华支睾吸虫组织蛋白酶Cathepsin L1 样基因全长序列的克隆和生物信息学分析

目的预测华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列的结构和功能特征及编码蛋白的应用前景。方法利用NCBI和ExPaSy等生物信息学网站在线分析工具和Vector NTIsuite及PcGene等软件包，分析华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列及其编码蛋白的理化性质、结构与功能特征。结果BLASTx分析该ESF序列是组织蛋白酶Cathepsin L1的同源基因，全序列长为1458bp，包含完整的编码区80～1191，编码371个氨基酸，前18个氨基酸是分泌信号肽，蛋白的理化性质较稳定。该蛋白有2个空间构象相对独立功能域：N端的抑制功能域和C端的活性功能域，抑制功能域含有3个线性B细胞抗原表位，同源性较低；C端活性功能域同源性较高，Cys177，His318和Asn338组成催化中心，位于底物结合裂缝的底部。结论华支睾吸虫Cathepsin Ll基因与多个物种的Cathepsin L1基因同源，编码蛋白可能是重要的虫体分泌排泄抗原成分，在华支睾吸虫病的免疫诊断和疫苗研究方面有较好的应用前景。     

华支睾吸虫糖基转移酶基因全长序列的克隆和生物信息学分析

目的分析和预测华支睾吸虫囊蚴全长cDNA质粒文库中编号为cs091c06的糖基转移酶基因EST序列结构和功能特征及其编码蛋白的理化性质,预测该基因的生物学意义和应用前景。方法利用NCBI网站和ExPaSy等生物信息学在线分析工具和Vector NTI suite等软件包,分析华支睾吸虫囊蚴全长cDNA质粒文库中cs091c06的EST序列及编码蛋白的理化性质、结构与功能特征。结果 BLASTx工具分析该EST序列是糖基转移酶的同源基因,序列全长为1 402bp,其完整的编码框为37～1 011bp,编码325个氨基酸。Target P和Signal P软件预测该编码氨基酸前30个氨基酸是分泌信号肽,蛋白的理化性质较稳定。蛋白质一级结构扫描发现两个糖基转移酶的保守功能区分别位于67～178aa和69～253aa,且在该基因的N端发现明显的蛋白质糖基化位点,分别位于76～79aa和190～193aa。在该基因的氨基酸序列中,共发现8个B细胞表位和6个T细胞表位。RT-PCR结果显示,该基因在华支睾吸虫成虫阶段高表达,囊蚴和虫卵阶段低表达。结论华支睾吸虫糖基转移酶基因与多个物种同源,编码蛋白可能是华支睾吸虫重要的虫体分泌排泄抗原成分;阶段特异性表达特征提示该基因很可能参与华支睾吸虫重要虫源蛋白糖基化过程,可作为华支睾吸虫病疫苗候选分子和药物靶标。     

华支睾吸虫表膜相关蛋白基因的扩增、序列分析和克隆

目的识别华支睾吸虫新基因,并将所发现的华支睾吸虫表膜相关蛋白(tegumental protein ofClonorchis sinensis,CsTP)的cDNA序列克隆到原核载体中,为进一步的研究奠定基础。方法对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序,用在线生物信息学工具进行序列分析,识别CsTP基因,并对其进行同源性、物理性质及结构分析。设计引物,从华支睾cD-NA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,并构建原核重组质粒,相同引物从华支睾吸虫基因组中扩增出CsTP的DNA序列。结果发现CsTP基因,其cDNA完整阅读框含555个碱基,编码184个氨基酸,理论分子量为20.7kDa;其DNA序列含1393个碱基,含有3个外显子、2个内含子。序列分析表明,CsTP蛋白与其它物种的表皮蛋白或膜相关蛋白有一定的同源性。所构建的重组原核表达质粒PGEX-4T-1-CsTP经PCR、双酶切及测序证实与目的基因相符。结论发现华支睾吸虫表膜相关蛋白基因,成功构建其重组原核表达质粒为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

华支睾吸虫成虫全长基因表达文库的构建和基因表达谱的建立

目的 获得尽可能多的华支睾吸虫UNIGENE及全长基因，建立成虫基因表达谱，为华支睾吸虫发育过程中基因表达的规律和功能基因组学研究奠定基础。方法 构建pBlueseript Ⅱ SK全长cDNA质粒文库，先对5’端进行随机EST大量测序，生物信患分析后归并UNIGENE，并对归并的结果进行了3’端的序列测定，根据3’端测序结果，再次进行UNIGENRE归并，对能够拼按上的克隆进行了序列拼接。对预测为完整基因且未测通的序列，进行了引物设计，walking反应测序，将得到的UNIGENE用点样法制备基因芯片。结果 获得5’端有效EST序列4066个，测序结果UNIGENE分析，归并获得1775个UNIGENE，5’端预测的全长基因为377个。共获得测通的cDNA序列277个，其中全长基因198个。目前制备的华支睾成虫基因表达谱芯片含有1775个基因。结论 所构建的华支睾吸虫成虫全长cDNA文库质量较好，采用的技术路线获取全长基因建立基因表达谱的效率较高。     

华支睾吸虫CsSCCRO基因的克隆表达和蛋白纯化

目的原核表达华支睾吸虫鳞状上皮癌相关肿瘤基因(SCCRO)全长编码区序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做好准备。方法用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA文库中识别出与人鳞状上皮癌相关基因的同源序列及其全长编码区,将其编码区序列克隆到原核表达载体PET-30a(+),测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,重组产物用His-镍蛋白纯化柱纯化。结果华支睾吸虫鳞状上皮癌相关基因长度为1 218bp,其全长编码序列长度为780bp,编码259个氨基酸,1-22位为分泌信号肽,在羧基端有一个高度保守的区域。该基因在大肠杆菌中得到了高效的可溶性表达,重组蛋白达总蛋白的39%,纯化后的重组蛋白纯度可达98%。结论鳞状上皮癌相关基因的PET-30a(+)原核重组质粒在大肠杆菌BL-21/DE3中可以稳定高效地表达可溶性蛋白。     

华支睾吸虫Rap2B样基因的生物信息学分析及其克隆、表达

目的从华支睾吸虫cDNA文库中筛选Rap2B样基因并分析其结构和功能,初步进行克隆和表达纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用多种生物信息学分析软件,分析华支睾吸虫Rap2B蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征。设计引物,从华支睾cDNA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,构建原核重组质粒并初步表达纯化。结果华支睾吸虫Rap2B样基因长度为847bp,其全长编码序列为426bp,编码141个氨基酸,理论分子量是15851.1。重组的原核表达质粒pET-28a(+)-Rap2B经PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒构建成功。该基因在大肠杆菌中能高效表达。经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实Rap2B重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫Rap2B蛋白经生物信息学预测为ras原癌基因家族成员,可能在华支睾吸虫致癌过程中有一定作用。该基因可在原核表达系统中高效表达,并得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能以及在致病尤其是可能促发肿瘤的作用方面奠定一定基础。     

华支睾吸虫19kDa分泌型蛋白(CsSP19)基因的克隆、表达与免疫学功能研究

目的对一个新发现的华支睾吸虫分泌型蛋白的未知基因,进行克隆表达和重组产物的免疫学鉴定,确定其免疫学功能。方法利用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA质粒文库中发现一个编码分泌型蛋白的新基因（克隆号Cs004f03）,将去除信号肽序列的编码序列克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,IPTG诱导表达,产物经亲和层析纯化,并制备大鼠免疫血清,Western-blot方法分析其抗原性和分泌性。结果CsSP19开放阅读框（ORF）有564bp,编码188个氨基酸,理论分子量为21.2kDa,成熟肽的理论分子量为19kDa。该基因的成熟肽编码区在大肠杆菌中可获得高表达,重组蛋白能被华支睾吸虫病人血清所识别,同时,重组蛋白免疫血清也能识别华支睾吸虫分泌排泄抗原中分子量约19kDa的蛋白条带。结论CsSP19蛋白是华支睾吸虫分泌排泄抗原中一个有潜在诊断价值的分泌蛋白。     

华支睾吸虫一个谷胱甘肽转移酶新基因的克隆与表达

目的 克隆华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,Cs)谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase,GST)的一个新基因,并在大肠杆菌中表达。方法 用PCR方法从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库中扩增新基因CsGST1,对DNA及其推导的氨基酸进行序列分析。将CsGST1克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠杆菌BL21/DE3表达,用SDS-PAGE鉴定重组蛋白。结果 从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库扩增出642 bp的CsGSTl,序列分析显示它所编码的氨基酸序列与麝猫后睾吸虫GST的同源性最高(88％),并具有GST N-末端和C-末端的保守功能域。构建了重组质粒pET-30a(+)-CsGST1,SDS-PAGE显示CsGST1在大肠杆菌中得到了高效表达,pET-30a(+)-CsGST1的蛋白条带的分子量约为30 kDa。结论成功构建了CsGST1的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究该基因的功能打下了基础。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

目的 通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库，寻找、识别新基因，并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中，表达出融合蛋白，为进一步研究其功能奠定基础。方法用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增，对产物为500bp以上的质粒进行测序，测序结果在NCBI和ExPasy，网站上进行序列分析，识别华支睾吸虫新基因，并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据pGEX-4T-1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA编码序列设计引物，进行PCR扩增，扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体pGEx-4T-1上。构建的重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定，并对鉴定过的重组体进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定。结果 发现CsGAPDH基因，完整阅读框含1017个碱基对，编码339个氨基酸，理论分子质量单位为37．02409ku，理论pI为6．66。序列分析显示，CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78％，具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS-PAGE电泳显示表达产物在63ku处有1条特异性条带。结论 发现华支睾吸虫GAPDH基因，成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。     

华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析

目的　筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因 ,并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶 (csLysoPLAH)基因编码区克隆到原核表达质粒PGEX 4T 1和真核表达质粒pcDNA3上 ,为进一步研究其功能奠定基础。　方法　对华支睾吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序 ,在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析 ,识别华支睾吸虫新基因 ,并应用Motifsan、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行结构域分析。根据PGEX 4T 1和 pcDNA3上的克隆位点及所发现的csLysoPLAHcDNA编码序列设计引物 ,进行PCR扩增 ,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX 4T 1和真核表达载体 pcDNA3上。构建的PGEX 4T 1 csLysoPLAH、pcDNA3 csLysoPLAH重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实。　结果　发现csLysoPLAH基因 ,完整阅读框含 70 8个碱基 ,编码 2 3 5个氨基酸 ,理论分子质量为 2 5 .2 62 8ku ,理论pI为6.0 3。序列分析表明 ,csLysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性 ,csLysoPLAH具有磷脂酶 /羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域 ,并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽 (即GXSXG)。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。　结论　发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因 ,并成功构建原核和真核重组表达质粒。     

华支睾吸虫多药物/代谢产物外排蛋白样基因的识别和生物信息学分析

目的预测华支睾吸虫假想的多药物/代谢产物外排蛋白的结构及功能及其应用前景。方法利用多种生物信息学分析软件,从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别出多药物/代谢产物外排蛋白样基因,分析蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征,根据结构与功能预测其应用前景。结果该基因编码189个氨基酸;含有5段跨膜区,N端在胞内,C端在胞外,具有主要协助因子超家族的结构特征。与日本血吸虫同源蛋白(一致性为67%,相似性为80%)相比,该蛋白的4段跨膜区中含有保守的精氨酸和组氨酸残基。该蛋白含有多个磷酸化位点和T、B细胞表位,且线性B细胞表位均位于胞外区。结论所克隆的华支睾吸虫基因可能编码一个小蛋白型阴离子多药物/代谢物外排蛋白;该蛋白可能定位于华支睾吸虫皮层表膜,是一个潜在的诊断和疫苗候选抗原和药物靶标分子。     

华支睾吸虫蛋白酶体α2新基因的生物信息学分析与克隆表达

目的发现华支睾吸虫成虫蛋白酶体新基因,应用生物信息学方法预测其结构和功能,表达重组蛋白为进一步确定其功能特征奠定基础。方法通过华支睾吸虫成虫cDNA文库的大规模测序,获取全长cDNA序列,利用生物信息学软件ORFfinder,BLAST,Conserved Domains和ExPASy等识别华支睾吸虫蛋白酶体α2(CsPSMA2)新基因,分析其基因和编码蛋白结构,同源性比对并构建系统发育树。将CsPSMA2基因克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定。结果确定了编码CsPSMA2的新基因并成功登录到GenBank(Accession NO.:EU223819)。该基因全长833bp,编码235个氨基酸,第5-232aa之间含有蛋白酶体α2全长结构域,理论分子量为26.0kDa,分子进化分析显示CsPSMA2的蛋白与日本血吸虫亲缘关系最近,重组质粒融合表达了带有GST标签的CsPSMA2蛋白。结论发现了华支睾吸虫蛋白酶体α2新基因,确定了其重要的功能域和结构特征,成功进行了该基因在大肠杆菌中的克隆表达。     

广州管圆线虫雌性成虫肌蛋白-1基因的克隆及生物信息学分析

目的对广州管同线虫雌性成虫肌蛋白-1（Ac-fmp1）基因的开放渎码框进行克隆,分析序列结构、功能特征及编码蛋白的理化性质,并构建体外表达载体。方法采用逆转录聚合酶链反应和,TA克隆方法克隆Ac—fmp—l基因的开放读码框全长;运用NCBI网站和ExPaSy等七物信息学在线工具分析Ac—fmp-1基因编码序列及其编码氨基酸的理化性质、结构及功能;采用基因克隆技术定向克隆至原核表达载体pET一30ac（＋）,构建Acfmp一1基因重组表达质粒。结果扩增和克隆了广州管网线虫Acfmp1基因开放读码框序列,此序列大小为1251bp,勺GenBank数据库中AcImp-1基因的编码序列同源性为99．6％,编码417个氨基酸。ProtParam预测陔基因编码蛋白在溶液中不稳定、保守性差,未发现跨膜区域。PHD法二级结构预测该蛋白质分子为a螺旋型,于氨基酸残基346～404位点处含有一个锌指结构,SignalP软件预测该蛋白分子无信号肽序列,具有较强的亲水性。该基因编码蛋白的氨基酸序列中,含有16个潜在的B细胞抗原表位。构建的原核表达载体pET—Acfmp1成功定向插入了Acfmp-1基因。结论成功扩增和克隆了广州管圆线虫Ac—fmp-1基因,编码蛋白可能是广州管圆线虫的重要抗原成分,可作为广州管网线虫病的疫苗候选分子和药物靶标。构建了用于体外表达的原核表达载体,为进行Acfmp-1功能研究奠定了基础。     

华支睾吸虫蛋白酶体β2新基因的识别与克隆表达

目的识别华支睾吸虫蛋白酶体β2亚单位新基因(CsPSMB2),表达其重组蛋白,为进一步研究CsPSMB2的功能奠定基础。方法通过大规模cDNA文库随机测序,发现CsPSMB2新基因。并将其定向插入到pGEX-4T-1载体中。构建成功的载体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定。结果发现了编码PSMB2基因的一个新成员CsPSMB2,CsPSMB2全长708个核苷酸,编码一个201个氨基酸残基的蛋白,理论分子量为22.5kD,预测的蛋白与人的PSMB2蛋白同源性为58%并且含有一个蛋白酶体结构域,成功登录GeneBank,登录号为AY849972。构建成功重组质粒pGEX-4T-1-CsPSMB2,经IPTG诱导后表达出PSMB2的GST融合蛋白。结论发现华支睾吸虫新基因CsPSMB2,成功构建了pGEX-4T-1-CsPSMB2重组表达载体并表达出了CsPSMB2的GST融合蛋白。为进一步研究CsPSMB2在华支睾吸虫中的功能和可能的应用研究奠定基础。     

华支睾吸虫磷脂酶A2基因生物学特性的初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫磷脂酶A2（CsPLA2）基因进行生克隆、原核表达,确定该蛋白是否为成虫分泌/排泄蛋白（excretory-secretory protein,ESP）。方法利用多种生物信息学分析软件,从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别出CsPLA2样基因,分析该基因表达蛋白的生物学功能特征;将CsPLA2克隆入原核表达质粒pET28a（＋）,并在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,蛋白表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定;应用Western blot确定CsPLA2是否为ESP;应用免疫荧光方法观察CsPLA2在成虫的组织定位。结果该基因编码307个氨基酸,含有信号肽序列,具有PLA2功能域和活化位点,与谷蛀虫同源蛋白相比,一致性为45%,相似性为52%。PCR、双酶切及DNA测序结果表明pET28a-CsPLA2重组质粒构建成功,SDS-PAGE显示目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中高效表达,表达产物为包涵体。Western blot结果表明CsPLA2是华支睾吸虫的ESP组分之一。虫体免疫组织化学定位显示CsPLA2定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处。结论新发现一个CsPLA2基因,其表达的蛋白定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处,为华支睾吸虫成虫ESP组分之一。该基因可在原核表达系统中高效表达。     

东方巴贝斯虫核糖体蛋白L26全长cDNA克隆及蛋白特性分析

目的克隆东方巴贝斯虫核糖体蛋白L26（RPL26）全长cDNA序列,对编码的蛋白特性进行分析,并探讨它们在研究系统发育中的应用。方法采用经EST测序获得的东方巴贝斯虫RPL26的5′特异性引物及文库载体3′通用引物对东方巴贝斯虫cDNA文库进行扩增,测序获得东方巴贝斯虫RPL26全长cDNA序列。用BLASTX程序搜索相似性序列及保守结构域,所获序列在GenBank中登记,并用Neighbor-Joining（N-J）法构建基于L26氨基酸序列的系统发育树。结果东方巴贝斯虫RPL26全长cDNA序列（GenBank登录号为FJ492804）长度为716 bp,开放阅读框为414 bp,编码137个氨基酸;同源性分析结果表明东方巴贝斯虫RPL26序列较保守,与牛巴贝斯虫（Babesia bovis）、小泰勒虫（Theileria par-va）等亲缘关系较近,在系统发育树中的遗传距离也较近。结论首次获得东方巴贝斯虫RPL26基因,其可能作为分子指标应用于研究生物系统发育。     

广州管圆线虫组织蛋白酶Z基因的原核表达及免疫学分析

目的克隆并原核表达广州管圆线虫组织蛋白酶-Z基因,评价其融合蛋白在免疫诊断中的应用前景。方法利用生物信息学分析工具,分析广州管圆线虫组织蛋白酶-Z的理化性质、结构与功能特征;克隆目的基因至原核表达载体pET30a(+),经PCR、双酶切鉴定后,IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE鉴定,融合蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化;ELISA检测融合蛋白作为诊断抗原的敏感性及特异性。结果该蛋白理化性质较稳定,含有分泌型信号肽;含有构成半胱氨酸蛋白酶催化中心的Cys84、His232和Asn253三个氨基酸残基。成功构建了重组质粒且目的基因在E.coliBL21中获得高效表达,经亲和层析获得了纯化的融合蛋白。融合蛋白可被其免疫的BALB/c小鼠血清及感染广州管圆线虫的小鼠血清识别;作为包被抗原用于ELISA检测小鼠血清其敏感性及特异性均为100%与粗抗原无差别,检测其他寄生虫病人血清及正常人血清其特异性分别为100%和97.4%与粗抗原相比特异性较高。结论广州管圆线虫组织蛋白酶-Z与多个物种组织蛋白酶-Z基因同源,是一种半胱氨酸蛋白酶,含有信号肽,可能是重要的虫体分泌排泄抗原成分,在广州管圆线虫病的免疫诊断方面有潜在的应用前景。     

Cloning and sequence analysis of cDNA for human cathepsin D.

An 1110-base-pair cDNA clone for human cathepsin D was obtained by screening a lambda gt10 human hepatoma G2 cDNA library with a human renin exon 3 genomic fragment. Poly(A)+ RNA blot analysis with this cathepsin D clone demonstrated a message length of about 2.2 kilobases. The partial clone was used to screen a size-selected human kidney cDNA library, from which two cathepsin D recombinant plasmids with inserts of about 2200 and 2150 base pairs were obtained. The nucleotide sequences of these clones and of the lambda gt10 clone were determined. The amino acid sequence predicted from the cDNA sequence shows that human cathepsin D consists of 412 amino acids with 20 and 44 amino acids in a pre- and a prosegment, respectively. The mature protein region shows 87% amino acid identity with porcine cathepsin D but differs in having nine additional amino acids. Two of these are at the COOH terminus; the other seven are positioned between the previously determined junction for the light and heavy chains of porcine cathepsin D. A high degree of sequence homology was observed between human cathepsin D and other aspartyl proteases, suggesting a conservation of three-dimensional structure in this family of proteins.