Vasohibin-2慢病毒过表达载体的构建及相关增殖功能研究

目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响?方法:通过逆转录?PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ双酶切后再连接到Lv-CMV-EGFP vector中,并对重组后的质粒进行双酶切和测序分析;VASH2过表达载体?pVSV-G及delta8.91 3个质粒共转染293T细胞,获得慢病毒感染肝癌细胞株HepG2,经流式细胞仪分选阳性细胞;提取细胞总RNA和总蛋白,利用real-time PCR和Western blot鉴定稳转细胞株中VASH2的表达,用MTT法和细胞周期法检测各组HepG2的增殖能力?结果:成功构建VASH2慢病毒过表达载体,感染肝癌细胞株HepG2后能够稳定高表达VASH2;稳定高表达VASH2的HepG2增殖能力明显增强(P < 0.05)?结论:成功构建了VASH2慢病毒过表达载体,并发现VASH2可以促进HepG2的增殖能力,这为进一步研究VASH2在肝癌中的功能及作用机制奠定了基础?     

小鼠microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体的构建及鉴定

目的 构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体.方法 设计针对microRNA-150前体的过表达基因片段及针对microRNA-150成熟体的反义片段,应用基因重组技术将目的 基因片段克隆到pWPI慢病毒载体中,并进行DNA测序鉴定重组克隆.结果 菌落PCR筛选鉴定出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确.结论 成功构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体,为研究microRNA-150在肝再生中的作用及其机制提供了稳定的细胞转染载体.     

miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。     

大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建Tmub1基因的过表达慢病毒载体(LV-Tmub1),为研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料.方法 化学合成Tmub1基因序列,用BamHI/AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体,PCR产物连接入线性化表达的载体.PCR鉴定引物,再对PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析.使用构建的LV-Tmnb1,转染293T细胞,荧光法检测构建的慢病毒滴度.结果 成功构建了LV-Tmub1,并获得相应的病毒,病毒滴度为2×108 TU/mL.结论 LV-Tmub1为进一步研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础.     

人晶状体上皮细胞BHMT基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)基因过表达慢病毒载体,并检测其在人晶状体上皮细胞中的表达效果。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增制备目的基因片段,构建BHMT慢病毒过表达载体,转染至293T细胞。运用免疫荧光法行病毒滴度检测,并利用荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,运用RT-PCR、Western blot检测鉴定BHMT mRNA蛋白的表达水平。将构建成功的慢病毒载体BHMT-GV358感染人晶状体上皮细胞,观察目的基因表达。结果:重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光,在稳定转染的细胞中BHMT及蛋白的表达水平较未转染细胞显著增高(P<0.05),体外转染人晶状体上皮细胞,荧光显微镜下可见BHMT表达。结论:成功构建过表达BHMT的慢病毒载体,并有效感染人晶状体上皮细胞,为进一步研究BHMT在白内障发生发展中的作用提供生物学基础。     

Rho鸟苷酸解离抑制因子-2过表达载体的构建与慢病毒包装

目的:为研究β2肾上腺素能受体减敏的机制,构建Rho鸟苷酸解离抑制因子-2(Rho GDI2)过表达慢病毒载体.方法:GenBank搜索Rho-GDI2基因序列(Gene ID:14570,序列号:NM_008113),设计PCR引物扩增目的基因,双酶切后凝胶电泳回收酶切产物.质粒双酶切获得线性载体,将目的基因和线性载体进行琼脂糖凝胶电泳分离回收目的条带.再行目的基因和载体的连接,连接产物转化感受态细胞;菌液PCR阳性克隆鉴定并抽提质粒并测序.最后293T细胞内包装慢病毒质粒并测其病毒活力与滴度.结果:通过DNAStar SeqMan软件对测序结果进行分析,测序结果与目标序列一致.病毒质粒转染细胞效率较高,病毒活力较高,通过标准曲线测得病毒滴度pLenti-GDI慢病毒液:1.22×108 vp/mL.结论:成功构建了Rho GDI2过表达慢病毒载体.     

p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的 构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果 通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重...     

PRMT2慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)慢病毒表达载体。方法通过PCR扩增PRMT2 c DNA,将PRMT2 c DNA连接于GV308载体,经测序确认后,将GV308/PRMT2与p Helper 1.0和p Helper 2.0共转染至293T细胞中,收获病毒,通过Real time PCR测定滴度;将PRMT2慢病毒表达载体侵染293T细胞,通过四环素诱导和Western blot检测PRMT2慢病毒表达载体的表达能力。结果在感染PRMT2慢病毒载体293T细胞中能检测到PRMT2-3Flag融合蛋白的表达。结论成功构建PRMT2的慢病毒表达载体。     

CXCL1基因重组慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：采用第2代慢病毒表达载体系统,构建CXCL1基因的慢病毒表达载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法：首先扩增CXCL1全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序,通过BLAST检索,鉴定慢病毒表达载体构建成功。将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48h后荧光显微镜鉴定,慢病毒转染并包装成功。结果：重组慢病毒质粒CXCL1-pWPI测序结果经BLAST对比分析,与CXCL1基因的同源性达100％。结论：成功的构建了CXCLl基因的重组慢病毒表达系统。     

Purα基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建及应用

目的 构建Purα基因过表达以及SiRNA慢病毒表达载体,通过包装病毒,以用于神经系统细胞感染及原代培养神经元的基因操作.方法 1）过表达载体的构建：本实验使用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体,PCR扩增Purα全长基因,然后亚克隆到pCDH载体相应的多克隆位点之中,进行酶切和测序鉴定;2）ShRNA慢病毒表达载体的构建：根据shRNA的特征,设计shR-NA的DNA序列以及其反向互补序列,然后合成并克隆到慢病毒载体pLKO.1-puro的相应位点中.3）慢病毒包装和滴度测定：将克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1-puro-shRNA载体和病毒包装质粒pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr按相应的比例转染到293FT细胞中,48h后收集上清液,纯化、浓缩,进行滴度测定.结果 测序结果证实所插入片段相位正确,转染后通过RT-PCR和Western blot证实过表达组Purα基因表达增高,而沉寂组的Purα表达抑制,达到实验设计要求,可以用于实验研究.结论 利用本方法可以快速地进行目的基因的基因操作,省时、节约,与同类型的方法比较,具有较大的优越性,可以在实验中推广应用.     

Ang2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建促血管生成素(Ang)2基因的RNAi慢病毒表达载体,并鉴定其正确性。方法将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒与经XbaⅠ酶切电泳鉴定的嗜中性多形核白细胞-绿色荧光蛋白转移质粒(pNL-EGFP)载体连接,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-siR-NA慢病毒转移质粒,再以pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白包膜质粒和包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,证明Ang2-siRNA核苷酸序列插入的正确性。利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Ang2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Ang2基因的RNAi慢病毒表达载体,为下一步进行干扰体内外恶性黑素瘤Ang2的表达奠定基础。     

小鼠miRNA-203慢病毒过表达载体的构建及病毒包装与滴度测定

目的构建microRNA-203（miR-203）过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定。方法利用化学合成miR-203发夹前体结构RNA（small hairpin RNAs,hRNA）,并将其克隆入pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定;利用脂质体将鉴定的阳性重组pSicoR-miR-203表达载体、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三个质粒共转染到HEK-293T细胞,分别在48h和72h收获上清,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染293T细胞,检测病毒滴度,并将制备的病毒颗粒尾静脉注射Balb/c小鼠,检测miR-203在小鼠体内的表达与分布情况。结果酶切及测序结果证明成功构建了pSicoR-miR-203重组质粒,并成功的包装成慢病毒,病毒滴度为5×107 TU.mL-1。重组病毒在Balb/c小鼠肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均有表达。结论成功构建miR-203慢病毒表达载体,获得高效表达miR-203的慢病毒颗粒,为miR-203靶基因筛选及其功能的研究奠定了基础。     

小鼠甲基转移酶EZH2基因慢病毒表达载体的构建及验证

目的 构建小鼠组蛋白H3 K27三甲基转移酶EZH2基因慢病毒载体及鉴定.方法 以携带EZH2 cDNA的PCMV-SPORT6载体为模板,自行设计携带有Kpnl和Xmal酶切位点的引物PCR扩增出目的基因编码序列,扩增产物用内切酶酶切后定向克隆到慢病毒载体PLenti-eGFP-NEO中,通过PCR、酶切及测序验证载体;将重组慢病毒载体和包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE及pMD2G组成的四质粒系统,共转染293T细胞包装成慢病毒,收集含病毒颗粒的细胞上清液,浓缩和纯化后得到高效价的病毒液,转染293T细胞进行效价测定.结果 PCR扩增出约2241 bp的序列,构建的慢病毒载体测序结果与Genebank报道的目的基因序列一致;四质粒系统成功共转染入293T细胞中,在细胞中能够稳定表达,包装出了2.1×108TU/ml的病毒液.结论 成功构建了小鼠EZH2基因慢病毒载体,并得到2.1×108TU/ml高效价的病毒液.     

HRSP12慢病毒表达载体的构建及对宫颈癌HeLa细胞凋亡及增殖的影响

目的 构建热反应蛋白12（heat-responsive protein 12,HRSP12）慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装慢病毒颗粒并感染宫颈癌细胞HeLa,分析过表达的HRSP12对HeLa细胞凋亡和增殖的影响.方法 用反转录PCR扩增HRSP12全长编码顺序,构建慢病毒表达载体,利用人胚肾细胞HEK293T包装重组的慢病毒颗粒,感染HeLa细胞,用蛋白免疫印迹法检测剪切的半胱氨酸/天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）并用MTS比色法检测HeLa细胞增殖的情况.结果 编码全长HRSP12的cDNA片段为414bp,克隆至pWPI-linker载体成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装的慢病毒颗粒能够高效感染HeLa细胞,在细胞内表达Flag-HRSP12融合蛋白.HRSP12的过表达能够引起HeLa细胞caspase-3的剪切体增多,能够抑制HeLa细胞的增殖.结论 成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,初步结果表明,HRSP12可能具有诱导HeLa细胞凋亡、抑制细胞增殖的活性,为进一步研究HRSP12的生物学功能奠定了基础.     

鼠VEGF红色荧光慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建含鼠血管内皮细胞生长因子(mVEGF)红色荧光慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达.方法 构建含mVEGF和红色荧光蛋白(DsRed)基因双顺反子重组慢病毒质粒;采用脂染法将慢病毒系统三质粒共转染293T细胞,转染后24 h和48 h荧光显微镜下观察DsRed表达,收集48 h 和72 h病毒上清并感染靶细胞239T,荧光显微镜下观察DsRed表达情况,并行Western blot分析培养上清和胞浆内mVEGF表达.结果 成功构建慢病毒表达质粒pTK208-mVEGF-IRES-DsRed,重组慢病毒滴度达5×106 PFU/ mL,并获得蛋白DsRed和mVEGF的表达.结论 含mVEGF红色荧光慢病毒质粒成功介导mVEGF蛋白的表达,该载体有望为研究VEGF的病理生理学机制及基因靶向治疗提供有效的工具.     

慢病毒载体及其在血液病研究中的应用进展

慢病毒载体是近年来发展极其迅速的基因载体,对分裂及非分裂细胞均具有感染力强大、能容纳大片段外源目的基因、基因持续表达、宿主免疫反应小等优点。近年来对慢病毒载体的研究日渐深入,慢病毒载体在血液系统相关疾病的研究中也得到广泛的应用。现对慢病毒载体及其在血液系统疾病研究中的应用予以综述。     

Dnd1慢病毒表达载体的制备及鉴定

目的:构建小鼠Dnd1慢病毒表达载体,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达。方法:设计引物引入AgeⅠ酶切位点,使用PCR方法从质粒pcDNA3.1-Dnd1中扩增小鼠Dnd1基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化。用In-Fusion技术将AgeⅠ内切酶消化后目的片段交换连接入AgeI酶切的pGC-FU载体,构建Dnd1慢病毒表达载体pGC-FU-Dnd1。酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-FU-Dnd1与慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,Western-blot验证Dnd1在转染293T细胞中表达。结果:通过PCR扩增获得了Dnd1基因,将Dnd1克隆到慢病毒转移质粒pGC-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论:成功构建了Dnd1慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨Dnd1功能奠定了基础。     

Jmjd3基因慢病毒干扰载体的构建及其去H3K27三甲基化作用研究

目的 构建针对小鼠Jmjd3基因的RNAi慢病毒载体,感染小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells,mBM-MSCs)后观察其对Jmjd3基因表达的影响及对组蛋白H3K27me3的去甲基化作用.方法 根据Jmjd3mRNA序列设计并合成3对shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入PLL3.7慢病毒干扰载体,双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,重组质粒与其他3种辅助包装质粒(pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G)共转染293T细胞生产病毒液,病毒液感染mBM-MSCs,荧光定量PCR和Western blot检测目的基因Jmjd3的表达,筛选出最有效的干扰序列.Western blot检测组蛋白H3 K27 me3的表达量,分析Jmjd3的生物学功能.结果 双酶切和测序结果证实Jmjd3基因shRNA序列正确插入慢病毒载体.荧光定量PCR和Western blot结果显示,感染后Jmjd3表达显著下调,与空载体对照组相比,Jmjd3-shRNA1组、Jmjd3-shRNA2组和Jmjd3-shRNA3组分别下调88.9％ (P ＜0.001)、67.9％ (P ＜0.001)和72.4％ (P ＜0.001),Jmjd3-shRNA1组为最佳干扰组.Western blot结果显示干扰Jmjd3之后,H3K27me3的表达较空载体对照组升高.结论 成功构建了针对小鼠Jmjd3基因的慢病毒干扰载体,并能有效抑制mBM-MSCs中Jmjd3基因的表达,Jmjd3具有组蛋白H3K27me3的去甲基化作用.     

携带人尾型同源盒基因-2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建尾型同源盒基因-2(CDX2)基因的慢病毒表达载体并进行鉴定。方法 PCR扩增CDX2基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pWPI,通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒。重组质粒转染包装细胞293T后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染直肠癌细胞XB1847,经PCR和Western Blot证明重组慢病毒携带的CDX2在XB1847细胞内表达的情况。结果经PCR扩增、酶切及测序验证,重组质粒构建成功,命名为pWPI-CDX2。PCR和Western Blot证明重组慢病毒感染XB1847细胞后CDX2能稳定表达。结论成功构建了携带CDX2的慢病毒载体,为研究CDX2在直肠癌中的功能提供了实验基础。     

Hsa-microRNA-138慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建hsa-microRNA-138慢病毒表达载体。方法:PCR扩增pri-miR-138-2前体序列,克隆至plenti-GFP慢病毒表达载体,双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装与滴度检测;构建成功后感染人胰腺癌细胞PANC-1,48 h后Real-time Q-PCR检测miR-138的表达。结果:酶切、测序鉴定证明插入序列正确,测定病毒滴度为1×109TU/ml,病毒感染48 h后的PANC-1胰腺癌细胞观察可见绿色荧光,Real-time Q-PCR显示被感染细胞的miR-138表达量较未感染细胞显著增高。结论:建立了高效稳定表达hsa-miR-138的慢病毒转染系统。