HoxA13基因在尿道下裂胎鼠阴茎中的表达及意义

目的研究尿道下裂胎鼠阴茎中HoxA13核酸及其蛋白的表达,探讨其与尿道下裂发生的相关性。方法选用清洁级C57BL／6小鼠,用邻苯二甲酸二（2-乙基）己脂（DEHP）诱导并建立先天性尿道下裂模型;交配怀孕后,孕鼠随机分为玉米油对照组、实验组（DEHP500mg·kg^-1·d^-1）;各组持续灌胃;于怀孕第19天取出仔鼠,测量各组雄鼠体重、AGD;统计各组胎鼠尿道下裂的发生率,并观测阴茎的组织病理学变化;应用常规RT-PCR及免疫组织化学方法检测诱导出的尿道下裂胎鼠及正常对照胎鼠阴茎组织中HoxA13的mRNA及蛋白表达水平。结果对照组、实验组的AGD值分别为（0．208±0．01）cm、（0．181±0．12）cm,P〈0．01;尿道下裂发生率分别为0％、75．7％,P〈0．01。实验组胎鼠尿道板及包皮于阴茎腹侧隆起融合落后,该组尿道与腹侧皮肤间的皮下组织明显减少。DEHP500mg·kg^-1·d^-1诱导的尿道下裂胎鼠阴茎组织中HoxA13mRNA及蛋白表达较对照组明显降低。结论DEHP能影响胎鼠的生长发育及体重,并导致雄鼠外生殖器发育异常;HoxA13mRNA及蛋白的表达在DEHP诱导的尿道下裂胎鼠阴茎中均较正常对照组降低,提示HoxAl3基因异常表达可能是尿道下裂的发生机制之一。     

维生素E拮抗邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯尿道发育毒性的实验研究

目的 探寻维生素E(Vitamin E,VitE)对邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[Di(2-ethylhexy1)phthlate,DEHP]所致大鼠尿道发育毒性的拮抗作用及其可能机制.方法 GD12(gestation day12)SD孕鼠随机分为4组,每组20只:玉米油对照组、DEHP组(500 mg·kg-1·d-1)、DEHP(500mg·kg-1·d-1)+VitE(200mg·kg-1·d-1)组和VitE组(200mg·kg-1·d-1).各组分别于母鼠孕期12～19d(GD12～19)持续经口灌注给药.各组分别留取10只孕鼠让其正常分娩,出生第一天,即对新生大鼠计数,并在解剖显微镜下测量雄性新生鼠的肛门生殖器距离(anal genital distance,AGD)并称体重;雄性仔鼠70日龄时逐个检查尿道下裂的发生情况.余孕鼠在GD19d行破宫产取仔代鼠,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测胎鼠阴茎TGF-β1,TGF-βR3 mRNA的表达水平.DNA末端原位标记染色法(TUNEL法)检测胎鼠阴茎尿道上皮细胞凋亡情况.结果 各组TGF-β1mRNA表达水平分别为:正常组为0.63±0.07、DEHP组为0.96±0.12、DEHP+VitE组为0.65±0.07、VitE组为0.62±0.06,DEHP组表达明显较其他各组增高(P＜0.05).各组TGF-βR3mRNA表达水平分别为:正常组为0.47±0.10、DEHP组为0.75±0.10、DEHP+VitE组为0.49±0.09、VitE组为0.46±0.09,DEHP组表达明显较其他各组增高(P＜0.05).各组胎鼠阴茎凋亡指数分别为:正常组为(30±2.0)%、DEHP组为(8.8土1.1)%、DEHP+VitE组为(28.9±1.6)%、VitE组为(29.6±2.0)%,DEHP组凋亡细胞数较其他各组相比明显减少,差异有统计学意义(P＜0.01).导致大鼠尿道下裂的发生.VitE可降低DEHP上调的胎鼠阴茎TGF-β1,TGF-βR3 mRNA表达水平,恢复胎鼠阴茎尿道上皮细胞的凋亡水平.结论 VitE对DEHP所致尿道发育毒性具有拮抗作用,其机制可能与调控TGF-βs及胎鼠阴茎尿道上皮细胞的凋亡有关.

Abstract：

Objective To study the therapeutic effects of Vitamin E (VitE) on urethral development toxicity induced by di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP). Methods From gestational day 12 to gestational day 19 (GD 12-19) , the timed-pregnant Sprague-Dawley (SD) rats were fed with the eiwith 20 in each group: DEHP group, DEHP + VitE group, and VitE group. The control rats were fed with corn oil. Ten pregnant rats of each group delivered full-term infant rats. The male infant rats were counted, and the anal genital distance (AGD) and body weight were measured. Hypospadias morbidity was also counted on male rats after 17 postnatal days. In the rest 10 pregnant rats of each group, fetuses were harvested on GD19. Semi-quantitive RT-PCR was used to measure mRNA expression of TGF-β1 and TGF-βR3. TUNEL staining was used to measure cell apoptosis in the fetus' genital tubercles. Results Hypospsdias was observed in male rat after 17 postnatal days. The TGF-β1 mRNA of the control group, DEHP group, DEHP + VitE group, and VitE group is 0. 63 ± 0. 07,0. 96±0. 12, 0. 65 ±0. 07, and 0. 62± 0. 06, respectively. The TGF-βR3 mRNA of the control group,DEHP group, DEHP + VitE group, and VitE group was 0. 47 ± 0. 10, 0. 75 ± 0. 10, 0. 49 ± 0. 09,and 0. 46 ± 0. 09, respectively. The TGF-β1 mRNA and TGF-βR3 mRNA was up-regulated in the fetus of DEHP group (P＜0. 05). Cell apoptosis rate in fetus' genital tubercles on GD19 of the control group, DEHP group, DEHP + VitE, and VitE group was 30% ± 2. 0%, 8. 8% ± 1.1%, 28. 9% ±1.6%, and 29. 6% ± 2. 0%, respectively. Cell apoptosis rate was significantly reduced in the fetus of DEHP group (P＜0. 01). In the GD19 fetus treated with VitE, hypospadias morbidity, the TGF-β1 and TGF-βR3 mRNA expressions were significantly decreased. And cell apoptosis rate was significantly increased. Conclusions Vitamin E ameliorates the urethral development toxicity induced by DEHP via regulating TGFβs expression and cell apoptosis in rat fetus.     

Smad7,Smad3和Smad2在DEHP诱导的尿道下裂大鼠阴茎中的表达

目的研究Smads(7,3和2)在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate,(DEHP)]诱导的尿道下裂大鼠阴茎组织中的表达变化,探讨尿道下裂发生机制。方法将SD孕鼠随机分为2组:实验组(将DEHP溶于1.5 mL大豆油中灌胃大鼠)和对照组(以1.5 mL大豆油灌胃大鼠),每组20只,自孕12 d(gestation day,GD12)至19 d(GD19)连续每天定时给药1次。至GD20行剖宫产取出雄性胎鼠,切取阴茎组织,采用实时定量PCR和免疫组化法分别检测胎鼠阴茎中Smad7,Smad3和Smad2三者mRNA和蛋白质表达水平。结果经qP CR检测分析后发现,Samd7,Smad3和Smad2三者mRNA在正常对照组相对于内参GAPDH的表达分别是1.00,0.84和1.14,在DEHP暴露组其相对表达分别是1.87,1.36和1.49,且三者在实验组的表达与正常对照组比较,均升高(P值分别为0.001,0.041和0.021);观察实验组Smad7和p-Smad2/3蛋白表达水平亦有增加趋势。结论DEHP诱导的先天性尿道下裂可能与胎鼠阴茎组织中Smads(7,3和2)的过度表达有关。     

TGF-β1、TGF-βr Ⅲ在邻苯二甲酸二丁酯诱导尿道下裂新生雄性仔鼠生殖结节中的表达及意义

目的 通过验证大鼠孕期污染邻苯二甲酸二丁酯(DBP)所致尿道下裂雄性仔鼠生殖结节中TGF-β1、TGF-βr Ⅲ的表达异常,探讨其在DBP生殖毒性过程中的作用机制.方法 孕鼠20只,随机分二组,在怀孕(GD)14～18 d期间,每天分别灌胃给予大豆油、DBP750 mg/kg,出生第一天(PND1),统计仔鼠出生数,尿道下裂发生率.PND7,雄性仔鼠称重,测量雄性仔鼠肛门至生殖器距离(AGD),拍摄尿道下裂大体图片,取尿道下裂生殖结节进行病理学切片检查,用实时定量逆转录聚合酶链反应(Real-time quantitative PCR)方法 检测生殖结节中的TGF-β1、TGF-βr Ⅲ的mRNA表达水平.结果DBP染毒后导致新生仔鼠与正常组相比数量明显减少,雄性仔鼠尿道下裂的发生率为:43.75%.PND7时,雄性仔鼠体重明显下降,AGD明显缩短.大体图片和病理切片显示典型尿道下裂改变.同时与对照组相比,DBP导致尿道下裂雄性仔鼠生殖结节中TGF-β1、TGF-βr Ⅲ的tuRNA表达水平明显下降.结论 DBP对母体有着明显的毒性作用,DBP干预了TGF-β1、TGF-βr Ⅲ基因的表达,导致子代的生殖结节发育异常,引起尿道下裂.     

宫内抗雄性物质暴露对胎鼠及新生大鼠阴茎组织p53和细胞周期调节基因表达的影响

目的 观察宫内抗雄性物质暴露对胎鼠及新生大鼠阴茎组织p53和细胞周期调节基因(p21waf/cip1)表达的影响,探讨其与尿道下裂发病机制之间的关系.方法 将定期受孕的SD大鼠随机分为9 g·L-1盐水组(对照组)和氟他胺(Flu)组,于孕12～16 d分别腹部皮下注射Flu及9 g·L-1盐水100 mg·kg-1·d-1,2组动物均于胚胎19 d(GD19)及出生1 d(PND1)、4 d(PND4)、7 d(PND7)各随机取8只,应用反转录.PCR技术检测各组阴茎组织p53和p21waf/cip1基因的表达.结果 1.p53基因的表达:对照组在GD19～PND1随鼠龄增加,表达逐渐减弱,至PND1表达最弱,以后随鼠龄增加逐渐增强.Flu组在GD19～PND1随鼠龄增加逐渐增强,至PND1最强,以后随鼠龄增加而逐渐减弱,且Flu组在GD19和PND1表达均高于对照组(Pa<0.05).2.p21waf/cip1 mRNA的表达:对照组在GD19～PND1随鼠龄增加而增强,至PND1表达最强,以后随鼠龄增加逐渐减弱.而Flu组GD19～PND7随鼠龄增加呈逐渐减弱的趋势,且在GD19和PND4与对照组相比,差异均有统计学意义(Pa<0.05).结论 宫内抗雄性物质暴露可能通过上调p53基因表达,抑制胎鼠及新生大鼠阴茎组织细胞增殖,进而导致其尿道下裂发生.     

己烯雌酚建立尿道下裂大鼠模型的实验研究

目的　尝试用己烯雌酚 (DES)建立尿道下裂大鼠模型。方法　孕鼠 2 0只 ,随机分成 2组 :生理盐水对照组 (CG) 10只 ,DES组 10只。在大鼠怀孕 12～ 17d期间 ,每组每天分别给予管喂生理盐水 1.5ml/d ,DES 10 0 μg·kg-·d-1。待孕大鼠分娩完毕 ,即对新生大鼠计数并在放大镜及解剖显微镜下观察雄性新生鼠的阴茎包皮外观、尿道口位置、排尿情况 ,测量肛生殖距离 (AGD)和称体重。结果　①DES成功诱导出了雄性大鼠尿道下裂畸形 ,对照组大鼠的生殖器未见异常改变 ;②DES组新生大鼠的AGD缩短 ,但无统计学差异 ,DES组体重明显减轻 ,有显著统计学差异。结论　①成功建立的尿道下裂大鼠模型 ,较国外尿道下裂小鼠更直观 ,更规范 ;②尿道下裂大鼠模型可以为研究尿道下裂病因学和防治措施提供基础。     

有机磷农药-敌敌畏诱导建立大鼠尿道下裂模型的实验研究

目的尝试用有机磷农药-敌敌畏建立尿道下裂大鼠模型,敌敌畏与尿道下裂发生的关系。方法40只孕鼠,分成3组:生理盐水对照组(CG)10只;敌敌畏高剂量组10只;敌敌畏低剂量组20只。在大鼠怀孕12~17d期间,每组每天分别给予管喂生理盐水1.5~2ml/d,敌敌畏20mg.kg-1.d-1,敌敌畏10mg.kg-1.d-1。待孕大鼠分娩完毕,即对新生大鼠点数并在普通放大镜及解剖显微镜下观察雄性新生鼠的阴茎包皮外观、尿道口位置、称体重和测量肛生殖距离(AGD)。结果敌敌畏高、低剂量组均诱导出了大鼠尿道下裂,两组间发生率无统计学差异(P>0.05),对照组大鼠的生殖器未见异常改变;各组新生大鼠的AGD、体重比较有统计学差异(P<0.05)。敌敌畏可使新生大鼠的AGD明显缩短,体重明显减轻,并显示与敌敌畏有剂量依赖关系。结论①用有机磷农药-敌敌畏成功建立的尿道下裂大鼠模型可为研究尿道下裂病因学和预防干预措施提供进一步研究的基础;②首次采用有机磷类农药诱导出大鼠尿道下裂畸形,同时有缩短AGD和减轻新生大鼠体重的作用,从实验动物学角度支持了流行病学的研究发现,有机磷农药可能作为一种环境内分泌干扰物质,是尿道下裂发病率增加的原因之一。     

黄褐毛忍冬总皂苷对卵清蛋白致敏小鼠肠道炎症因子和抗炎因子的影响

目的 观察黄褐毛忍冬总皂苷(Ful)对卵清蛋白(OVA)致敏小鼠肠道炎症因子和抗炎因子的影响.方法 24只雌性BALB/c小鼠随机取16只,采用卵清蛋白致敏和激发构建食物过敏模型,均分为2组,即食物过敏组(FA组)和Ful干预组(Ful组).Ful组小鼠自造模第20天起每日皮下注射Ful 200 mg/kg,共22 d.另8只小鼠作为正常对照组(NS组).采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测小鼠空肠组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素17A(IL-17A)、叉头蛋白3-T细胞转录因子(Foxp3)mRNA表达;免疫组织化学法检测小鼠空肠组织中TGF-β1、IL-6、IL-17A蛋白表达;检测空肠中髓过氧化物酶(MPO)活性代表中性粒细胞活化水平.结果 FA组小鼠空肠组织中TGF-β1、IL-6、IL-17A的mRNA[(0.370±0.013)、(0.475±0.015)]和TGF-β1、IL-6、IL-17A蛋白表达水平[(53 075.70±20 727.06)、(256 881.66±36 561.79)、(435 064.25±69 911.48)]均增高,Foxp3 mRNA(0.231±0.014).经黄褐毛忍冬总皂苷干预后,小鼠空肠组织TGF-β1表达未下降,但IL-6、IL-17A的mRNA[(0.196±0.005)、(0.204±0.008)]和蛋白表达水平[(114 040.30±20 295.25)、(218 200.74±30 077.69)]均明显降低,而Foxp3 mRNA(0.578±0.021)表达明显增高.空肠组织中MPO水平各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)..结论 食物过敏发生时肠道内存在以IL-6、IL-17A表达增高为主的炎症反应.Ful可有效降低OVA致敏小鼠肠道炎症因子IL-6、IL-17A的过度表达,显著增强调节性T细胞特异性转录因子Foxp3的表达,从改善OVA诱导的肠道炎症.     

维甲酸诱导大鼠脊髓脊膜膨出动物模型的建立及相关蛋白表达的研究

目的 探索利用全反式维甲酸(ATRA)诱导大鼠胎鼠脊髓脊膜膨出(MMC)建立神经源性膀胱(NBD)的大鼠动物模型,并观察相关病理表现及蛋白表达.方法 探索在不同给药时间及不同ATRA剂量下,大鼠胎鼠MMC的发生情况,得到最佳诱导致畸时间及ATRA剂量,建立动物模型;所得胎鼠分为MMC组(胎鼠出现MMC,不合并其他严重畸形)、RA组(胎鼠外观正常,无明显畸形)、OIL组(母鼠同期灌胃2ml橄榄油,得到正常胎鼠).观察该模型胎鼠相关组织的病理表现,并通过免疫组化方法测定脊髓组织GFAP、膀胱组织α-SMA、膀胱tubulin-β-Ⅲ和nNOS表达情况.结果 在母鼠孕10d(E10)以120 mg/kg的剂量灌胃ATRA能获得最佳建模效果;MMC组胎鼠脊髓组织病理表现存在异常,膀胱组织病理表现基本正常;MMC组胎鼠脊髓组织GFAP蛋白表达(5.5±1.6)×1 04,较RA组的(2.5±2.0)×104增加,膀胱组织α-SMA蛋白无明显差异,MMC组膀胱组织tubulin-β-Ⅲ和nNOS蛋白表达分别为(22.4±2.7)×104、(16.1±4.1)×104,较RA组的(28.4±8.3)×104、(25.6±7.1)×104减少.结论 ATRA能诱导大鼠胎鼠产生MMC,得到MMC相关NBD动物模型;其MMC胎鼠具有典型的脊髓损伤表现,尽管膀胱肌层发育正常但存在明显的神经分布异常.     

邻苯二甲酸二丁酯影响类固醇激素合成急性调节蛋白致雄性胎鼠尿道下裂的机制研究CSCD

目的 研究类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）的表达和活性及睾酮在尿道下裂胎鼠体内发生的改变,探讨邻苯二甲酸二丁酯（DBP）诱导雄性胎鼠发生尿道下裂的机制。方法 将40只孕SD大鼠,用随机数表法分为DBP组和对照组（各20只）。于孕13～19 d上午9点给药,DBP组按照800 mg/kg体重DBP混合玉米油（DBP和玉米油总量为3 ml/kg体重）灌胃,对照组按3 ml/kg体重玉米油灌胃。第19天中午12时麻醉孕鼠后取出胎鼠,观察内外生殖器鉴别出DBP组发生尿道下裂的雄性胎鼠及对照组中的雄性胎鼠。从DBP组中发生尿道下裂的雄性胎鼠中选取40只做为尿道下裂组,再从对照组的雄性胎鼠中选取40只做为正常对照组,拍摄尿道下裂图片,测量肛门生殖结节距离,统计尿道下裂发生率,取各组胎鼠生殖结节进行HE染色。各组胎鼠断头取血用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测睾酮水平并取出各组睾丸采用定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot、免疫荧光、ELISA检测StAR mRNA及StAR的表达,对StAR相对表达量和睾酮含量进行Pearson相关性分析。Western blot检测磷酸化ERK1/2蛋白（P-ERK1/2）,总ERK1/2蛋白（T-ERK1/2）的表达,并通过两者间的比值分析睾丸中ERK1/2蛋白的磷酸化水平以明确StAR蛋白的活性高低。结果 尿道下裂组胎鼠的尿道开口于生殖结节腹侧,对照组的开口于生殖结节顶端。尿道下裂组肛门生殖结节距离（1.77±0.12） mm明显小于对照组（2.25±0.15） mm,组间比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。DBP组胎鼠尿道下裂发生率为43.3%（46/106）。尿道下裂组睾酮含量（1.45±0.62） ng/ml低于对照组（4.48±0.93） ng/ml,组间比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。尿道下裂组的StAR mRNA、StAR相对表达量及P-ERK1/T-ERK1、P-ERK2/T-ERK2分别为0.23±0.08、0.33±0.07、0.17±0.03和0.19±0.07,对照组的分别为1.00±0.00、1.44±0.19、0.31±0.08和0.43±0.14,组间差异有统计学意义（P〈0.05）。免疫荧光显示睾丸间质细胞中尿道下裂组StAR蛋白的表达少于对照组。尿道下裂组和对照组的Pearson相关系数分别为0.642和0.851（P均〈0.05）。结论 DBP不仅在转录和翻译层面降低StAR的表达,可能还通过降低ERK1/2蛋白的磷酸化水平减弱StAR蛋白的活性使睾丸中睾酮合成障碍,进而影响了雄性胎鼠生殖器的发育。     

地塞米松对大鼠胎肺形态结构及Wnt信号转导途径的影响

目的 比较产前给予不同剂量地塞米松对大鼠胎肺形态结构及Wnt信号转导途径的影响.方法 孕鼠12只,于孕16、17、18 d,连续3 d给孕鼠腹腔注射药物,随机分为3组,每组4只.地塞米松小剂量组：地塞米松0.4 mg/(kg·d),地塞米松大剂量组：地塞米松0.8 mg/(kg·d),均用生理盐水稀释至0.5ml;对照组：生理盐水0.5 ml/d;取孕19 d胎鼠肺组织,HE染色观察肺病理学改变;RT-PCR、Western-Blot方法检测Wnt信号转导途径中Wnt7b、GSK-3β、β-catenin基因mRNA和蛋白表达.结果 (1)肺脏病理学改变：HE染色可见：地塞米松小剂量组肺泡数目为(15.6±2.1)个;大剂量组(13.2±1.6)个,对照组(20.8±2.0)个;肺泡间隔厚度：地塞米松小剂量组(11±5)μm;大剂量组(11±4)μm;对照组(13±7)μm;肺泡腔结构：地塞米松小剂量组(2483 ±1336)μm2;大剂量组(2924 ±1705)μm2;对照组(1913±764)μm2;以上各指标地塞米松组与对照组差异均有统计学意义(P均＜0.01),地塞米松大剂量组较小剂量组肺泡数目明显减少(P＜0.01).(2)地塞米松组胎肺Wnt7b及β-catenin基因mRNA的表达量均高于对照组,GSK-3β表达量低于对照组(1.1±0.6)(P均＜0.05);地塞米松组胞浆GSK-3β蛋白表达量低于对照组,大剂量组低于小剂量组;地塞米松小剂量组胞浆β-catenin的表达高于对照组,大剂量组低于对照组;胞核β-catenin蛋白表达量高于对照组.结论 产前使用地塞米松,肺泡数目减少,肺泡腔结构变大,肺泡间隔厚度变薄,周围结缔组织减少,影响胎肺形态发育;Wnt7b、β-catenin和GSK-3β基因表达异常;胎肺形态发育异常可能是通过地塞米松所致的Wnt信号转导途径障碍而发生.     

福辛普利对肾小球系膜细胞 TGF-β1/Smad 信号通路的干预作用

目的观察新型血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)--福辛普利(fosinopril,FOS)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)Ⅰ型胶原(ColⅠ)蛋白分泌和Smad2、Smad7mRNA表达量的影响。方法建立体外培养的大鼠GMC,鉴定后3～10代用于实验。实验分为正常对照组、TGF-β1刺激组(加5ng/L TGF-β1和5%的胎牛血清)和FOS组(加5ng/L TGF-β1、10μmol/L FOS和5%的胎牛血清)3组,分别于6、24和48h后ELISA法测定细胞培养上清液中ColⅠ蛋白表达量,荧光定量PCR法检测Smad2、Smad7 mRNA表达量的变化。结果①正常培养的大鼠GMC均有一定量的ColⅠ蛋白表达;TGF-β1刺激组在各时间点ColⅠ蛋白分泌均高于对照组(P<0.01),FOS各组ColⅠ蛋白分泌均低于TGF-β1刺激组(P<0.05)。②正常培养的大鼠GMC可表达一定量Smad2、Smad7 mRNA,TGF-β1刺激组在各时间点Smad2、Smad7 mRNA表达量均高于对照组,FOS治疗组Smad2 mRNA表达量均低于TGF-β1刺激组;Smad7 ...     

神经管缺损大鼠转化生长因子-β2及其受体的表达

目的建立大鼠脊柱裂动物模型，探讨神经管缺损的产生和转化生长因子-β2（TGF-β2）及其受体（TGFβRI、TGFβRⅡ）的关系。方法维甲酸灌胃建立Wistar大鼠脊柱裂动物模型，用RT-PCR方法检测各组胎鼠脊髓和脑中TGF-β2、TGFβRI及TGFβRⅡ的mRNA表达水平，用免疫组织化学方法检测各组胎鼠脊髓和脑中TGF-β2、TGFβRI以及TGFβRⅡ的蛋白表达水平。结果维甲酸组胎鼠体重明显低于对照组，脊柱裂的发生率为73．1％。脊柱裂胎鼠脊髓组织中TGF-β2的mRNA及蛋白表达水平与对照组相比显著降低，TGFβRI和TGFβRⅡ的mRNA及蛋白水平与对照组相比显著升高。脊柱裂胎鼠脑组织中TGF-β2、TGFβRI和TGFβRII的mRAN及蛋白表达水平与对照组相比无显著差异。结论TGF-β2在神经管的发育中起重要作用，TGF-β2表达的降低与神经管缺损的发生有关。受体TGFβRI及TGFβRⅡ的表达水平可能是反应性的增加，TGF-β2通过它们对神经管的发育起作用。     

邻苯二甲酸二(2-乙己基)酯导致隐睾症发生跨代遗传的机制研究

目的 探讨增塑剂邻苯二甲酸二(2-乙己基)酯(DEHP)于性腺发育的关键时期作用于孕鼠(0),研究F1-F3代隐睾跨代遗传的演变情况及各代睾丸基因组DNA甲基化转移酶水平的改变情况.方法 妊娠SD大鼠随机分为两组:正常对照组和DEHP实验组,实验组自妊娠第七天(GD7)到第十九天(GD19)持续经口予以DEHP 750 mg·kg-1 ·d-1灌胃,观察子代隐睾发生情况,雌鼠受孕率;记录大鼠体重和睾丸、附睾重量以及AGD值,观察精子数量和质量;观察连续三代大鼠睾丸组织形态的演变情况,检测DNA甲基化转移酶变化情况.结果 孕鼠在孕期(GD7-GD19)暴露于DEHP,第一代(F1)隐睾发生率为30％,第二代(F2)隐睾发生率为12.5％,第三代(F3)未见隐睾发生;交配实验F1代受孕率50％,F2代75％,F3代100％;HE染色发现F1代睾丸生精上皮明显萎缩,生精细胞少,F2代有所改善,F3代形态趋于正常.Real Time-PCR、免疫组化和Western Blot表明DNA甲基化转移酶的表达随着遗传代数的增加而上调,差异有统计学意义.结论 DEHP损伤大鼠雄性生殖功能,通过改变DNA甲基化转移酶的表达,继而导致基因组印记甲基化修饰模式改变并遗传给下一代,从而使子代雄性生殖系统发育的关键性印记基因作用失衡,并最终导致子代产生隐睾,可能是导致生殖系统损害的重要毒理机制之一.     

转化生长因子-β1及结缔组织生长因子在病毒性心肌炎小鼠中的表达及缬沙坦的干预作用

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)及结缔组织生长因子(CTGF)在病毒性心肌炎(VM)小鼠中的表达及缬沙坦的干预作用.方法 雄性Balb/c小鼠54只随机分为对照组、模型组和治疗组.模型组和治疗组小鼠腹腔注射CVB3悬液0.1 mL建立VM模型,治疗组从接种病毒日起口饲含缬沙坦10 ms/(kg·d)的饮水.分别于第7、14、28天每组随机抽取6只小鼠断颈处死.对其心脏称重后采用40 g/L多聚甲醛固定,HE染色后光镜下观察其心肌组织形态学改变,半定量计算其病理积分.免疫组织化学法检测其心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达,并应用病理图像分析仪进行图像分析,分别计算Ⅰ型、Ⅲ型胶原面积.大鼠心肌组织CTGF、TGF-β1水平采用免疫组织化学法测定.结果 与对照组比较,模型组病理积分,心肌Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达,心肌组织CTGF、TGF-β1表达水平均显著升高(Pa<0.05).治疗组病理积分,心肌Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达、心肌组织中CTGF、TGFβ1表达水平均较模型组显著降低(Pa<0.05).相关分析显示,心肌Ⅲ型胶原蛋白表达与CTGF、TGF-β1水平呈正相关,TGF-β1与CTGF表达亦呈正相关.结论 TGF-β1及CTGF协同参与了VM小鼠心肌纤维化的发生、发展过程.缬沙坦可延缓心肌纤维化的发生发展,其与降低VM小鼠的CTGF、TGF-β1的表达有关.     

circ0006577在TGF-β1诱导的HK-2细胞和新生小鼠单侧输尿管梗阻中的表达

目的探讨circ₀006577在TGF-β1诱导的HK-2细胞和新生小鼠单侧输尿管梗阻中的表达和影响, 并利用生物信息学方法预测其潜在的功能。方法使用重组蛋白TGF-β1(终质量浓度为10 ng/ml)诱导HK-2细胞作为肾纤维化细胞模型, 将细胞分为对照组、TGF-β1诱导48 h、96 h及144 h后的实验组四组, 采用qRT-PCR检测各组细胞中circ₀006577的表达水平。使用新生小鼠单侧输尿管梗阻作为先天性肾积水模型, 将动物分为SHAM组和UUO组两组, 每组各3只, 分别于术后第5天和第14天取左侧肾脏。采用qRT-PCR检测小鼠肾脏中circ₀006577的表达水平, 蛋白质印迹法检测E-cadherin、α-SMA、BCL-2、BAX的表达, HE染色和MASSON染色分别用于观察组织形态学和纤维化程度。将细胞分为nc+TGF-β1和si+TGF-β1两组, 构建circ₀006577的siRNA表达载体, 于HK-2细胞贴壁生长达30%时加入, 转染48 h后收集细胞。采用...     

LeftyA蛋白对转化生长因子β1所致肾小管上皮细胞纤维化的影响

目的 观察LeftyA蛋白对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)纤维化的影响,并初步探讨其作用机制.方法 体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2)细胞,通过LipofectamineTM2000介导基因转染及药物筛选构建LeftyA蛋白稳定表达HK-2细胞系;TGF-β1(10ng/ml)刺激此细胞系,于0、6、12、24、48h通过Western blot分别检测E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及p-Smad2/3的表达变化,通过Real-time PCR检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)及结缔组织生长因子(CTGF)基因的表达变化.结果 不同浓度的TGF-β1刺激24 h后HK-2细胞内E-eadherin、α-SMA蛋白的变化均表现出明显的剂量效应,而当TGF-β1浓度达到10ng/ml时,α-SMA蛋白合成达到平台期(P＞0.01),因此本实验中以10ng/ml的TGF-β1作为刺激剂量;TGF-β1(10 ng/ml)刺激HK-2细胞6 h可引起E-cadherin表达下降(P＜0.01),刺激24 h后可诱导其合成表达α-SMA(P＜0.05),同时细胞内ColⅠ基因转录增加(P＜0.01);正常HK-2细胞内没有p-Smad2/3的表达,TGF-β1(10 ng/ml)刺激30min即可诱导其激活表达,并在1 h时迅速达到高峰,其后开始下降;高表达LeftyA蛋白能够减轻TGF-β1所致上皮细胞转分化(EMT)及纤维化的程度,降低p-Smad2/3的表达高峰,并抑制CTGF的表达(P＜0.01).结论 LeftyA蛋白能够通过抑制TGF-β1所致Smad2/3磷酸化及CTGF表达发挥抗肾小管上皮细胞纤维化的作用.     

不同剂量多疗程地塞米松对早产大鼠肺WNT信号转导途径的影响

目的 探讨产前孕鼠应用不同剂量多疗程地塞米松对早产大鼠肺WNT信号转导途径的影响.方法 孕SD大鼠12只随机分为对照组、地塞米松小剂量组和地塞米松大剂量组,每组4只.于孕第16、17、18天,连续3 d腹腔注射药物.对照组予9 g/L盐水;地塞米松小剂量组予地塞米松0.4 ms/(ks·d);地塞米松大剂量组予地塞米松0.8 mg/(kg·d),均用9 g/L盐水稀释至0.5 mL.取孕19 d胎鼠肺组织,RT-PCR法检测WNT信号转导途径中WNT7b、WNT5a、WNT2、糖原合成酶-3β(GSK-3β)、β-连环蛋白(β-cate-nin)基因mRNA的表达.结果 地塞米松小剂量及大剂量组胎肺WNT7b(0.55±0.19、0.64±0.54)及β-catenin基因mRNA的表达量(2.03±0.58、2.40±0.89)均显著高于对照组(WNTTb:0.18±0.10,β-catenin:1.77±0.54)(Pa<0.01),WNT5a mRNA(0.57±0.26、1.13±0.53)和GSK-3β基因mRNA(1.04±0.46、1.09±0.56)表达量均显著低于对照组(WNT5a:1.48±0.70,GSK-3β:2.22±1.02)(P<0.05,0.01),WNT2的表达量与对照组相比差异无统计学意义.结论 产前给予地塞米松影响胎肺WNT7b、WNT5a、β-catenin及GSK-3β基因的表达,可能通过引起WNT信号转导途径障碍导致胎肺形态发育异常,造成胎肺功能缺陷.     

肾小管间质纤维化大鼠肾脏转化生长因子-β1和纤溶酶原激活物抑制剂-1的定量分析

目的 观察肾小管间质纤维化(TIF)大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)mRNA及其蛋白的定量表达,探讨TGF-β1、PAI-1在TIF中的作用及二者之间的相互影响机制.方法 SD大鼠60只,随机分为假手术(SOR)组和单侧输尿管梗阻手术(UUO)组.输尿管结扎后剪断制备UUO模型.分别于手术后第7、14、21天,每组各处死10只大鼠,留取手术侧.肾脏标本,采用病理、实时定量PCR、Western blotting等方法动态观察二组大鼠第7、14、21天梗阻侧肾脏组织学变化和TGF-β、PAI-1在梗阻侧肾脏中的表达情况.采用SPSS 10.0软件进行统计学分析.结果 1.HE、Masson染色结果:SOR组术后第7、14、21天.肾脏未见纤维化改变.UUO组术后第7天肾小管上皮细胞宅泡变性,肾间质炎性反应细胞浸润,术后第14天肾脏纤维化程度加重,术后第21天呈重度纤维化.2.术后第7天开始UUO组TGF-β1 mRNA和蛋白表达量显著高于SOR组(P<0.05,0.01);术后第14天开始UUO组PAI-1 mRNA和蛋白表达量显著高于SOR组(P<0.05,0.01).3.相关性分析:肾小管间质损害与TGF-β1、PAI-1蛋白表达量均呈显著正相关(r=0.975 P<0.01;r=0.801 P<0.05);肾脏TGF-β1表达量与PAI-1呈显著正相关(r=0.937 P<0.01).结论 TGF-β1、PAI-1足肾间质纤维化形成促进因素之一.TGF-β1诱导PAI-1过度表达,PAI-1是TGF-β1的下游靶基因之一,PAI-1也可影响TGF-β1的表达,二者共同促进肾脏纤维化形成.     

siRNA阻断肌成纤维细胞内源性Smad3表达的研究

目的观察Smad3基因的RNA干扰(RNAi)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的小鼠肌成纤维细胞(C2C12)的Smad3表达。方法实验分为实验组、内对照组和空白对照组。用不同浓度TGF-β1干预C2C12细胞,利用体外转录合成的siRNA-Smad3,以阻断Smad3基因表达。用Westernblot检测Smad3和磷酸化的Smad3。结果5ng/mlTGF-β1干预C2C12细胞,促进Smad3磷酸化。0.5h开始诱导Smad3磷酸化,5h达高峰。TGF-β1干预C2C12细胞,诱导Smad3磷酸化呈剂量依赖性。siRNA-Smad3转染C2C12细胞24h,Smad3表达逐渐被抑制到无表达。siRNA-Smad3转染C2C12细胞24h后,加5ng/mlTGF-β1干预,Smad3无表达。结论TGF-β1促进C2C12细胞Smad3磷酸化呈剂量与时间依赖性;siRNA阻断C2C12细胞Smad3表达与Smad3磷酸化。