广东省传染性非典型肺炎病原体的分离鉴定及检测结果分析

目的 对引起广东省传染性非典型肺炎(SARS)的病原体进行分离鉴定，并分析各市首发病例、死亡病例、各个阶段病例的检测情况，为该病的诊断和防治提供依据。方法 对2003年1～5月份采自广州、肇庆、江门、汕头、中山、河源、珠海等地的SARS病例的咽拭子、咽漱液等标本，用Vero—E6、Vero、MDCK、Hep—2、传代人胚肺5种细胞进行分离培养，并使用电镜、间接免疫荧光(IFA)、PCR及基因序列测定等方法对分离物进行鉴定，应用ELISA、荧光定量PCR等技术分别对各个阶段SARS病例的血清及咽拭子等标本进行检测。结果 5种细胞接种上述病人咽拭子标本后，均有部分出现细胞病变，电镜观察可找到冠状病毒样颗粒。分离物扩增出冠状病毒特异基因片断。分离物与病人恢复期血清抗体发生特异性反应。1～5月的病例标本SARS冠状病毒PCR阳性率分别为100．00％(2／2)、76．19％(16／21)、71．74％(33／46)、20．00％(18／90)、6．36％(11／173)；SARS冠状病毒抗体IgG阳性率分别为100．00％(2／2)、78．57％(11／14)、58．33％(14／24)、30．3％(10／33)、12．50％(9／72)。河源、佛山、肇庆、中山、东莞、珠海六市首发病例均检测出SARS冠状病毒I弗抗体。10个死亡病例中8例检测出SARS冠状病毒基因或相关抗体。结论 SARS冠状病毒是引起本次广东省SARS流行的主要病原体；不同时期SARS冠状病毒特异基因片断和抗体的检出率明显不同。     

广州地区传染性非典型肺炎病原体分离结果和特性分析

目的 分析从传染性非典型肺炎(SARS)患者标本中分离到的病原体及其特性。方法 将采集的SARS患者的咽漱液、咽拭子、尸解组织或尸解组织液分别接种到人胚肺细胞(HL)、狗肾细胞(MDCK)和人咽喉癌上皮细胞(Hep—2)，37℃、34℃二氧化碳培养箱培养。样本原液、细胞培养阳性的上清液分别接种9日龄鸡胚羊膜腔、尿囊腔各0．2ml，3d后分别收集尿液、羊膜液。用1％鸡红细胞、0．75％豚鼠红细胞、人“O”型红细胞和鹌鹑红细胞做血细胞凝集试验。病变细胞用0．2％豚鼠红细胞做红细胞吸附试验。制备的病毒抗原片用恢复期患者血清做免疫荧光抗体检测，尸解肺组织作电镜检测，分离的病原体用RT-PCR方法检测，用ELISA方法检测患者急性期、恢复期双份血清IgG抗体。结果 75份样本细胞分离到13株病原体，分离阳性率为17．3％。病原体在34℃环境中生长繁殖较37℃好，而且HL较Hep—2敏感，MDCK不敏感。病原体可使人“O”型红细胞和鹌鹑红细胞凝集，而不能使鸡红细胞和豚鼠．红细胞凝集。病变细胞用免疫荧光试验检测病人的血清，结果呈阳性。尸解肺组织电镜检查找到一种冠状病毒样颗粒。分离的病原体用RT-PCR方法检测可分别扩增出冠状病毒的特异基因片段。用ELISA方法检测患者恢复期血清IgG抗体阳性率为85．7％(48／56)。结论 近期在广州地区暴发的传染性非典型肺炎(SARS)的病原体为一种新型的冠状病毒。     

广东省传染性非典型肺炎病例的SARS冠状病毒分离株的分子生物学鉴定

目的 对广东省部分传染性非典型肺炎(SARS)病例的SARS冠状病毒分离株进行鉴定，并初步建立SARS冠状病毒PCR检测方法。方法 采集临床诊断为SARS病例的咽漱液标本，进行多种细胞分离培养，对出现病变的细胞分离物采用冠状病毒特异引物通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及巢式聚合酶链反应(Nested—PCR)进行扩增，并对部分扩增片段进行序列测定，应用DNASTAR软件分析比较oN时采用间接免疫荧光(IFA)和ELISA法检测上述患血清中SARS冠状病毒Igc抗体。结果 对21例SARS患的细胞分离物进行PCR扩增，结果均阳性，其中12份患咽漱液标本PCR扩增结果也阳性，序列测定及基因分析表明，广东省SARS病例的病毒分离株为冠状病毒，其基因序列与WHO公布的SARS基因序列一致，氨基酸序列与目前已知的冠状病毒同源性为58％～76％。时对21例患进行血清学检测，其中IFA检测有9例阳性，ELISA检测有12例阳性。结论 从广东省部分SARS病例标本中分离的病毒株是一种新的冠状病毒，PCR检测具有早期、快速的优点。     

江苏省传染性非典型肺炎病原学检测研究

目的:建立传染性非典型肺炎(SARS)实验室检测方法,为SARS病例诊断和现场防治提供依据。方法:用逆转录套式PCR、实时荧光定量PCR检测SARS病毒核酸;酶联免疫法检测血清标本SARS病毒IgM抗体;部分PCR检测阳性或SARS病毒IgM抗体阳性病例的标本进行直接电镜观察;简并引物PCR检测冠状病毒属病毒核酸;鉴别诊断IFA检测血清中肺炎支原体等9种常见呼吸道感染病原IgM抗体,PCR检测军团菌以及甲、乙型流感病毒核酸。结果:检测各类临床标本506份。2003年全省报告临床诊断病例7例,5例检测结果阳性;逆转录套式PCR检测各类标本132份,阳性8份;对其中4份PCR扩增产物(108bp)进行了序列分析,与SARS病毒序列100%同源;实时荧光定量PCR检测各类标本30份,阳性3份;酶联免疫法检测血清标本101份,SARS病毒IgM抗体阳性4份;3个诊断病例的各类标本电镜检查发现冠状病毒样颗粒;IFA检测血清标本75份,嗜肺军团菌IgM抗体阳性9份,乙型流感IgM抗体阳性11份,两者同时阳性3份,其他病原体IgM抗体均为阴性。不明发热病例的标本21份简并引物PCR检测冠状病毒,2份咽拭子标本阳性;漱口液、尿液标本各15份PCR检测军团菌、漱口液25份PCR检测甲、乙型流感病毒结果均为阴性。结论:本研究建立的检测方法与临床诊断有比较好的符合性,对于临床诊断和防治工作具有重要的参考价值。PCR检测SARS-CoV特异性较好,而敏感性有待提高。     

急性呼吸道疾病爆发流行的病原学研究

目的 对2004年4月起在江苏苏北及其邻近地区发生中、小学生爆发急性呼吸道疾病(ARD)流行的集中发热并伴有头痛、头晕、咽痛、扁桃体炎病例进行病因研究。方法 对流行区20位患者的咽拭子标本分离病原体，并对阳性分离株进行免疫荧光、聚合酶链反应(PCR)以及电镜检测。结果 MDCK(35代)、LLC-MK2、Vero E6、MRC-5(39代)分离培养均未出现细胞病变；军团菌培养亦未发现阳性结果；经人喉癌传代细胞(Hep-2)分离培养，20份标本中13份出现了明显的细胞病变效应，电镜下可见细胞胞核内大量呈晶格状排列的典型腺病毒颗粒，直接免疫荧光试验及PCR检测均证实为腺病毒感染。结论 2004年4月发生在江苏省苏北地区中、小学急性呼吸道感染疫情的病原体为腺病毒。     

SARS病例尸解标本和咽嗽液中病原体检测

目的 确定严重急性呼吸系统综合征(SARS)病例尸解肺组织和咽嗽液中病原体种类。方法 用超薄切片电镜技术观察广东省传染性非典型肺炎流行早期3例死亡病例尸解肺组织标本，用RT-PCR法扩增尸解肺组织和SARS病人咽嗽液中SARS冠状病毒特异核酸片段，并进行序列测定。结果 在死亡病人肺组织中观察到衣原体的网状体、中间体以及原体颗粒，并见衣原体包涵体样结构；用RT-PCR法在2例尸解肺组织扩增出预期大小的DNA片段，测序后经相似性(BLAST)比较，其与SARS冠状病毒相应基因片段高度同源；用巢式RT-PCR技术在SARS病人咽漱液中扩增出SARS冠状病毒特异基因片段。结论 在SARS尸解肺组织中发现衣原体样颗粒，在尸解肺组织和咽漱液中扩增出SARS冠状病毒核酸片段，说明SARS患者可合并衣原体等微生物混合感染。     

检测SARS冠状病毒的套式RT-PCR方法的建立与初步应用

[目的]建立套式RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法。[方法]从广东地区SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及本实验室分离的SARS冠状病毒（SAPS—CoV）组织培养上清中提取RNA，利用针对SARS冠状病毒多聚酶基因的特异性引物，进行逆转录及套式PCR扩增。扩增出的阳性片段连接入pGEM—T载体中，测序后比较其与其他已知SARS冠状病毒的同源性。[结果]从SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及SARS冠状病毒组织培养上清中均可扩增出阳性片段，经测序后证实是SARS冠状病毒特有序列。[结论]针对SARS冠状病毒多泵酶基因所建立的套式RT—PCR方法适用于临床标本及组织培养标本中SARS冠状病毒的检测。     

广西野生动物SARS冠状病毒的感染状况及其意义

目的查明广西境内野生动物SARS冠状病毒感染状况。方法对广西境内15种117只野生动物及99只人工养殖的果子狸采用聚合酶链反应和血清学方法检测其病毒核酸。结果15种野生动物中鸟类及爬行类动物血清的SARS冠状病毒抗体阳性率分别为22．2％和20．0％，哺乳类动物SARS冠状病毒抗体阳性率为0，人工养殖的果子狸咽拭子及肛拭子标本未检出SARS冠状病毒核酸。结论野生动物中鸟类及爬行类动物SARS冠状病毒感染率较高，可能是SARS冠状病毒的自然宿主或储存宿主。     

Vero-E6、MDCK、293细胞对SARS冠状病毒敏感性的研究

目的 研究Vero—E6、MDCK、293细胞对SARS冠状病毒的敏感性，为该病的病原学研究、诊断和疫苗制备奠定基础。方法 用Vero—E6、MDCK及293细胞对广东省部分SARS病人的咽拭子标本进行分离培养，并对分离物使用电镜、间接免疫荧光(IFA)及荧光定量聚合酶链反应(FQ—PCR)的方法分别检测细胞和(或)培养上清波中的病毒含量。结果 感染SARS病人的咽拭子标本后，Vero—E6细胞出现病变(CPE)最早，电镜中可观察到Vero—E6细胞中大量的病毒颗粒，IFA试验感染病毒的Vero—E6细胞与SAPS病人的恢复期血清呈强阳性反应，FQ—PCR结果显示Vero—E6感染细胞内的病毒含量10^8拷贝／ml，高于293细胞(10^6拷贝／ml)及：MDCK(104拷贝／ml)。结论 三种细胞对SARS相关病毒的敏感性不同，Vero—E6是SARS相关病毒最敏感的宿主细胞。     

荧光定量PCR检测传染性非典型肺炎冠状病毒的分析

目的 探讨荧光定量PCR在检测传染性非典型肺炎(SARS)冠状病毒(SARS—CoV)中的应用。方法 对2003年1～4月广州市各大医院送检的临床确诊或疑似的SARS病例以及密切接触的咽漱液和咽拭子进行荧光定量PCR检测。结果 从57份确诊患标本中检出SARS-CoV阳性38份，检出率为66．7％。14份密切接触标本中检出阳性7份。59份疑似患标本中检出阳性12份。SARS发病10～12d时SARS—CoV检出率最高，达87．5％。结论 荧光定量PCR能早期、快速检出SARS—CoV，临床符合率达66．7％，采样时间在发病1～12d最佳。     

SARS患者某定点收治医院空气样本中SARS-CoV及其RNA的检测

目的 了解SARS某定点收治医院空气中的SARS病毒污染情况及SARS病毒在空气中的分布和传播特性。方法 采用FA-2型空气微生物采样器在病房区及病房阳台连续采样。将采集到的空气样本洗脱后分别采用细胞分离和逆转录-聚合酶链反应分析,并对细胞分离阳性者作进一步的系列分析鉴定。结果 SARS患者某定点收治医院病房区及阳台空气样本中均有部分PCR结果阳性,SARS阳性率病房区为29％,阳台为20％;其中一份样品中分离出活性病原体,并稳定传代;经免疫荧光染色鉴定阳性,RT-PCR扩增产物的测序结果显示该病原体与已知SARS-CoV的同源性在98％以上。结论 SARS急性期后期与恢复期早期的患者仍然从呼吸道排毒,病毒在距传染源周围1m之内的空气中具有感染活性,在此范围之内存在气溶胶传播的潜在威胁。     

同时使用三种细胞对急性弛缓性麻痹病例病原学监测结果的影响探讨

山西省卫生防疫站脊髓灰质炎(脊灰)实验室从1998年7月正式使用L20B细胞,并同时使用RD和Hep-2细胞进行急性弛缓性麻痹(AFP)病例病原学监测,为了解同时使用3种细胞对AFP病例病原学监测结果的影响,将308例AFP病例粪便标本在3种细胞上的分离状况进行比较分析.同时使用3种细胞共分离到脊灰病毒(PV)20份,其中RD细胞分离到14份,L20B细胞16份,Hep-2细胞8份,总分离率为6.5%.分离到非脊灰肠道病毒(NPEV)65株,其中RD细胞30株,Hep-2细胞48株,分离率为21.1%.结果显示,同时使用3种细胞对提高PV检测灵敏度和NPEV分离率,保证脊灰实验室监测质量有重要意义.     

用L-hCAR细胞选择性地分离柯萨奇B组病毒

为研究L -hCAR细胞对柯萨奇B组病毒 (CoxsackievirustypeB ,Cox B)的敏感性和特异性 ,以及用L -hCAR细胞从粪便标本中分离Cox B的情况 ,将 43个肠道病毒标准株同时接种于Hep -2和L -hCAR细胞 ,在L -hCAR细胞上只有Cox B增殖。分别用Hep -2及L -hCAR细胞对Cox B 1～ 6型标准株进行滴定 ,两种细胞上的病毒滴度无显著性差异。在病毒分离试验中 ,用 94个已知为非脊髓灰质炎肠道病毒的粪便标本分别接种于Hep -2和L -hCAR细胞 ,在 14天的观察期间内 ,共有8份粪便标本在L -hCAR细胞上产生细胞病变效应。经鉴定 ,8份均为Cox B。结果表明L -hCAR细胞对Cox B敏感且特异 ,能用L -hCAR细胞选择性地从粪便标本中分离Cox B     

无菌性脑膜炎患者肠道病毒感染鉴定方法

目的建立一种快速、准确的鉴定无菌性脑膜炎患者肠道病毒感染的方法。并与传统的细胞培养及血清分型相比较。方法对78例无菌性脑膜炎患儿脑脊液中肠道病毒,用人宫颈癌细胞(HeLa)、横纹肌细胞(RD)和人喉癌细胞(Hep-2)细胞进行分离培养血清分型,同时用根据肠道病毒5’UTR区基因序列设计引物,用PCRT-R法扩增病毒的基因。结果该方法可检测的灵敏度的组织培养感染量(TCID50)为0.1;78例脑脊液(CSF)中46例肠道病毒培养为阳性,而用RT-PCR法检测52例阳性。结论该方法与细胞培养及肠道病毒血清分型法相比较具有较高的灵敏度和特异性,可快速、灵敏地检测脑脊液中的肠道病毒。     

Vero/Slam细胞在麻疹病毒分离中的应用

目的评价Vero/Slam细胞对麻疹病毒的敏感性,以及麻疹病毒在Vero/Slam细胞上的生长特点。方法组织细胞培养法分离病毒,将标本接种到长满单层的Vero/Slam细胞上,盲传3代,观察细胞病变(CPE)。将分离到的麻疹病毒通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增出核蛋白(N)基因碳末端450个核苷酸片段,对其产物测定基因序列以定型。结果Vero/Slam细胞对麻疹病毒高度敏感,其CPE特点是典型的细胞融合性病变。此次分离到的麻疹病毒为H1基因型,和中国的本土优势流行株相符。结论Vero/Slam细胞对麻疹病毒敏感,可在麻疹病毒分离中选用。     

手足口病患儿EV71的检测及分离鉴定

目的了解手足口病患儿感染EV71的情况,为科学防治疾病提供依据。方法采集手足口病患儿的咽拭子标本,接种于RD细胞,出现致细胞病变效应(CPE),运用RT-PCR方法,EV71引物检测样本和细胞培养物上清。结果标本直接用RT-PCR扩增,阳性率为30%(6/20),细胞培养后出现CPE的阳性率为45%(9/20),培养后经RT-PCR扩增阳性率为70%(14/20)。结论病毒分离和RT-PCR方法联合应用可以提高肠道病毒EV71的检出率,RT-PCR方法可以满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。     

改良分子信标-双重实时荧光PCR快速检测SARS病毒

目的建立改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒的方法,用于SARS的早期诊断和动物溯源。方法利用改良分子信标技术、装甲RNA和双片段双色荧光技术,根据GenBank公布的SARS病毒聚合酶基因1b的阅读开放框架结构的保守序列,自行设计一对引物和探针,以部分临床标本的酶联吸附实验结果和传统细胞培养方法作为对照,建立分子信标检测SARS病毒的方法。对368份临床标本(咽漱液、血液、粪便、尿液)、52份细胞培养液和50份动物标本进行荧光PCR扩增。结果分子信标检测SARS病毒的方法灵敏度为10～100个拷贝ml,与流感病毒等呼吸道病毒无交叉反应。分子信标检测368份临床标本,20份阳性。其中确诊病例阳性率为21.27%(1047),确诊病例的咽漱液阳性率为43.48%,还分别从粪便和血清中检测到SARS病毒。52份细胞培养液,29份阳性,阳性率为55.77%。50份动物标本,23份阳性,阳性率为46%。结论改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒方法灵敏度高、特异性强,可用于SARS的临床早期诊断和动物溯源。     

3种细胞共培养分离单纯疱疹病毒及培养物快速鉴定方法的建立

目的 建立狗肾细胞(MDCK)、人喉癌表皮细胞(Hep-2)和非洲绿猴肾细胞(Vero)共培养(下简称MHV细胞)分离单纯疱疹病毒(HSV)并用荧光PCR的CT值梯度参考曲线鉴定培养物的方法。方法 选取1株某实验室保存的单纯疱疹病毒分离株,用培养液以5倍梯度倍比稀释成多个模拟样品。用此样品同时接种MHV细胞和Vero细胞,每个样品各接种5瓶,并设空白对照和无细胞对照。经37℃、8％CO2培养后, 每隔12 h记录上述各组的细胞病变效应(CPE),培养在84 h后终止,所有培养物同批提取核酸,并用荧光PCR检测RNA。所有核酸同机检测,并记录CT值,无细胞对照组的CT值用软件制成梯度参考曲线,其余各组与梯度参考曲线对比。结果 MHV细胞和Vero细胞培养模拟样品后,均出现典型细胞病变,Vero细胞出现更晚,MHV组CT值低于Vero组和无细胞对照组（P＜0.05）,MHV组的CT值曲线位于梯度参考曲线的下方。结论 HSV病毒可以在MHV细胞内有效增殖,同一样品的CT值梯度参考曲线可用来客观评价该样品中病毒在细胞内的增殖。