神经母细胞瘤增殖凋亡的研究

目的　本实验通过研究神经母细胞瘤的增殖、凋亡的失衡 ,结合神经母细胞瘤的分化 ,以探讨增殖、凋亡的改变与神经母细胞瘤预后的关系。方法　分别取正常对照组、良性肿瘤组、恶性肿瘤组 3组组织制作石蜡切片 ,运用免疫组织化学法检测增殖细胞 ,计算增殖细胞占细胞百分比 ,求得增殖指数 (PI)。运用原位DNA末端标记法 ,检测凋亡细胞 ,计算凋亡细胞占细胞百分比 ,求得凋亡指数 (AI)。结合神经母细胞瘤的组织学分类 ,了解增殖指数、凋亡指数与神经母细胞瘤预后情况。结果　预后好的组织与预后差的组织 2组的PI相比P <0 .0 1。预后好的组织与预后差的组织两组的AI相比P <0 .0 1。Ⅲ期或Ⅳ期死亡与健在分别PI相比较P <0 0 1。Ⅲ期或Ⅳ期死亡与健在分别AI相比较P <0 0 1。结论　PCNA指数越高 ,神经母细胞瘤预后越差。凋亡细胞和凋亡小体越多 ,凋亡指数越高 ,神经母细胞瘤预后越好。联合检测神经母细胞瘤的增殖指数、凋亡指数结合凋亡小体可提高对神经母细胞瘤诊断及预后判断的准确性 ,并对治疗指导有重要价值     

神经母细胞瘤相关基因DDX1研究进展

摘 要：神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是儿童常见恶性肿瘤之一。MYCN基因扩增与NB不良预后密切相关,但MYCN基因作为NB临床诊断重要分子标志物存在一定局限性。研究表明,与MYCN基因邻近的DEAD box 1基因（DDX1）在NB中存在与MYCN共扩增现象。DDX1蛋白是DEAD box家族中一员,目前研究显示其可能是一种依赖ATP的RNA解螺旋酶,与肿瘤发生发展关系密切,但DDX1基因对NB的作用尚不清楚,且DDX1与MYCN基因共扩增对NB患者预后影响也存在分歧。文章根据目前DDX1基因与NB研究进展,对DDX1与NB关系进行综述。     

IFNγ对TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的调节作用

目的:探讨IFNγ(γ-干扰素)对TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)诱导神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y凋亡的影响及其发生机制.方法:应用RT-PCR方法检测IFNγ作用前后SY5Y细胞Caspase 8的表达;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及流式细胞仪(FCM)检测IFNγ、TRAIL、IFNγ TRAIL及IFNγ Caspase 8抑制剂 TRAIL对SY5Y细胞生长及凋亡的影响;应用透射电镜对凋亡细胞进行形态学观察.结果:SY5Y细胞不表达Caspase 8,IFNγ作用48h后的SY5Y细胞Caspase 8表达明显增加;SY5Y细胞对TRAIL不敏感,经IFNγ诱导表达Caspase 8的SY5Y细胞对TRAIL敏感,且与TRAIL浓度有关,Caspase 8抑制剂可明显降低TRAIL对表达Caspase 8的SY5Y细胞的杀伤作用;透射电镜可见到典型的细胞凋亡特征.结论:IFNγ可逆转SY5Y细胞对TRAIL诱导凋亡的耐受,其发生机制可能是IFNγ通过上调SY5Y细胞Caspase 8表达而实现的.     

TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡中 Caspase 8活性的变化

目的：探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导神经母细胞瘤细胞株CHP212细胞凋亡过程中Caspase 8活性的变化.方法：应用流式细胞仪检测TRAIL、Caspase 8抑制剂（zIETD-FMK）＋TRAIL对CHP212细胞的诱导凋亡作用 应用比色法测定Caspase 8相对活性 应用透射电镜对凋亡细胞进行形态学观察.结果：CHP212细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感，存在剂量依赖性.随TRAIL作用时间的延长，Caspase 8活性逐步升高，于作用16h达高峰 不同浓度TRAIL处理组Caspase 8相对活性随浓度增加而递增.zIETD-FMK能阻断Caspase 8的活化而抑制TRAIL对CHP212细胞的诱导凋亡作用.透射电镜可见到典型的细胞凋亡特征.结论：TRAIL通过Caspase 8信号传导通路诱导CHP212细胞凋亡并伴随Caspase 8活性增高.     

MYCN基因与PHOX2B基因联合检测对高危神经母细胞瘤患儿危险度及预后的评估价值

目的 探讨MYCN基因与PHOX2B基因联合检测在高危神经母细胞瘤(NB)患儿危险度与预后评估中的应用价值。方法 选取106例高危NB患儿,于初诊时检测MYCN、PHOX2B基因的表达情况,分析两项指标与患儿病理特征的关系,并在化疗6个疗程后随访1年,以Kaplan-Meier法分析MYCN基因与PHOX2B基因与患儿预后的关系。结果 106例患儿中MYCN基因扩增60例(56.60%),PHOX2B基因阳性45例(42.45%)。MYCN基因扩增患儿初诊时乳酸脱氢酶(LDH)≥1500 U/L占比高于基因正常患儿,PHOX2B基因阳性患儿中肿瘤转移部位≥3个与高神经元特异性烯醇化酶(NSE)≥370μg/L占比高于基因阴性患儿,差异有统计学意义(P<0.05)。Kaplan-Meier结果显示：MYCN基因扩增患儿与PHOX2B基因阳性患儿的1年生存率分别为48.33%(29/60)、44.44%(20/45),明显低于MYCN基因正常患儿65.22%(30/46)与PHOX2B基因阴性患儿63.93%(39/61),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MYCN基因与...     

IFN-γ联合阿霉素或依托泊苷增强TRAIL对神经母细胞瘤细胞的诱导凋亡作用

  目的  探讨半胱-天冬氨酸蛋白酶8(Caspase 8)和死亡受体(DR)在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导神经母细胞瘤(NB)细胞凋亡中的作用。  方法  应用RT-PCR方法检测γ干扰素(IFN-γ)作用前后NB细胞Caspase 8 mRNA的表达; 应用Western blot方法检测Caspase 8、DR4和DR5蛋白表达; 应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及流式细胞术检测IFN-γ, TRAIL, IFN-γ+TRAIL, Caspase 8抑制剂+TRAIL及IFN-γ+阿霉素/依托泊苷+TRAIL对NB细胞株生长及凋亡的影响。  结果  IFN-γ在NB细胞株SKNDZ中诱导了Caspase 8mRNA及蛋白表达。SY5Y细胞对TRAIL不敏感, 而IFN-γ与TRAIL或阿霉素, 依托泊苷联用对SY5Y细胞有明显诱导凋亡作用。IFN-γ+TRAIL组SY5Y细胞早期凋亡率(23.09+2.35)%高于TRAIL组[(6.15±0.54)%(P< 0.01)], 但低于IFN-γ+阿霉素/依托泊苷+TRAIL组[(43.41±6.46)%/(38.86±7.29)%, P< 0.01]。阿霉素或依托泊苷可以诱导NB细胞株DR5蛋白表达, 但未诱导DR4蛋白表达。IFNγ诱导后表达Caspase 8的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用仍不敏感, 而阿霉素或依托泊苷处理后同时表达DR5的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用相对敏感。IFN-γ+阿霉素/依托泊苷+TRAIL组SKNDZ细胞早期凋亡率(11.54±2.49)%/(13.38±1.65)%高于IFN-γ+TRAIL组(P< 0.01)。  结论  IFN-γ上调Caspase 8表达及化疗药阿霉素或依托泊苷诱导DR5表达可以恢复NB细胞对TRAIL的敏感性, Caspase 8和DR5在TRAIL诱导NB细胞凋亡中起着十分关键的作用。      

三氧化二砷诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的线粒体机制

目的探讨三氧化二砷(As2O3)诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞凋亡效应及其对线粒体膜电位的影响。方法比色法观察As2O3对神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖的影响;AnnexinⅤ荧光探针和流式细胞仪检测早期凋亡细胞;罗丹明123(Rhodamine123)荧光探针染色后,荧光显微镜下观察活细胞线粒体改变,并经流式细胞仪分析线粒体膜电位变化。结果As2O3明显抑制SK-N-SH细胞的增殖;As2O3诱导SK-N-SH细胞早期凋亡时线粒体膜电位降低。结论降低线粒体膜电位可能是As2O3诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的机制之一。     

神经母细胞瘤增殖、凋亡与休眠消退的相关性研究

目的：本实验通过研究神经母细胞瘤的增殖、凋亡的改变，结合神经母细胞瘤的分化，以探讨增殖、凋亡的改变与神经母细胞瘤休眠消退的关系。方法：肿瘤休眠消退组：神经母细胞瘤休眠消退6例，男4例，女2例。取组织制作成石蜡切片，运用免疫组织化学方法检测增殖细胞，计算增殖细胞占细胞百分比，求得增殖指数（PI）。运用原位DNA末端标记法，检测凋亡细胞，计算凋亡细胞占细胞百分比，求得凋亡指数（AI）。结果：休眠消退病例中5例凋亡指数大于9％，5例增殖指数大于13％，6例增殖率减凋亡率均小于4％。结论：增殖指数小于13％，凋亡指数大于9％，特别是增殖指数减凋亡指数小于4％，神经母细胞瘤休眠消退的可能性大。     

加温联合钙剂诱导人神经母细胞瘤 SK-H-SN细胞凋亡的研究

目的探讨加温联合钙剂对诱导 SK-H-SN 细胞凋亡的作用及其意义.方法采用 3 种温度和 4 种浓度的外源性氯化钙(CaCl2)诱导 SK-H-SN 细胞凋亡.采用形态学观察、原位缺口末端标记(TUNEL)的方法检测细胞凋亡的结果,并用火焰原子吸收分光光度法测定细胞内钙含量([Ca]i).结果加温和/或加钙均可诱导 SK-H-SN 细胞凋亡.在有外源性钙剂存在时,加温可明显升高[Ca]i.同一温度下,各组的凋亡率(APO%)和[Ca]i均随外源性 CaCl2浓度的升高而升高;同一 CaCl2浓度下,APO% 和[Ca]i均随温度的升高而升高.析因设计的方差分析结果显示,加温和加钙在诱导细胞凋亡时有很强的协同作用,P<0.01.APO% 和[Ca]i之间呈正相关,r=0.983,P<0.01.结论加温和加钙在诱导 SK-H-SN 细胞凋亡方面有很强的协同作用,APO% 和[Ca]i呈正相关,通过增加[Ca2+]i 来诱导凋亡可认为是加温诱导凋亡的机制之一.     

逆转录病毒介导的凋亡素基因诱导人结肠癌细胞Lovo的凋亡

目的 构建强力霉素诱导型重组凋亡素基因逆转录病毒载体,观察强力霉素诱导凋亡素基因表达的情况及对人结肠癌细胞的影响。方法 构建重组逆转录病毒表达载体pRevTRE-VP3。调节载体pRevTet-on和表达载体pRevTRE-VP3分别转染PT67包装细胞后,收集包装好的病毒依次感染人结肠癌细胞系Lovo,用抗生素筛选出抗性细胞株Lovo/on-vp3。通过向培养液中加入或去除强力霉素调控凋亡素基因在Lovo/on-vp3细胞中的表达,Annexin V-FITC/PI双染色后,以流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 经酶切和测序鉴定,重组逆转录病毒载体pRevTRE-VP3构建成功,并添加了kozak序列。筛选出可经四环素调控凋亡素基因表达的人结肠癌细胞株Lovo/on-vp3,经PCR和RT-PCR证实凋亡素基因已整合入细胞DNA,并得到了表达;Lovo/on-vp3细胞在1mg/L强力霉素培养环境中培养24h、48h和72h凋亡率明显高于无强力霉素环境中相同时间点的细胞凋亡率,两者差异有显著性。结论 凋亡素基因经RevTet系统导入人结肠癌细胞Lovo后,在强力霉素诱导下可表达凋亡素蛋白并诱导Lovo细胞凋亡。并随诱导时间延长凋亡素蛋白表达增加、细胞凋亡增多。     

Evaluation of BAX and BCL-2 Gene Expression and Apoptosis Induction in Acute Lymphoblastic Leukemia Cell Line CCRFCEM after High- Dose Prednisolone Treatment

Objective: Glucocorticoids are one of the most important drugs in the treatment of acute lymphoblastic leukemiafor children. It is very important to response to glucocorticoid in the prognosis of these patients. Therefore, resistanceto treatment is a major problem in lymphoid leukemia cases. In, this study, CCRF-CEM cell line was selected as achemotherapy-resistant model. The aim of this study was to evaluate the effect of high dose prednisolone on inductionof apoptosis and changes in BAX and BCL-2 gene expression at different times. Methods: CCRF-CEM cell lines weregrown in standard conditions. Based on previous studies, a dose of 700 μM as subtoxic dose was selected. Changes ingene expression of BAX and BCL-2 were evaluated by using real time PCR techniques. Also stained with annexin Vand the induction of apoptosis was assessed by FACS machine. Results: In this study it was found that prednisolone inhigh doses at different times significantly increased the gene expression of BAX and on the other hand the amount ofBCL-2 expression was reduced. Cells that treated for 48 hours had more significant changes in gene expression. Basedon flowcytometry data, prednisolone can induce apoptosis in a time dependent manner on this cancerous resistant cellline. Conclusions: Apoptosis induced by high-dose prednisolone in the CCRF-CEM cells, which is almost resistant,and possibly mediated by reducing the expression of BCL-2 and BAX up-regulation.     

Induction of Apoptosis and Cell Cycle Arrest by Dorema Glabrum Root Extracts in a Gastric Adenocarcinoma (AGS) Cell Line

Objective: Dorema glabrum Fisch. & C.A. Mey is a perennial plant that has several curative properties. Anti-proliferative activity of seeds of this plant has been demonstrated in a mouse fibrosarcoma cell line. The aim of the present study was to evaluate cytotoxicity of D. glabrum root extracts in a human gastric adenocarcinoma (AGS) cell line and explore mechanisms of apoptosis induction, cell cycle arrest and altered gene expression in cancer cells. Materials and Methods: The MTT assay was used to evaluate IC50 values, EB/AO staining to analyze the mode of cell death, and flow cytometry to assess the cell cycle. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) amplification was performed with apoptosis and cell cycle-related gene primers, for cyclin D1, c-myc, survivin, VEGF, Bcl-2, Bax, and caspase-3 to determine alteration of gene expression. Results: Our results showed that n-hexane and chloroform extracts had greatest toxic effects on gastric cancer cells with IC50 values of 6.4 μg/ml and 4.6 μg/ml, respectively, after 72 h. Cell cycle analysis revealed that the population of treated cells in the G1 phase was increased in comparison to controls. Cellular morphological changes indicated induction of apoptosis. In addition, mRNA expression levels of Bax and caspase-3 were increased, and of bcl-2 survivin, VEGF, c-myc and cyclin D1 were decreased. Conclusion: Our study results suggest that D. glabrum has cytotoxic effects on AGS cells, characterized by enhanced apoptosis, reduced cell viability and arrest of cell cycling.     

Evaluation of Apoptotic Gene Expression in Hepatoma Cell Line (HepG2) Following Nisin Treatment

Objective: The present study aims to examine the effects of nisin on the survival and apoptosis of the hepatoma cell line HepG2 and to investigate possible apoptosis pathways activated by nisin. Materials and Methods: For this purpose, viability and apoptosis of the cells were accomplished by the nisin treatment using the MTT assay and Annexin-V-fluorescein/propidium iodide (PI) double staining, respectively. Additionally, the human apoptosis PCR array was performed to determine pathways or genes activated by nisin during possible apoptosis. Results: The results of the present study showed that nisin was able to decrease cell viability (IC50 ~ 40 µg/ml) in a dose-dependent manner and could induce apoptosis in HepG2 cells. PCR data indicated a considerable increase in the expression of genes, such as caspase and BCL2 families, involved in the induction of apoptosis. Conclusions: The data from this study showed that overexpression of genes involved in the intrinsic pathway of apoptosis, especially caspase-9 and BID, increased apoptosis in HepG2 cells treated by nisin, compared to the control group.     

bcl-2反义寡核苷酸对肾癌细胞Bcl-2蛋白表达抑制及诱导凋亡作用

目的:经Beagle犬肝脏血管注射重组腺病毒介导反义c-myc基因(Ad-ASmyc)载体,观测其体内分布及毒副作用,以评价Ad-ASmyc治疗肝癌的临床前期安全性.方法:选择4只体重8～10kg健康Beagle犬,全麻后开腹,经肝动脉或门静脉注射Ad-ASmyc,注射Ad-ASmyc前及注射后第3,7,14,21天取肝组织及抽取静脉血化验,PCR检测Ad-ASmyc在各器官组织中的分布,常规切片观察各器官病理变化,ELISA方法检测血中抗腺病毒抗体的产生.结果:经Beagle犬肝脏血管注射后,Ad-ASmyc可持续转导正常肝细胞达3周,实验犬一般情况好,血、肝、肾功能无明显异常,在肝脏、脾脏、肾脏、胃、心脏、皮肤中可检测到重组腺病毒的分布,镜下可见Ad-ASmyc剂量依赖性的肝组织轻微的炎症反应,注射后7d血中有抗腺病毒载体的抗体产生,14d达高峰,21d开始下降.结论:经Beagle犬肝动脉或门静脉途径注射Ad-ASmyc均可转导至肝细胞,Ad-ASmyc对实验犬的毒副作用较轻.     

表没食子儿茶素没食子酸酯诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡及机制

[目的]探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡的生物学效应及抗肿瘤机制.[方法]通过MTT还原法检测EGCG对该细胞系生长的影响;用普通光镜、流式细胞仪和DNA断裂片段分析研究EGCG诱导的细胞凋亡.S-P免疫组化法检测细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达.[结果]EGCG能抑制MGC-803细胞的生长,抑制作用呈时间和剂量依赖性关系;EGCG处理MGC-803细胞后,普通光镜下细胞呈凋亡特征性改变;流式细胞仪示同一时间不同浓度EGCG(60、80、100、120μmol/L,48h)处理MGC-803细胞和同一浓度不同时间(80μmol/L,48、72h)处理MGC-803细胞,亚G1期细胞都逐渐增多;MGC-803细胞经EGCG(80、100、120μmol/L,48 h)后,其DNA电泳图中出现梯形条带;S-P免疫组化结果表明80μmol/L EGCG处理细胞48h后,Bcl-2蛋白表达下降,Bax和Caspase-3蛋白表达升高.[结论]EGCG有诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡的作用,其机制可能与Bax/Bcl-2比值增高导致Caspase-3的活化从而启动细胞凋亡有关.     

人参皂甙-Rh2诱导人肝癌Bel-7404细胞凋亡的作用

目的 研究人参皂甙-Rh2(GS-Rh2)诱导肝癌Bel-7404细胞凋亡的作用。方法 应用流式细胞术检测GS-Rh2对肝癌Bel-7404细胞凋亡的诱导作用以及对细胞周期的影响。结果 流式细胞术证实GS-Rh2具有诱导凋亡作用。细胞凋亡（AR）随GS-Rh2浓度增高和作用时间延长而升高，当GS-Rh2浓度由12.5μg/ml增至50.0μg/ml时，AR由16.2%升高至27.5%，但GS-Rh2浓度由50.0μg/ml进一步增至100.0μg/ml后，AR未见相应升高；GS-Rh2可将细胞周期阻滞于G1期。结论 GS-Rh2能诱导体外培养的Bel-7404细胞凋亡；GS-Rh2诱导Bel-7404细胞凋亡可能与细胞周期阻滞有关。     

RNA干扰靶向抑制食管癌细胞株Nucleostemin基因表达

[目的]探讨NHeleostemin（NS）基因特异性RNA干扰对食管癌Eca-109细胞株增殖和凋亡情况的影响。[方法]用NS特异性siRNA表达载体转染食管癌Eca-109细胞株．利用MTT法测试细胞增殖抑制率：RT—PCR法检测NS基因表达量的变化．流式细胞仪法检测细胞周期分布和细胞凋亡情况。[结果]与阴性对照组相比．PCDNA4／C—NS—silencer组细胞的增殖速率降低,24h、48h、72h细胞增殖抑制率分别为57．8％、74．9％、87.3％：NS基因表达量下降,GdG,期细胞百分率显著升高,S期细胞减少,细胞凋亡率增加。[结论]RNAi技术可显著抑制食管癌Eca-109细胞株NS基因表达,导致细胞增殖缓慢．细胞周期阻滞．凋亡增加。