,能有效表达于HEK293中。     

重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的构建及其在体内外的表达

目的构建猪源性胆囊收缩素(CCK)基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行表达。方法从含CCK的中介载体pMD18-T/CCK中,以限制性内切酶方法获取目的片段,将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,以脂质体法转染COS-7细胞,利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,同时采用肌肉注射法免疫仓鼠,了解重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的体内表达。结果构建了猪CCK基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,用其转染COS-7细胞后24h、48h、72h均可检测到绿色荧光蛋白的表达,其中72h组荧光强度达到最强。用pIRES2-EGFP/CCK免疫仓鼠后,第4d注射部位可以检测到绿色荧光蛋白的表达,第14d荧光强度明显增强,第42d荧光强度进一步增强,正常对照组始终未检测到绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了猪源性CCK基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并成功地在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行了表达,为仓鼠胰腺癌的交叉免疫治疗奠定了基础。     

pET15b-YARA-EGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARA-EGFP的表达与纯化

目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。     

基于hxgprt 缺陷的弓形虫顶质体荧光突变株的构建

目的： 构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）标记顶质体的弓形虫突变株,建立检测顶质体的简便方法。方法： 扩增顶质体酰基载体蛋白（acyl carrier protein, ACP）基因并构建转染载体pHX-ACP-GFP,转入弓形虫hxgprt-株速殖子,经霉酚酸和黄嘌呤筛选荧光突变株。激光共聚焦显微镜和蛋白质印迹技术检测突变株ACP-GFP融合蛋白的表达。结果： 通过霉酚酸和黄嘌呤筛选,可以在1周内获得突变株。激光共聚焦显微镜下观察到ACP-GFP融合蛋白聚集于顶质体,用抗GFP抗体能检测出ACP的转运肽型和成熟型蛋白。结论： 顶质体荧光突变株可清晰标记出顶质体的位置,借助GFP标签即可检测融合蛋白的表达。     

F10基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位

目的：构建F10基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体，进而观察F10基因编码蛋白在细胞内的定位情况。方法：运用RT—PCR技术从葡萄胎组织中分离F10基因的完整ORF，构建pEGFP-N2／F10和pEGFP—C2／F10的融合表达载体，以1Apofect AMINE2000为介导剂，将重组载体转染入人乳腺癌细胞MCF-7，并在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察表达的融合蛋白。结果：显微镜下观察到，GFP／F10融合蛋白呈不规则的颗粒状、环状分布于细胞核，或细胞浆，或者在核浆中均有分布，而且在细胞浆中主要分布在细胞器中。而对照的pEGFP蛋白均匀分布在整个细胞浆和细胞核。结论：F10蛋白在细胞的不同周期分布不同，或在细胞核，或在细胞胞浆中，或者在核浆中均有分布。     

p21-EGFP 融合基因表达载体与卵母细胞的表达定位

目的:通过构建绿色荧光蛋白p21-EGFP融合基因表达载体,观察其在小鼠卵母细胞中的表达及定位,为研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21对小鼠卵母细胞细胞周期的影响提供实验基础.方法:以含有p21的全长序列的质粒为模板PCR扩增p21cDNA , 应用基因重组技术与EGFP 基因融合, 构建以绿色荧光蛋白EGFP为报告基因的重组表达质粒pEGFP-p21.利用显微注射方法注射到小鼠卵母细胞中进行表达,用荧光显微镜直接观察pEGFP-p21融合蛋白在细胞中的分布和定位, Western Blot 方法检测其蛋白的表达.经酶切证实插入片断的正确性.结果:荧光显微镜观察结果显示在空载体pEGFP-C3转染的小鼠卵母细胞中,绿色荧光呈弥散分布,而经注射重组质粒pEGFP-p21 的小鼠卵母细胞中, 绿色荧光主要集中在细胞核内.同时用Western Blot 证实了pEGFP-p21 融合基因的表达.结论:成功的构建了pEGFP-p21 融合表达质粒.同时证明小鼠卵母细胞能高效表达pEGFP-p21 融合基因, 且主要定位于细胞核内.     

Constructing retroviral vector carrying green fluorescent protein （GFP） and investigating the expression of GFP in primary rat myoblast

INTRODUCTION Green fluorescent protein ( G FP ) absorbs blue or ultraviolet light , and gives out bright green fluorescence.G FP has been expressed in a variety of species , and extentively used in tissue engineering [1]. M yoblast could fuse w ith host m yofibers , transform - ing the target gene into the host , and expressing corressponding gene product.M yoblast is com patible w ith collagen and could be induced to differentiate by collagen. N ow m yoblast has been used in studies on…     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs)。方法运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,MluⅠ、EcoRⅠ双酶切反应及测序分析加以鉴定。将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测。结果构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经MluⅠ和EcoRⅠ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致。三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装后慢病毒测定滴度为0.1×109~1×109TU/mL。pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞。结论成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性。     

前列腺特异性膜抗原启动子调控的重组质粒的构建及表达

目的 探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,为前列腺癌靶向性基因治疗作前期铺垫。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中扩增PSMA启动子序列,将其克隆到含有报告基因——增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体,脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察EGFP在不同细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP-PSMAm,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNeap细胞中存在GFP的有效表达。结论 PSMA启动子调控EGFP表达的重组质粒的构建证明了PSMA启动子的基因转录启动与细胞PSMA的表达相关,即具有前列腺细胞特异性。     

绿色荧光蛋白作为骨髓间充质干细胞示踪标记物在脑出血脑内的表达

目的 探讨利用绿色荧光蛋白(GFP)作为骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脑出血示踪标记物的可行性.方法 利用GFP空载体重组腺病毒感染BMSCs,应用脑立体定位仪将感染的BMSCs移植入脑出血大鼠纹状体内,移植后5、14 d,脑组织行冰冻切片,荧光显微镜下观察BMSCs在脑组织内分布的表达.结果 感染细胞与未感染细胞体外培养形态无差异,感染细胞及其传代细胞发强绿色荧光.荧光显微镜下观察脑出血模型冰冻切片,移植后各时间点在移植部位周围病灶区内有大量发绿色荧光的细胞.结论 GFP感染BMSCs能在脑出血大鼠脑内稳定持久表达,表明GFP是脑出血干细胞移植治疗的有效示踪标记物,为进一步研究移植细胞在宿主脑内的可塑性研究奠定基础.