人类IL-3受体α亚单位与小鼠AIC2B蛋白的相互作用

目的　探索人类IL - 3受体 (IL - 3R)α亚单位与小鼠内源性AIC2B蛋白在诱导细胞增殖信号表达过程中的相互作用。方法　通过PCR扩增技术 ,构建了IL - 3Rα亚单位胞浆域缺失突变子 34、2 2和CD ,然后将野生型和突变型IL - 3Rα亚单位cDNA分别转染到含小鼠IL - 3R基因表达的BaF3细胞 ,并检测了阳性转染子的增殖信号传导和酪氨酸磷酸化。结果　表达野生型hIL - 3Rα/ βc的BaF3阳性对照克隆在生理浓度hIL - 3诱导后即可出现细胞增殖和胞浆信号蛋白 βc、Jak2及Shc磷酸化 ;而含野生型IL - 3Rα亚单位和AIC2B的BaF3细胞可出现高浓度hIL - 3刺激的细胞增殖反应 ,但无信号传导分子的活化 ;共表达突变型IL - 3Rα与AIC2B的BaF3细胞及未转染的BaF3细胞则对各种浓度的hIL - 3刺激均无反应。结论　尽管hIL - 3Rβc亚单位在hIL - 3诱导的信号传导过程中担负关键作用 ,但小鼠内源性AIC2B也可与hIL - 3Rα重建功能性hIL - 3R ,这种功能的表达需要hIL - 3Rα完整受体分子的存在     

hGM—CSF受体β亚单位胞浆域在配体胞吞过程中的作用

目的 探索人粒－巨噬细胞集落刺激因子受体（hＧＭ－Ｒ）β亚单位胞浆域 在配体诱导 的胞吞过程中的作用。方法 通过ＰＣＲ扩增技术，构建β亚单位胞浆域缺失突变子（１４４１、１５８２、１７２６、２３５４和Ｓｍａ），然后将野生型或突变型β亚单位和ＧＭ－Ｒα亚单位cＤＮＡ共转染入ＣＯＳ－７细胞，并对转染细胞的配体胞吞进行检测。结果 以低亲和力方式与配体结合的ＣＯＳ－ＧＭ－Ｒα胞吞水平仅为结合配体的７％，而以高     

人类GM-CSF受体生物学特性的研究

为了探讨人类ＧＭＣＳＦ受体（ＧＭＲ）的功能特性,将编码人ＧＭＲα和βｃ亚单位的ｃＤＮＡ转染到无ＧＭＲ表达的小鼠前Ｂ细胞系ＢａＦ３中。阳性转染子功能检测表明,表达ＧＭＲα的ＢａＦ３克隆能与配体低亲和力结合（Ｋｄ＝３．４ｎｍｏｌ／Ｌ）,并仅在高浓度配体诱导后出现增殖反应;而共表达ＧＭ－Ｒα／β的ＢａＦ３克隆则能以高亲和力方式与配体结合（Ｋｄ＝９９ｐｍｏｌ／Ｌ）,并表现出配体依赖性细胞增殖;增殖信号的传导与配体通过诱导βｃ磷酸化而活化胞浆Ｊａｋ２、Ｓｈｃ及Ｓｈｃ相关蛋白Ｐ１４５（ＳＨＩＰ）有关。提示这些信号分子可能在连结造血生长因子受体与细胞有丝分裂及其它反应的“激酶瀑布”中发挥着关键作用。     

人类GM—CSF受体生物学特性的研究

为了探讨人类ＧＭ－ＣＳＦ受体的功能特性,将编码人ＧＭ－Ｒａ和βｃ亚单位的ｃＤＮＡ转染到无ＧＭ－Ｒ表达的小鼠前Ｂ细胞系ＢａＦ３中。阳性转染子功能检测表明,表达ＧＭ－Ｒａ的ＢａＦ３克隆能与配体低亲和力结合,并仅在高浓度配体诱导后出现增殖反应;而共表达ＧＭ－Ｒａ／β的ＢａＦ３克隆则能以高亲和力方式与配体结合,并表现出配体依赖必细胞增殖;增殖信号的传导与配体通过诱导βｃ磷酸化而活化胞浆Ｊａ２、Ｓｈｃ及Ｓｈ     

hGM-CSF受体β亚单位胞浆域在配体胞吞过程中的作用

目的　探索人粒－ 巨噬细胞集落刺激因子受体（ｈＧＭ－ Ｒ）β亚单位胞浆域在配体诱导的胞吞过程中的作用。方法　通过ＰＣＲ 扩增技术,构建β亚单位胞浆域缺失突变子（１４４１、１５８２、１７２６ 、２３５４ 和Ｓｍａ）,然后将野生型或突变型β亚单位和ＧＭ－ Ｒα亚单位ｃＤＮＡ共转染入ＣＯＳ－７ 细胞,并对转染细胞的配体胞吞进行检测。结果　以低亲和力方式与配体结合的ＣＯＳ－ ＧＭ－ Ｒα胞吞水平仅为结合配体的７％ ,而以高亲和力方式与配体结合的ＣＯＳ－ ＧＭ－ Ｒα／β胞吞水平则达３７％ ,为前者的５ 倍,这种胞吞现象可被丝氨酸／苏氨酸激酶抑制剂Ｈ－ ７ 和星形孢菌素抑制,但不被酪氨酸激酶抑制剂木黄酮和制表菌所抑制;从β亚单位胞浆域结构与胞吞关系可见,Ｃ 末端１２２ 个氨基酸缺失可使胞吞受抑,而该１２２ 个氨基酸上游的３００ 个氨基酸区域缺失则可使胞吞水平显著提高。结论　有效的胞吞需要高亲和结合力的功能受体存在,且胞吞过程不涉及酪氨酸激酶磷酸化;而β亚单位胞浆域对胞吞有正性或负性调节作用,提示这些区域含有调节胞吞过程的序列     

IL-6在人胃癌细胞株AGS中生物学效应及其信号传导途径

目的探讨白细胞介素6(IL-6)在人胃腺癌细胞株AGS中产生生物学效应的信号传导途径.方法通过MTT法检测IL-6刺激AGS细胞后对其生长增殖的影响;采用电泳迁移变动试验(EMSA)和Western blot观察IL-6刺激前后AGS细胞中IL-6相关转录因子Stat3和参与IL-6信号传导功能的蛋白激酶Jak1的诱导活化状态,并确定该细胞中的IL-6信号传导通路;通过免疫细胞化学染色确定磷酸化Stat3在AGS细胞内的定位.结果IL-6可显著促进AGS细胞的增殖;转录因子Stat3和蛋白激酶Jak1都能在AGS细胞中被IL-6诱导激活,且Stat3的活性与IL-6的刺激呈一定的剂量和时间依赖性;磷酸化Stat3的染色定位于AGS细胞核.结论JAK/STAT信号传导途径的活化介导了IL-6对AGS细胞增殖的促进功能.     

IL-6在人胃癌细胞株AGS中生物学效应及其信号传导途径

目的 探讨白细胞介素6(IL-6)在人胃腺癌细胞株AGS中产生生物学效应的信号传导途径。方法 通过MTT法检测IL-6刺激AGS细胞后对其生长增殖的影响；采用电泳迁移变动试验(EMSA)和Western blot观察IL-6刺激前后AGS细胞中IL-6相关转录因子Stat3和参与IL-6信号传导功能的蛋白激酶Jakl的诱导活化状态，并确定该细胞中的IL-6信号传导通路；通过免疫细胞化学染色确定磷酸化Stat3在AGS细胞内的定位。结果 IL-6可显著促进AGS细胞的增殖；转录因子Stat3和蛋白激酶Jak1都能在AGS细胞中被IL-6诱导激活，且Stat3的活性与IL-6的刺激呈一定的剂量和时间依赖性；磷酸化Stat3的染色定位于AGS细胞核。结论 JAK／STAT信号传导途径的活化介导了IL-6对AGS细胞增殖的促进功能。     

支架蛋白JLP调控B细胞上CD40诱导的MAPK信号通路活化及细胞增殖

目的 对支架蛋白JLP在小鼠B细胞上CD40诱导信号通路活化及细胞增殖中的作用进行研究,探索支架蛋白JLP在CD40诱导小鼠B细胞信号通路及后续生物学效应中的作用.方法 磁珠分选法分选出jlp野生型和jlp基因敲除小鼠模型脾脏B细胞,使用免疫印迹法检测在接受CD40配体（CD40L）刺激后jlp野生型和jlp基因敲除型小鼠脾脏B细胞p38、Erk和Jnk MAPK,磷酸化c-Jun以及NF-κB信号通路及的活化情况,并使用CFSE检测两种基因型小鼠B细胞在接受CD40L刺激后细胞增殖情况.结果 jlp基因敲除小鼠B细胞在受到CD40L刺激后其p38、Erk、Jnk MAPK信号通路以及c-Jun活化情况均较jlp野生型小鼠B细胞明显减弱,而NF-κB信号通路的激活情况在两种基因型B细胞中并无明显差异,jlp基因敲除小鼠B细胞中CD40诱导的细胞增殖水平较jlp野生型B细胞明显降低.结论 支架蛋白JLP参与调控B细胞上CD40诱导的MAPK信号通路活化及细胞增殖.     

p16β基因重组腺病毒质粒的构建及对喉癌细胞的作用

目的探讨野生型p16β对体外喉癌Hep-2细胞周期信号传导的干预作用。方法以重组腺病毒为载体,构建p16β的重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β质粒,并在293细胞中包装、纯化。将已纯化的重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β在体外转染Hep-2喉癌细胞,采用MTT实验、流式细胞术（FCM）、免疫组化、Western blot等实验手段检测Hep-2细胞的抑制／杀伤作用及其细胞周期信号、DNA含量、细胞凋亡率的变化;检测P16蛋白的表达和Hep-2细胞的超微结构变化。结果本研究成功地构建和制备了高滴度的AdEasy-GFP-p16β重组腺病毒,并高效地转移到Hep-2细胞内和表达P16蛋白,有效地抑制了Hep-2细胞的生长。被转染的Hep-2细胞被有效地阻滞在G0／G1期,提高了转染细胞的凋亡率。结论重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β能高效感染Hep-2细胞,表达P16蛋白;有效抑制Hep-2细胞增殖;干预Hep-2细胞周期的信号传导机制和细胞周期,诱导凋亡,从而抑制肿瘤细胞增殖活性。     

阿魏酸钠通过阻断NF-κB途径降低NALP3诱导的矽肺中成纤维细胞增殖韩静茵

目的 探讨阿魏酸钠对NALP3诱导的矽肺模型小鼠中成纤维细胞增殖影响的内在分子机制。方法 采用C57BL/6雄性小鼠建立矽肺模型，提取肺成纤维细胞，采用阿魏酸钠和Prostratin处理，并转染shNALP3载体。采用MTT检测细胞活力、Edu实验检测细胞增殖、ELISA检测caspase-1和IL-1β的活性；QRT-PCR检测NALP3表达，以及Western blotting检测NF-κB通路相关蛋白（p65、IkB、NALP3、collagen-1和α-SMA）表达量。结果 阿魏酸钠能够抑制p65、IkB、NALP3、collagen-1和α-SMA的表达，prostratin逆转阿魏酸钠抑制的细胞活力和增殖，同时逆转阿魏酸钠阻断的NF-κB通路蛋白表达和降低NALP3表达，以及逆转阿魏酸钠抑制的Caspase-1和IL-1β活性。转染shNALP3的细胞中NALP3含量明显低于阴性对照组；Prostratin促进的细胞活力和增殖受到shNALP3的逆转，沉默NALP3的细胞中caspase-1、IL-1β、collagen-1和α-SMA的活性明显被抑制，且逆转Prostratin促进caspase-1、IL-1β、collagen-1和α-SMA活性的作用。结论 阿魏酸钠通过阻断NF-κB途径降低NALP3诱导的矽肺中成纤维细胞增殖。     

反义Smad3抑制3T3细胞增殖和TGF-β1基因表达

目的研究反义Smad3对转化生长因子-β1(TGF-β1)基因表达的调控和对3T3细胞增殖的影响.方法构建反义Smad3质粒,以脂质体介导转染NIH3T3细胞,进行细胞计数,并用RT-PCR方法观察TGF-β1 mRNA的表达.结果反义Smad3能下调TGF-β1 mRNA的表达,并抑制3T3细胞增殖.结论可以通过阻断TGF-β1细胞内信号传导调控TGF-β1基因的表达并抑制细胞增殖.     

反义Smad3抑制3T3细胞增殖和TGF-β1基因表达

目的 研究反义Smad3对转化生长因子-β1(TGF-β1)基因表达的调控和对3T3细胞增殖的影响。方法 构建反义Smad3质粒,以脂质体介导转染NIH3T3细胞,进行细胞计数,并用RT-PCR方法观察TGF-β1 mRNA的表达。 结果 反义Smad3能下调TGF-β1 mRNA的表达,并抑制3T3细胞增殖。 结论 可以通过阻断TGF-β1细胞内信号传导调控TGF-β1基因的表达并抑制细胞增殖。     

DAMPs对人肝癌HepG2细胞增殖能力影响的机制研究

目的:探讨在损伤相关模式分子(DAMPs)诱导下人肝癌HepG2细胞增殖能力变化的发生机制。方法:将HepG2细胞分为对照组,DAMPs组,IL-6 siRNA组,IL-6 siRNA+DAMPs组;MTT比色法检测HepG2细胞增殖能力的变化;实时荧光定量PCR法检测IL-6及STAT3 mRNA的表达;Western blot法测定HepG2细胞STAT3蛋白和磷酸化STAT3蛋白的表达。结果:DAMPs组细胞增殖能力较对照组显著增强,IL-6 mRNA及STAT3 mRNA的表达较对照组显著上调,差异均有统计学意义(P<0.01);Western bot法检测出四组STAT3蛋白表达无明显差异,而DAMPs组磷酸化STAT3蛋白的表达高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:DAMPs可能通过IL-6/STAT3信号通路促进人肝癌HepG2细胞的增殖。     

Stat3信号传导通路对结肠癌细胞G1～S期的调控

目的：探讨Stat3信号传导通路对结肠癌细胞G1-S期调控的可能机制。方法：应用阳离子脂质体介导Stat3反义寡核苷酸转染人结肠癌SW480与HCT116细胞，阻断其Stat3通路；MTT法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期；Western blot检测Stat3、磷酸化Stat3、G1期Cyclins、CDKs、p21、p27的表达。结果：转染Stat3反义寡核苷酸后结肠癌细胞增殖受抑制，Stat3、磷酸化Stat3、G1期Cyclins、CDKs表达水平下降，p21与p27表达水平上升。结论：Stat3信号传导通路可能通过调节CDK/Cyclin复合物与CK1成员之间的平衡而调节结肠癌细胞G1-S期转换。     

病毒性心肌炎动物模型细胞免疫功能和细胞因子检测的意义

目的探讨T细胞亚群、白细胞介素2（IL-2）和肿瘤坏死因子α（TNF—α）与病毒性心肌炎（VM）的关系。方法用亲心肌细胞株柯萨奇病毒B3感染Balb／c小鼠建立心肌炎模型,用免疫荧光技术检测VM小鼠血液中的T细胞亚群;用双抗体夹心法检测小鼠血清中的IL-2和TNF—α结果VM小鼠血液中CD4＋（Th/Ti）和CD8＋（Tc／Ts）细胞亚群的含量、血清中IL-2和TNF—α水平均明显高于正常小鼠。结论T细胞亚群、IL-2和TNF—α参与病毒性心肌炎的发病,同时也发挥抗病毒作用。     

转化生长因子β1与Smad3信号传导在肺移植术后闭塞性细支气管炎中的作用

目的探讨肺移植术后闭塞性细支气管炎的发生机理及转化生长因子（TGF）β1／Smad3信号传导途径在此病理过程中的意义。方法闭塞性细支气管炎动物模型采用Smad3野生型和基因敲除小鼠进行的同种异体气管异位移植,免疫组织化学检测肌纤维母细胞分化的标志物——仅平滑肌肌动蛋白（αSMA）的存在及差异。采用原代培养Smad3野生型和敲除型气管纤维母细胞,经TGF-β1处理,通过免疫荧光、Western印迹和DNA凝胶电泳迁移率检测手段,检测Smad3蛋白的激活。并用免疫荧光染色检测细胞骨架聚合能力和αSMA分子的不同表达;Western印迹和RT-PCR法检测αSMA在转录和蛋白水平的差异。结果在发生闭塞性细支气管炎的受累气道中,发现有肌纤维母细胞的存在,且其在Smad3野生型中的数量明显多于敲除型（t=2．125,P=0．040）。对纤维母细胞进行的离体研究发现,TGF-β1诱导Smad3激活,表现为蛋白磷酸化、细胞核转位和DNA结合增加。在Smad3野生型的纤维母细胞,TGF-β1引起细胞骨架聚合能力增强、αSMA在转录和蛋白水平的表达增强,即向肌纤维母细胞的分化增加;而在缺乏Smad3的纤维母细胞中,TGF-B1诱导的肌纤维母细胞分化明显减少（t=2．080,P=0．027;t=1．982,P=0．032）。结论TGF-β1主要通过激活Smad3依赖性信号传导途径,来促使纤维母细胞向肌纤维母细胞的转化和αSMA蛋白的增加,最终导致闭塞性细支气管炎的发展。     

整合素αⅡbβ3缺陷对血小板由内到外信号传导的影响

目的 :探讨整合素αⅡbβ3缺陷对血小板由内到外信号传导的影响。方法 :采用DNA序列分析、流式细胞术、RT PCR和Westernblotting等检测细胞中转染cDNA的存在、表达及细胞结合PAC 1、纤维蛋白原 (fibrinogen ,Fb)的能力。结果 :血小板无力症 (GT)患者整合素αⅡbβ3明显低下 ,且血小板在ADP激活后不能结合PAC 1,转染β3和αⅡb(突变αⅡbR995A 或正常αⅡb)cDNA的CHO细胞株分别表达αⅡbR995A β3和αⅡbβ3,并且突变株中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovary ,CHO)细胞αⅡb基因 30外显子上第 30 77和 30 78位碱基由CG突变为GC ,导致第 995位精氨酸被替换为丙氨酸 ;在未活化的情况下 ,αⅡbβ3CHO细胞几乎不结合PAC 1,但能结合Fb ,而αⅡbR995Aβ3CHO细胞能结合PAC 1,且Fb明显增加。结论 :αⅡbR995A 突变能诱导血小板内到外信号传导 ,使αⅡbR995Aβ3表现为激活型受体 ;而GT患者却因整合素αⅡbβ3缺陷使αⅡbβ3介导的血小板由内到外信号传导受阻 ,使该GT患者表现出血小板聚集异常。     

IL-3Rα在急性白血病中的表达及意义

目的探讨白细胞介素-3受体α亚基(IL-3Rα)在急性白血病(AL)中的表达及意义。方法建立AL患者标本,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测IL-3Rα的表达,分别予以观察IL-3RαmRNA表达与AL和CD34的相关性。结果对照组未检测到IL-3Rα表达;AML和B-ALL患者IL-3Rα阳性表达显著高于对照组,T-ALL患者未检测到IL-3Rα的表达,M1～M5各型患者的阳性率差异无统计学意义(P>0.05);AML和B-ALL患者的IL-3Rα阳性表达与CD34显著相关,差异有统计学意义(P<0.05);患者中IL-3Rα阳性表达的患者CR率低于阴性者,且与外周血白细胞计数、骨髓中原始细胞比例有关。结论 IL-3Rα在AML和B-ALL发病中有一定作用,检测IL-3Rα有助于ALL的T和B两型的鉴别。IL-3Rα基因可能是AML、B-ALL的一个不良预后因素。     

β1整合素基因缺失对Gi蛋白分布的影响

目的 了解跨膜蛋白β1整合素对信号分子G蛋白细胞内构型的影响,为进一步研究β1整合素在信号传导中的作用打下基础。方法 采用荧光双标记及重叠合显微镜分析技术,观察野生型胚胎干细胞系（D3细胞）,β1整合素基因敲除胚胎干细胞（G201细胞）,β1整合素基因敲除后再植入胚胎干细胞（G201N）及小鼠胚胎心肌细胞中多种G蛋白（Gas,Gai1-3,Gao,Gai/o/t/z）细胞内构型特点和差异。结果 Gas,Gao,Gai/o/t/z在上述几种细胞系中均呈弥温性分布,未能发现明显差异,与此不同的是Gai1-3在D3细胞源性心肌细胞内呈网状分布,在非心肌细胞内呈线条状分布,而在G201细胞中Gi上述特异性构型被打乱,呈近似于弥漫样分布,值得注意的是在β1整合素重新恢复的G201N细胞Gi构型又呈网样或线条样分布,与野生型胚胎干细胞中Gi的构型相一致。结论 β1整合素能够影响信号分子Gi蛋白的细胞内定位,推测β1整合素可通过改变Gi的分布而影响Gi介导的信号传导。     

淋巴毒素β受体活化对膀胱癌细胞NF-κB信号通路及细胞增殖的影响

目的 研究淋巴毒素β受体(LTβR)的活化对膀胱癌细胞株5637核转录因子-κB(NF-κB)信号通路及细胞增殖的影响。 方法 以膀胱癌细胞株5637为研究对象,以配体淋巴毒素α1β2(LTα1β2)诱导LTβR信号活化。qRT-PCR检测NF-κB信号通路RelA、RelB mRNA,细胞因子LTα、LTβ、LIGHT、TNFα、IL-6、IL-1β mRNA和增殖相关基因细胞周期素D1(CyclinD1)、生存素(Survivin) mRNA的表达水平;WB法检测NF-κB经典信号通路活化状态;CCK-8法检测细胞增殖水平。 结果 LTβR活化后,RelA mRNA表达上调2.5倍(P=0.003),TNFα、IL-1β、CyclinD1、Survivin mRNA出现不同程度的上调(均P<0.05),随着LTβR表达下调,以上基因mRNA表达也下降(均P<0.05);WB结果显示活化标志蛋白p-p65表达出现升高趋势(P>0.05);与对照组相比,细胞增殖活性的差异未见统计学意义(P>0.05)。 结论 活化LTβR可促进NF-κB经典信号通路主要成员RelA的表达和活化,并有可能通过上调促炎细胞因子TNFα、IL-1β的表达参与膀胱癌炎性微环境的形成;有利促增殖相关基因CyclinD1、Survivin的表达,但在细胞增殖水平上并未见明显效应。