鸟苷酰环化酶C小干扰RNA对胃癌细胞生长的影响

目的：研究靶向鸟苷酰环化酶C（Guanylyl cyclaseC,GC-C）的小干扰RNA（siRNA）对人胃癌SGC-7901细胞体外生长能力的影响。方法：利用pSilencer TM4.1-CMVneo通过siRNA表达载体法制备GC-CsiRNA。将GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光观察转染前后胃癌细胞GC-C基因的表达变化,黏附实验观察转染前后胃癌细胞黏附能力。结果：构建的GC-CsiRNA测序鉴定与设计完全相符。GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,明显抑制GC-C基因的表达。转染后,GC-CmRNA和蛋白表达分别抑制了66.7%和75.8%,细胞黏附能力较对照组减弱（P〈0.05）。结论：靶向GC-C的siRNA可明显下调靶基因GC-C的表达,在体外抑制胃癌SGC-7901细胞的黏附,提示GC-C基因与胃癌的发生、发展有密切的关系。     

鸟苷酰环化酶C质粒标准品的构建

目的:制备人鸟苷酰环化酶C(GC-C)质粒标准品,为实时荧光定量PCR检测GC-C含量,探讨大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)GC-C mRNA表达水平及临床意义奠定基础。方法:在鸟苷酰环化酶C(GC-C)基因高保守区设计特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并连接于pGEM-T载体,以得到GC-C质粒标准品。结果:经过蓝白斑筛选,PCR或EcoR I酶切初步鉴定,阳性克隆测序分析确定GC-C质粒标准品正确性。结论:正确构建GC-C质粒标准品为RFQ-PCR标准曲线的绘制及GC-C的定量检测奠定了基础。     

实时荧光定量PCR检测大肠癌患者外周血鸟苷酰环化酶C基因及其临床意义

目的:建立人鸟苷酰环化酶C(GC-C)含量实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测的新方法,观察大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)GC-C mRNA表达水平并探讨其临床意义.方法:在GC-C基因高保守区设计了特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本(30例健康献血员、11例大肠良性病变和37 例大肠癌)中GC-C mRNA准确含量,并以GC-C mRNA和β2微球蛋白 mRNA含量的比值作为评价GC-C表达水平的指标.结果:本法检测GC-C mRNA含量的线性范围为101 ～109 pg/ml,样本批内和批间变异系数(CV)值分别为6.87%～11.12%和8.86%～15.19%.30例健康献血员和11例大肠良性病变样本的PBMC中均未检出GC-C mRNA表达,大肠癌患者外周血GC-C mRNA的检出率为83.8%(31/37).大肠癌患者外周血PBMC GC-C mRNA表达水平为0.88±0.06,与Duke分期、淋巴结转移和肝转移密切相关,与年龄、性别、肿瘤大小等无关.结论:GC-C mRNA RFQ-PCR检测外周血大肠癌细胞具有较好的检测灵敏度、特异性和重复性,GC-C mRNA表达水平可能对指导大肠癌Duke分期、判断淋巴结转移和肝转移、指导术后综合治疗均有一定价值.     

血管内皮生长因子小干扰RNA诱导胃癌细胞凋亡机制的研究

目的 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是重要的血管生成因子之一,目前在许多肿瘤组织中均发现VEGF有较高水平的表达,靶向VEGF的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)可明显抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡.文中进一步探讨VEGF siRNA诱导人胃癌细胞SGC7901凋亡的机制.方法 将培养的人胃癌细胞SGC7901分成空白对照组、慢病毒NC-Lv阴性对照组及慢病毒VEGF-siRNA-Lv干扰组,病毒感染96h后,分别提取各组细胞总RNA及蛋白,RT-PCR法检测各组细胞bcl-2及P21 mRNA的表达水平,Western blot 检测各组细胞SIRT1及P53蛋白的表达水平.结果 与空白对照组及阴性对照组相比,RT-PCR显示VEGF-siRNA-Lv组细胞bcl-2 的mRNA表达明显下调(P<0.05),P21 mRNA表达则明显上调(P<0.05),Western blot 显示VEGF-siRNA-Lv组细胞SIRT1蛋白表达下调(P<0.05),P53蛋白表达则明显上调.结论 VEGF siRNA可通过下调SIRT1蛋白的表达,导致P53蛋白表达上调,并调控其下游P21、bcl-2靶基因的转录,从而诱导胃癌细胞SGC7901的凋亡.     

基因沉默的维持——长效RNA干扰

自揭示了哺乳动物细胞中的RNA干扰（RNAi）现象以来，对其进行了大量的研究与资金投入，期望将其发展成一种切实可行的治疗手段。毫无疑问，RNAi是最具发展潜力的基因治疗策略。由于许多采用RNAi治疗的疾病需要长期用药，因此，有关RNAi类药物长期应用的安全性问题成为关注重点。     

靶向EGFR基因RNA干扰对胃癌细胞BGC823细胞增殖和凋亡的影响

目的利用R NA干扰技术下调表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,观察其对胃癌BGC823细胞增殖和凋亡的影响。方法将细胞分为3组,空白对照组、空载体组和实验组(转染EGFRshRNA组)。构建针对EGFR基因的s和R NA真核表达载体,转染入胃癌BGC823细胞中,运用R T-PCR和Western blot检测EGFR在mRNA和蛋白水平的变化;WST-1法检测细胞增殖的影响:Hoechst33258染色观察细胞核形态学变化。实验重复3次。结果成功构建表达质粒pGenSil-EGFR并转染BGC823细胞,shRNA下调EGFR的表达后,与空白对照组相比EGFR在mR NA和蛋白水平的表达均下降,抑制率分别为58.6%和75.2%。shR NA转染24、48、72 h,WST-1法检测胃癌细胞BGC823的增殖情况,与空白对照组相比,24 h后三组差异不明显(F=0.326,P>0.05),48 h及72 h后,细胞增殖明显下降(F=68.25及274.45,P<0.001),有统计学意义。EGFR shR NA作用BGC823细胞72 h后,经Hoechst33258染色发现,实验组细胞核染色质边集,出现凋亡小体。结论靶向EGFR基因RNA干扰能够阻抑胃癌细胞BGC823细胞的EGFR表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,EGFR基因有望成为胃癌基因治疗靶点。     

体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响。方法应用实时定量PCR方法检测七株胃癌细胞株中REG4基因的mRNA表达。针对REG4基因设计三条小干扰RNA片段(siRNA1、siRNA2、siRNA3),瞬时转染高表达胃癌细胞株。用RT-PCR方法检测转染后REG4基因的mRNA表达水平、MTT法检测细胞增殖能力、AnnexinV-PI法检测细胞凋亡水平。结果以永生化正常胃粘膜细胞株GES-1作为参照。MKN-45和AGS胃癌细胞株中REG4表达水平升高200倍以上,遂选用AGS细胞进行RNA干扰。RT-PCR结果证实siRNA2、siRNA3均有干扰效果,尤以siRNA3效果明显。选用siRNA3干扰AGS细胞株,MTT实验结果证实干扰AGS后,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。AnnexinV-PI实验结果显示细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论干扰REG4基因具有抑制胃癌细胞增殖、促进凋亡的作用,REG4基因可能成为胃癌基因靶向治疗的新靶点。     

血红素加氧酶-1小干扰RNA对人胃癌9811-P细胞体外侵袭的影响

目的 构建血红素加氧酶-1(HO-1)小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察HO-1 siRNA对人胃癌9811-P(GC9811-P)细胞体外侵袭转移能力的影响.方法 设计HO-1 siRNA序列,构建其真核表达载体,在Lipofectamine 2000介导下转染GC9811-P细胞,通过Western-blotting及RT-PCR检测HO-1在蛋白及mRNA水平的表达变化.通过细胞划痕实验、Transwell小室实验观察GC9811-P细胞体外侵袭转移能力.结果 成功构建了HO-1 siRNA表达载体,并命名为pEGFP-C1/HO-1-siRNA.获得成功转染HO-1-siRNA的GC9811-P细胞,mRNA及蛋白水平均显示HO-1在GC9811-P细胞中明显下降.细胞划痕实验结果显示转染了HO-1-siRNA组的GC9811-P细胞迁移不明显,而转染了阴性对照组细胞和未转染的空白对照组细胞大量迁移至划痕区.Transwell小室实验结果显示转染了HO-1-siRNA组的GC9811-P细胞穿膜数为(54.2±2.68),而转染了阴性对照组的细胞穿膜数为(83.2±5.71),未转染的空白对照组细胞穿膜数为(84.3±4.29),LSD-t检验分析各组间细胞穿膜数的差异,HO-1-siRNA组细胞穿膜数小于阴性对照组及空白对照组细胞穿膜数(P＜0.05).结论 HO-1在GC9811-P细胞体外侵袭转移中发挥着重要作用,HO-1-siRNA可抑制GC9811-P细胞体外侵袭转移能力.     

可溶性鸟苷酰环化酶对酒精中枢神经毒性作用的影响

目的 探讨可溶性鸟苷酰环化酶（GC）与鼠小脑颗粒细胞（CGC0存活的相关性。方法 通过光学显微镜观察N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA），一氧化氮释放剂2',2'-(hydroxynitosohydrazono)bisethanamine(Deta-NONOate)以及可溶性鸟苷酰环化酶抑制剂6-Anilinoquinoliene-5,8-quinolinedione(LY83583)对鼠小脑颗粒细胞存活的影响。结果 NMDA，Deta-NONOate能在无酒精的环境下，促进细胞的生存，并能对CGC产生保护作用，减少酒精对细胞的杀死，但LY83583却能抑制NMDA及Deta-NONOate的作用。结论 可溶性鸟苷酰环化酶在NMDA和Deta-NONOate促鼠小脑颗粒细胞的存活和抵抗酒精的神经毒性过程中起到关键的作用。     

RNA干扰沉默STAT3基因对胃癌细胞侵袭力的影响

目的观察瞬时转染信号传导与转录激活因子3（STAT3）小干扰RNA（siRNA）后对人胃癌细胞SGC-7901侵袭力的影响,探讨干扰STAT3后降低胃癌细胞侵袭力的机制。方法以人胃癌细胞系SGC-7901为研究对象,培养瞬时转染特异性siRNA的SGC-7901细胞系,通过RT-PCR、免疫细胞化学、Transwell体外侵袭实验等检测该siRNA对SGC-7901细胞STAT3及MMP-9基因表达和对细胞侵袭转移能力的影响。结果STAT3 siRNA转染SGC-7901细胞48 h后,STAT3 mRNA水平下降了73.04%,MMP-9 mRNA水平下降了57.2%;Transwell体外侵袭实验显示,STAT3 siRNA组能显著抑制SGC-7901的侵袭力（P〈0.01）。结论应用siRNA技术能有效抑制SGC-7901STAT3基因的表达,进而可能通过抑制MMP-9基因的表达,降低细胞的侵袭力,为以STAT3为靶向的胃癌基因治疗提供了新的思路和方法。     

siRNA特异性"沉默"Bim基因对胃腺癌细胞凋亡的影响

目的研究BH3-only蛋白Bim在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用。方法流式细胞仪PI单染法检测细胞凋亡率;JC-1染色检测线粒体膜电位的变化;在紫杉醇相对敏感SGC-7901胃腺癌细胞株中采用小干扰RNA(siRNA)技术特异性"沉默"Bim基因;Western blot分别检测紫杉醇诱导siRNA"沉默"Bim基因前后Bim蛋白的表达水平变化。结果紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡具有剂量和时间依赖性,SGC-7901较BGC-823胃腺癌细胞株对紫杉醇更为敏感。紫杉醇诱导SGC-7901及BGC-823胃腺癌细胞很大程度依赖线粒体途径凋亡。特异性"沉默"Bim基因的转录,紫杉醇诱导凋亡敏感细胞株SGC-7901的凋亡率明显降低。结论Bim在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡中发挥关键调节作用。     

siRNA沉默livin基因对食管癌细胞生长与凋亡的影响

目的观察小分子干扰RNA（siRNA）沉默livin基因在食管癌细胞中的表达情况,探讨livin基因对食管癌细胞生长、凋亡的影响。方法自行设计两条针对livin基因的siRNA：livin—sh-1,livin—sh-2,构建相应的表达载体分别转染至对数生长期的食管癌,经G418筛选后采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、MTT、TUNEL分别比较检测转染前后食管癌细胞livin基因的表达。结果siRNA对照组与空siRNA载体组的livinw／β mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）;但转染siRNA组Livinl／2mRNA表达显著降低,明显低于siRNA对照组和空siRNA载体组（P〈0．05）。细胞生长曲线测定经F检验三组间差异无统计学意义。转染siRNA载体沉默livina／β表达,细胞凋亡率显著增加。结论siRNA沉默livin基因能抑制食管癌细胞的生长,促进食管癌细胞的凋亡,livin基因有可能成为食管癌治疗的新靶点。     

人参皂甙肠道代谢物CompoundK对人胃癌细胞增殖及凋亡相关基因表达的影响

目的观察人参皂甙肠道代谢物CompoundK（CK）对人胃癌细胞BGC823细胞增殖、凋亡的影响。方法实验分组：对照组（PBS溶液）,实验组（浓度分别为2．5、5、7．5、10μmol／L）。噻唑蓝（MTT）比色法分别检测CK作用于细胞后其活力及生长抑制率;流式细胞术检测CK作用后细胞周期时相、凋亡率;免疫印迹法（Westernblot）检测凋亡相关蛋白的表达。结果5μmol／LCK作用细胞48h时,细胞生长周期阻滞于G2／M期,细胞凋亡率为（21．17±3．16）％;Westernblot检测显示Bcl-2,Bid蛋白表达随着药物浓度的增加而减少,Fas和Fas—L蛋白表达量却没有明显变化。结论CK是通过线粒体介导的凋亡通路途径来诱导人胃癌细胞发生凋亡的。     

ALCAM基因1沉默对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

目的 探讨活化白细胞黏附分子(ALCAM)基因沉默对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,并对其分子机制进行初步研究.方法 将ALCAM 和对照shRNA转染至胃癌细胞SGC-7901中,建立稳定细胞系,分别采用实时荧光定量(RT-PCR)技术和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测转染后SGC-7901细胞中ALCAM mRNA和蛋白水平;采用CCK-8法检测转染后SGC-7901细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测转染后SGC-7901细胞凋亡情况.采用胃癌肿瘤模型分析ALCAM基因沉默对肿瘤生长的影响.结果 ALCAM shRNA稳定细胞系ALCAM mRNA(1.01 ±0.26)和蛋白质的表达水平(1.66 ±0.23)低于对照 shRNA组细胞ALCAM mRNA(0.12 ±0.06)和蛋白质水平(0.23 ±0.09),差异有统计学意义(P<0.05).与对照shRNA稳定细胞系比较,ALCAM shRNA 稳定细胞系细胞增殖活性下降(P<0.05)、凋亡水平升高(P<0.05)、荷瘤小鼠肿瘤生长速度减缓(P<0.05).ALCAM下调并不影响总蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达,而降低了AKT和mTOR磷酸化水平,抑制了mTOR活性,此外,ALCAM蛋白敲低提高了Caspase-3蛋白的表达水平,激活了凋亡信号通路.结论 ALCAM基因沉默能够降低胃癌细胞中ALCAM的表达水平,抑制胃癌细胞的增殖,增加细胞凋亡.     

辛伐他丁对胃癌细胞增殖的影响

目的　研究辛伐他丁对胃癌细胞增殖的影响。　方法　采用甲唑蓝 (MTT)比色法和流式细胞仪检测胃癌细胞的增殖活性和细胞周期。　结果　辛伐他丁可明显降低MNK4 50 胃癌细胞增殖活性、S期细胞比和PI值 ,在 >1μM浓度时 ,与对照组比较具有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,同时加入甲羟戊酸(MVA)则可逆转辛伐他丁的抑制作用。另外 ,辛伐他丁对胃癌细胞经过G2 期也具有一定阻抑作用。　结论　辛伐他丁可抑制胃癌细胞生长增殖 ,提示辛伐他丁具有抗肿瘤作用 ,可作为胃癌辅助治疗的新手段。     

DNMT1靶向RNAi重组体对胃癌细胞周期的影响

目的 :本研究利用RNA干扰 (RNAinterfering ,RNAi)技术 ,以DNMT1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因 ,设计构建重组体 ,研究其对胃癌细胞周期的影响。方法 :设计有小发夹结构的两条DNA序列 ,经退火成互补双链 ,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体 ,经鉴定正确后 ,转染胃癌细胞AGS ,最后使用流式细胞仪分析细胞周期。结果 :转染后的胃癌细胞的S期细胞较前有明显减少 ,G2 -M期细胞明显增多。结论 :DNMT1靶向RNA干扰重组体转染到胃癌细胞中后促使S期细胞进入G2 -M期 ,最后衰老死亡。从而为肿瘤的治疗开辟了新途径。     

siRNA干扰USP7表达对喉癌细胞生物学特性的影响

目的：通过小干扰RNAs（siRNA）干扰泛素特异性蛋白酶7（USP7）在喉癌细胞中的表达,来探讨 USP7对喉癌细胞生物学特性的影响。方法自行设计并使用高效siRNA在喉癌HEP2细胞株特异性干扰USP7表达,然后利用CCK‐8法、Tr‐answell小室迁移实验和流式细胞术观察USP7干扰后对喉癌细胞增殖、迁移能力和凋亡的影响。结果自行设计的siRNA可高效抑制喉癌 HEP2细胞USP7 mRNA及蛋白表达,显著抑制喉癌细胞的增殖、迁移能力,促进喉癌细胞的凋亡。结论 siRNA‐USP7可以显著抑制喉癌细胞增殖和迁移能力,并促进凋亡,提示USP7可能是晚期喉癌治疗的一个重要靶标。     

胃癌癌前状态细胞凋亡检测方法探讨

目的探讨胃癌癌前状态细胞凋亡的检测方法。方法胃镜取活组织标本经病理证实为胃癌癌前状态38例，将组织消化成单个细胞后，随机分别采用PI单染、TUNEL法、AnnexinV／PI双染后，再于流式细胞仪上检测细胞凋亡率。结果PI单染法细胞凋亡率（20．00±7．19）％，TUNEL法细胞凋亡率（39．00±12．17）％，AnnexinV／PI双染细胞凋亡率（28．00±10．62）％。任意两组比较均不同。结论三种检测方法中，AnnexinV／PI双染较为灵敏、准确、特异，另外两种方法均有缺点。     

胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响

目的研究胃癌相关基因GCRG213 siRNA转染对胃癌细胞MKN45的影响。方法1）设计两对针对GCRG213可转录为小干扰RNA（siRNA）的DNA片段,退火后插入小干扰RNA表达载体IMG-800。2）测序正确的重组子IMG-800—1,IMG-800-2和空载体转染MKN45细胞,采用RT—PCR及Western法比较GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。3）绘制细胞生长曲线,分析细胞的增殖状态,检测凋亡细胞。结果1）干扰片段正确插入小干扰RNA表达载体IMG-800。2）重组子和空载体转染MKN45细胞。3）转染siRNA的MKN45细胞中其mRNA的表达下调44．9％和49．5％;其蛋白的表达下调55．3％和64．2％。4）转染siRNA的MKN45细胞生长增殖速度减慢,处于G0-G1期的细胞增加,G2／M期和／或S期的细胞比例减少,细胞凋亡率增加。结论siRNA转染可抑制肿瘤细胞的生长和增殖,促进肿瘤细胞的凋亡。