乙型血友病患者的治疗进展

乙型血友病(HB)是一种由于血浆凝血因子IX (FIX)质或量的异常所致的遗传性出血性疾病.凝血因子IX基因突变是其致病根源.目前,依靠凝血因子替代治疗仍是HB的主要治疗,但存在使用不便、抑制物产生和疾病传播等不足,因此基因治疗成为彻底治愈血友病患者的理想方法.目前,腺相关性病毒(AAV)和慢病毒载体成为基因治疗的优先选择载体,但仍有很多困难需要克服,如FIX水平表达不足以预防出血或诱发效应T细胞攻击基因靶细胞,尤其是特异针对AAV抗原的攻击,因此,寻求更具有安全性的非病毒载体逐渐被研究者认识.近几年关于AAV病毒载体在人体试验中取得了一定的成功,但仍存在安全性等问题,基因治疗的方法仍需进一步的研究,以达到完全治愈血友病的目的.     

腺相关病毒载体：通往肿瘤基因治疗的桥梁

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是一种有缺陷的非致病的人类细小病毒。腺相关病毒载体作为基因治疗的载体,对长期基因矫正和基因治疗具有一定优越性。由于其低致病性、易操作性等优点,腺相关病毒载体被作为转导目的基因的理想载体,现已广泛地应用于多种肿瘤等疾病的基因治疗研究中。通过对腺相关病毒载体的改造优化,增加其靶向性,减少免疫原性,有望为相关疾病的基因治疗研究提供新的手段和方法。本文就目前腺相关病毒在肿瘤治疗中的应用研究加以综述,旨在对病毒载体在肿瘤生物治疗领域中的应用提供相应的参考。     

重组腺相关病毒载体与血友病A基因治疗

基于腺相关病毒(AAV）独特的生物学特性，重组腺相关病毒载体（rAAV)是目前最具希望的因治疗载体之一。在一些目的基因需长期、稳定表达的疾病的基因治疗中，愈来愈受到青睐。本文就AAV的基因结构和生物学特性、rAAV载体、载体改造及在血友病A基因治疗中的应用作一综述。     

腺相关病毒在帕金森病研究中的应用进展

帕金森病是常见于中老年的中枢神经系统变性疾病,主要发病机制尚不明确。目前治疗策略旨在减轻症状和减缓疾病的进展。腺相关病毒(AAV)介导的基因传递应用包括神经生物学研究、疾病模型和基因治疗。AAV作为神经示踪剂可用于探索基底节环路,为帕金森病发病机制的研究提供理论依据;AAV载体编码的治疗基因,为帕金森病的治疗带来了广阔前景。近年来,国内外相继开展了AAV用于帕金森病的动物实验和临床研究,取得了一定的进展。如何更好地利用AAV治疗帕金森病,又能将不良反应降到最低,成为未来学术界研究的热点。     

腺相关病毒载体及其在血友病A基因治疗中的应用

腺相关病毒(AAV)载体所具有的生物学特性,使其成为一些需要目的基因长期而稳定表达的疾病基因治疗的理想载体之一。BDD F Ⅷ cDNA的应用以及AAV包装容量的拓展,可能使AAV在血友病A的基因治疗中发挥重要作用。     

重组腺相关病毒载体与血友病A基因治疗

基于腺相关病毒(AAV)独特的生物学特性,重组腺相关病毒载体(rAAV)是目前最具希望的基因治疗载体之一。在一些目的基因需长期、稳定表达的疾病的基因治疗中,愈来愈受到青睐。本文就AAV的基因结构和生物学特性、rAAV载体、载体改造及在血友病A基因治疗中的应用作一综述。     

腺相关病毒载体及其在血友病A基因治疗中的应用

腺相关病毒（AAV）载体所具有的生物学特性，使其成为一些需要目的基因长期而稳定表达的疾病基因治疗的理想载体之一。BDD FⅧ cDNA的应用以及AAV包装容量的拓展，可能使AAV在血友病A的基因治疗中发挥重要作用。     

超声靶向破坏微泡介导腺相关病毒为载体的基因转染

腺相关病毒(AAV)是相对理想的基因治疗载体,但其转染效率低。超声靶向破坏微泡(UTMD)通过声孔效应、内吞作用和化学作用促进细胞摄取,是简单、易于操作、安全的提高基因转染率的方法。目前UTMD介导AAV为载体的基因转染已用于研究心脏、眼睛和肝脏的基因治疗。本文对AAV载体的转染特点、UTMD介导AAV为载体的基因转染机制及其应用进行综述。     

腺相关病毒在基因治疗中的研究进展

基因治疗为人类一些疑难疾病的治疗带来了新的希望,但如何将外源基因高效导入靶细胞或机体,一直是人们渴望解决的问题。腺相关病毒（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ,ＡＡＶ）属细小病毒科,是动物病毒中最小的一种真核病毒,在高效转导、稳定表达方面具有其他病毒载体所没有的优越性。在为人类基因治疗寻找一种理想载体的研究,ＡＡＶ受到广泛重视。近年来其他生物学特性及应用研究均取得了较大进展。     

基因治疗中重组腺相关病毒载体的安全性

正基因治疗对常用治疗方法难以解决的单基因疾病、癌症、心血管疾病等往往具有良好的疗效。迄今为止,已有超过2000例的基因治疗应用于临床试验~([1]),在基因治疗临床试验中超过68%是应用病毒载体。腺相关病毒(AAV)载体由于其基因传递效率高,缺乏致病性和具有良好的安全性而备受青睐~([2])。三十多年来,许多应用AAV的基因治疗临床试验取得了成功,rAAV成为人类临床试验的最佳载体之一~([3,4,5]),但是我们仍然不能忽视基因治疗     

腺相关病毒及慢病毒载体对骨髓间充质干细胞基因转染效率的比较

目的比较腺相关病毒(AAV)载体和慢病毒(LV)载体在间充质干细胞(MSCs)基因转染中的效率。方法密度梯度离心法分离培养MSCs,HE 染色、Nestin 免疫荧光染色鉴定,BrdU 标记观察增殖情况。分别包装AAV 与LV 假病毒颗粒,并感染MSCs,通过β-gal 染色和绿色荧光蛋白检测,分别计算两者的转染效率。结果MSCs成功从骨髓分离。AAV载体介导的基因转染率为49.1%,LV载体的转染率为91.4% (P<0.01)。结论LV载体介导的基因转染方法转染效率更高。     

腺相关病毒载体和中枢神经系统疾病的基因治疗

中枢神经系统疾病分子改变的深入研究和基因治疗技术的不断发展为临床治疗这些疾病带来了希望.但基因治疗临床应用的最大障碍之一便是转基因技术中载体系统的选择.理想的体内基因转移载体应具有较好的细胞靶向性,目的基因表达的可控性以及转移方法的简单易行.自七十年代末病毒载体的概念提出以来,用于基因治疗研究的缺陷性病毒载体种类日渐增加,应用也愈加广泛.其中,腺相关病毒(AAV)载体是目前病毒类转基因系统中较新的成员.由于该系统最大的优点之一是它的安全性较好,并且最有可能发展成为将外源基因整合入宿主细胞染色体的非病毒载体系统,因此倍受关注,并已开始应用于临床试验[1].     

腺相关病毒载体与中枢神经系统疾病的基因治疗

中枢神经系统疾病分子改变的深入研究和基因治疗技术的不断发展为临床治疗这些疾病带来了希望.但基因治疗临床应用的最大障碍之一便是转基因技术中载体系统的选择.理想的体内基因转移载体应具有较好的细胞靶向性,目的基因表达的可控性以及转移方法的简单易行.自七十年代末病毒载体的概念提出以来,用于基因治疗研究的缺陷性病毒载体种类日渐增加,应用也愈加广泛.其中,腺相关病毒(AAV)载体是目前病毒类转基因系统中较新的成员.由于该系统最大的优点之一是它的安全性较好,并且最有可能发展成为将外源基因整合入宿主细胞染色体的非病毒载体系统,因此倍受关注,并已开始应用于临床试验[1].     

重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达

构建携带变异体二氢叶酸还原酶（mDHFR)和绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的重组腺相关病毒（AAV）载体，并使其在NIH3T3细胞中表达，观察NIH3T3细胞的耐药性变化。先分别扩增mDHFR和GFP基因片段，并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起，插入T载体，酶切后插入AAV载体，包装成病毒后感染NIH3T3细胞，通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察，结果：PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFPcDNA，荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为25％，MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强，结论：AAV载体可将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达，使其对MTX的耐药性增强，为mDHFR基因和AAV载体在基因治疗中的应用提供了理论依据。     

重组9型腺相关病毒载体转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉:最佳在体表达时间点的确定

背景:重组9型腺相关病毒载体对心肌组织具有较高的亲和力,关于携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9-enhanced green fluorescent protein,r AAV9-e GFP)在动脉粥样硬化模型小鼠主动脉中的表达情况还不确定。目的:探索携带r AAV9-e GFP转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉最佳的在体表达时间点。方法:给予30只Apo E-/-小鼠连续高脂饮食饲养16周建立为动脉粥样硬化模型,然后随机取其中25只通过尾静脉注射转染5.0×1011 vg(virus genomes)r AAV9-e GFP,另5只作为对照组给予生理盐水。转染病毒的动脉粥样硬化模型小鼠分别于转染后14,21,28,35,60 d处死,留取主动脉组织,应用激光共聚焦显微镜观察增强型绿色荧光蛋白荧光表达情况,Western blot法检测主动脉增强型绿色荧光蛋白的蛋白表达,观察增强型绿色荧光蛋白体内表达情况,确定病毒在体表达最佳时间点。结果与结论:r AAV9-e GFP可有效转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉血管,增强型绿色荧光蛋白可在主动脉组织中表达,其表达强度随着转染时间的增加而逐渐增强,于转染35 d时表达最强,60 d趋于稳定,各时间点主动脉斑块中增强型绿色荧光蛋白表达的水平差异有显著意义(P<0.001)。表明r AAV9-e GFP可有效在动脉粥样硬化模型Apo E-/-小鼠主动脉中表达,r AAV9-e GFP可成为动脉粥样硬化治疗的最佳载体。     

一种肺血管基因敲减动物模型的构建及在肺动脉高压中的运用

目的 探讨经大鼠的气道注入1型腺相关病毒（AAV1）携带的KLF4-shRNA能否有效构建肺血管基因敲减动物模型以及其在肺动脉高压中的运用。方法 根据大鼠KLF4基因序列，设计针对大鼠特异性的siRNA序列，并以细胞计数和细胞迁移实验加以验证，然后进一步构建AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体。将44只清洁级SD大鼠随机分为4组：健康对照组、盐水模型组、对照病毒载体组、基因敲减组。后3组大鼠分别气管内注入生理盐水（盐水模型组）、AAV1-control vector（对照病毒载体组）、AAV1-KLF4-shRNA（基因敲减组）。1个月后对后3组进行烟熏造模，烟熏4个月后麻醉各组大鼠，分别检测右心室收缩压和平均右心室压，并取肺组织以免疫荧光法观察病毒载体在肺血管中的表达情况，通过PCR方法测定肺动脉中KLF4水平，通过HE染色比较肺小血管中膜厚度评估肺血管肥厚程度。取大鼠心脏计算右心肥厚指数。结果 细胞计数和细胞迁移实验证实选用的KLF4-siRNA链有效。免疫荧光实验显示，经大鼠气道注入的1型腺相关病毒载体均沿肺血管分布。荧光定量PCR实验显示，基因敲减（AAV1-KLF4-...     

腺病毒相关病毒介导基因治疗的研究进展

基因治疗的载体可分为病毒载体和非病毒载体两类.常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒及腺病毒相关病毒(AAV)等.腺病毒相关病毒是一个新的有前景的病毒载体,与逆转录病毒和腺病毒相比,具有以下优点:(1)宿主范围广,能感染哺乳类动物(人、鼠、猴、免)的多种类型的细胞.     

携带编码人血管内皮生长因子165的重组腺病毒能促进伤口愈合

基因治疗为加快因感染和代谢紊乱等难愈性创面的治愈提供了诱人的前景 ,而在难愈合创面诱导新生血管产生是重要的治疗目标。意大利的里雅斯特分子药理实验室的科研人员通过将腺病毒 (AAV )作为相关载体 ,在创面中表达与血管内皮生长因子 A(VEGF A)同源的 16 5氨基酸的方法 ,研究基因治疗促进组织愈合的有效性。通过基因标记 ,研究者发现 ,AAV载体可以有效地将 VEGF A基因转移到鼠皮上 ,并在皮岛中有特异性的表达 ,而且在 AAV载体中 ,VEGF A基因的表达持续而稳定 ;VEGF16 5基因的导入可以使鼠的全层切割伤口出现明显的血管增生 ,…     

帕金森病猴三重基因共转导的初步实验研究

目的:初步探讨多巴胺合成酶基因的三重共转导对帕金森病猴基因治疗的效果。方法:使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(menthyl-phenyl-tetrahydropyridine,MPTP)诱发帕金森病猴模型,以复合感染的方式将分别构建编码酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)、芳香族氨基酸脱羧酶(aromaticL-aminoaciddecarboxylase,AADC)和三磷酸鸟苷环水解酶I(GTPcyclohydrolase,GCH)基因的腺伴随病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体,通过立体定向法注入帕金森病猴一侧壳核内。观测基因转导后猴行为改善的情况达1个月,并采用免疫组化方法确定TH,AADC和GCH基因在猴纹状体内的表达。结果:组织学依据显示AAV载体所介导的TH,AADC和GCH基因均可在猴纹状体内有效表达;三重基因转导可引起帕金森病猴显著的行为改善。结论:不同种类的AAV载体介导的3种治疗基因共转导对帕金森病基因治疗的临床应用将可能是一种切实可行的有效途径。     

rAAV1-Luc病毒制备及体外转染大鼠心肌细胞的研究

【目的】制备携带萤火虫荧光素酶基因的重组AAV1病毒（rAAV1-Luc）,观察该病毒载体体外转染大鼠心肌细胞培养细胞。【方法】通过“一株载体细胞／一株辅助病毒”的双因素包装策略制备出rAAV1-Luc,AAV1-Luc按转染复数（MOI）1×10^2、1×10^3、1×10^4、1×10^5、1×10^6、2×10^6v．g.／cell转染大鼠心肌细胞（H9C2细胞）96h后,检测荧光素酶的表量,并在光镜下观察转染后细胞生长形态。【结果】成功的制备了重组AAV1-Luc;rAAV1-Luc能有效地转染H9C2细胞,转染后,细胞生长及形态正常;一定范围内,随着rAAV1-Luc转染细胞的MOI（即每个细胞感染的病毒基因组数）值增高,荧光素酶的表达水平也增高,MOI为1×10^6但表达量达到最高,更高的MOI（大于10^7）反而使荧光素酶的表达水平下降。【结论】本研究为开展rAAV1载体介导转移心肌细胞的基因治疗打下了良好的基础。