ATRA诱导HPV16型亚基因永生化人宫颈上皮细胞分化的实验研究

目的:研究ATRA对HPV16型亚基因(E6、E7)永生化人宫颈上皮细胞(H8细胞)的诱导分化作用及机制.方法:H8细胞经ATRA处理后,用MTT法测定ATRA的抗增殖效应,光镜、电镜观察细胞形态变化,流式细胞术(FCM)检测细胞周期,免疫组化SABC法检测增殖细胞核抗原Ki67表达水平的变化,PCR-ELISA法检测端粒酶活性变化,荧光免疫细胞化学检测HPV和E6蛋白表达变化.结果:ATRA使H8细胞增殖抑制;细胞形态朝良性方向分化;细胞堆积于G1期,S期细胞减少;细胞核内Ki67的表达水平下降;端粒酶活性下降.结论:ATRA对H8细胞有明显诱导分化作用,这种作用可能是通过抑制增殖,阻滞细胞周期,降低端粒酶活性来实现的.     

木黄酮对宫颈永生化上皮细胞的影响及其对细胞周期的调控机制

目的:观察木黄酮对人宫颈永生化上皮细胞生长的抑制作用,并探讨其调控细胞周期的相关机制.方法:本研究采用人宫颈永生化上皮细胞系(H8细胞),应用磺酰罗丹明B(SRB)法,绘制细胞生长曲线,获得抑制50%细胞生长所需药物浓度(IC50).应用流式细胞仪分析细胞周期.免疫荧光法检测细胞周期调控因子cyclin D1,cyclin B1,CDK4,cdc2和p21的蛋白表达,RT-PCR半定量法检测其mRNA表达.结果:不同浓度的木黄酮对H8细胞有生长抑制作用,并呈剂量依赖关系.木黄酮对H8细胞作用d5的IC50为55μM.木黄酮作用后使H8细胞阻滞于G2/M期.木黄酮作用3d后,开始显著下调H8细胞cdc2的mRNA和蛋白表达(P＜0.05).其对H8细胞cyclin D1、cyclin B1、CDK4和p21的mRNA和蛋白表达均无影响(P＞0.05).结论:木黄酮可以抑制宫颈永生化上皮细胞的生长,其作用机制之一可能是通过下调其cdc2的表达.     

2种PCR方法检测宫颈病变细胞中HPV16型基因

目的探讨荧光定量聚合酶链（Real-ti me fluorescent quantitative PCR,RT-PCR）方法与传统聚合酶链反应（传统-PCR）方法检测宫颈病变组织DNA中人乳头瘤病毒16型（human papillomavirus,HPVl6）基因的异同。方法 143例（其中维吾尔族标本65例,汉族标本78例）宫颈病变组织样本,均经甲醛固定-石蜡包埋处理。样本分为维、汉2组,对所有样本进行DNA提取,后将DNA样本均分为2份。运用传统-PCR和RT-PCR2种方法检测DNA样本中的HPV16基因,比较其检出率的异同。结果 78例汉族妇女宫颈病变组织DNA样本中,传统-PCR方法和RT-PCR方法对HPV16基因型的检出率分别为51.28%和15.38%,差异有统计学意义（χ2=21.778,P〈0.05）;65例维吾尔族妇女宫颈病变组织DNA样本中,传统-PCR方法和RT-PCR方法对HPV16基因型的检出率分别为61.54%和18.46%,差异有统计学意义（χ2=19.184,P〈0.05）。结论无论是汉族还是维吾尔族,传统-PCR方法对HPV16病毒的检出率均高于RT-PCR方法,因此在临床可以推广简便经济的传统-PCR方法检测高危型HPV16,用于防治宫颈癌。     

HPV16 E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮-间叶变

目的研究人乳头状瘤病毒HPV16 E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮-间叶变(EMT),以及发生EMT细胞的生物学特征.方法相差显微镜、微分干涉显微镜观察HPV16 E6/E7永生化口腔上皮细胞系HIOEC细胞形态学改变;透射电镜观察细胞间桥粒形成情况; RT-PCR比较正常口腔上皮细胞和HIOEC细胞中β-catenin、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、wnt-4、wnt-5a、snail基因的转录情况;免疫组化检测HIOEC细胞中细胞角蛋白(CK)、波形蛋白(Vim)的表达.免疫荧光、激光共聚焦显微镜观察Actin 细胞骨架的改变.结果 HIOEC细胞呈梭形成纤维细胞样改变,细胞分散生长;RT-PCR结果显示HIOEC细胞E-cadherin、wnt-4转录水平下调, wnt-5a转录水平上调,β-catenin、snail基因无明显改变.HIOEC细胞共表达CK和Vim.Actin细胞骨架在HIOEC细胞中更显丰富,呈束排列.结论 HPV16 E6/E7永生化口腔上皮HIOEC细胞发生上皮-间叶变,细胞表现间叶细胞的部分生物学特征.     

人巨细胞病毒促进HPV16永生化的宫颈皮细胞癌变研究

探讨宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒和人巨细胞病毒协同感染的关系。方法：本实验应用我国室建立的ＨＰＶ１６永生化的人宫颈上皮细胞系,转染ＨＣＭＶ即早基因。结果：ＨＣＭＶ整合在细胞染色体中,协同ＨＰＶ１６促进宫颈上细胞的恶性化,在裸鼠中形成肿瘤。     

HPV16 E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮-间叶变

目的研究人乳头状瘤病毒HPV16 E6／E7永生化口腔上皮细胞的上皮-间叶变(EMT)，以及发生EMT细胞的生物学特征。方法相差显微镜、微分干涉显微镜观察HPV16 E6／E7永生化口腔上皮细胞系HIOEC细胞形态学改变；透射电镜观察细胞间桥粒形成情况；RT-PCR比较正常口腔上皮细胞和HIOEC细胞中β-catenin、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、wnt-4、wnt-5a、snail基因的转录情况；免疫组化检测HIOEC细胞中细胞角蛋白(CK)、波形蛋白(Vim)的表达。免疫荧光、激光共聚焦显微镜观察Actin细胞骨架的改变。结果HIOEC细胞呈梭形成纤维细胞样改变，细胞分散生长；RT—PcR结果显示HIOEC细胞E-cadherin、want-4转录水平下调，wnt-5a转录水平上调，β-catenin、snail基因无明显改变。HIOEC细胞共表达CK和Vim。Actin细胞骨架在HIOEC细胞中更显丰富，呈束排列。结论HPV16 E6／E7永生化口腔上皮HIOEC细胞发生上皮一间叶变，细胞表现间叶细胞的部分生物学特征。     

转导人端粒酶逆转录酶基因致人成骨细胞永生化的研究

目的建立永生化的人成骨细胞系供骨科临床和基础研究使用。方法将人骨髓基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞,以逆转录病毒为载体,导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)全长cDNA,经筛选得到阳性克隆,体外连续传代,检测hTERT基因的整合情况及其表达,并对不同代次细胞的成骨特性进行了检测。结果成功地将hTERT基因转入人成骨细胞,得到的转化细胞端粒酶表达阳性,增殖旺盛,至今已传至62代,对第25、第55代转化细胞分别进行碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥素的检测,证明此永生化细胞保持了良好的成骨特性。结论转导外源性的hTERT基因可以导致人成骨细胞永生化且可保持其正常的成骨特性。     

人乳头状瘤病毒16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系的建立(英文)

目的建立人乳头状瘤病毒（HPv）16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系，确证HPv与喉癌的发生有无关系。方法采用脂质体介导法，将pSVHPV16DNA导入原代培养的人喉上皮细胞，继续培养、传代，取20代细胞，用PCR检测细胞是否含有病毒的特异片段，用免疫组化染色检测E6、E7蛋白的表达，用倒置显微镜、生长曲线、流式细胞仪、细胞角蛋白免疫组化染色、透射电镜及软琼脂克隆形成试验检测细胞的生物学特性。结果有3株细胞已连续培养传代超过20代，细胞含有HPV16DNA的特异片段并有E6、E7蛋白的表达，细胞呈锚着依赖性、接触抑制性单层平铺生长，生长曲线呈典型的“s”型，细胞增殖指数为48％，所有细胞均表达角蛋白，胞浆含张力原纤维，软琼脂培养克隆形成试验阴性。结论成功建立了HPV16DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系，为喉癌研究提供了新的理想模型，HPV16对人喉上皮有致癌作用，在喉癌组织标本中检测到的HPV16DNA必定在其多步癌变过程中发挥了重要作用。     

鬼臼毒素纳米脂质载体的制备及体外对HPV感染的永生化人宫颈上皮细胞的作用

目的研究鬼臼毒素纳米脂质载体(POD-NLC)的体外对HPV感染的永生化人宫颈上皮细胞的作用。方法采用乳化蒸发法制备POD-NLC,分别应用扫描电镜、粒径仪、高效液相法等方法研究其表征,并观察其稳定性。分别以不同浓度(0.0001~1μg/ml)的POD-NLC和鬼臼毒素(POD)处理H8细胞,采用MTT法检测细胞的增殖活性,以荧光显微镜观察细胞的形态变化,流式细胞术(FCM)检测其凋亡率和细胞周期。结果◆制备的POD-NLC扫描电镜下呈球形,有较好的稳定性,粒径为(85.6±10.25)nm,电位为(26.2±4.1)mV,包封率为(88.56±3.1)%;◆POD-NLC能较强地抑制H8细胞的增殖,其抑制作用呈现时间和剂量依赖性;POD-NLC和POD作用72h对H8细胞的抑制率最高分别为95.8%、65.6%,半数抑制浓度(IC50)分别为0.015、0.13μg/ml;空白NLC对H8细胞的增殖无影响;◆浓度为0.01μg/ml的POD-NLC和POD分别处理H8细胞48h后,H8细胞的凋亡率分别为(88.30±4.28)%和(59.95±3.26)%;荧光显微镜观察,均出现了核固缩、染色质高度凝聚、凋亡小体等典型的凋亡形态改变;与空白对照组相比,POD-NLC组和POD组G2/M期细胞比例明显增多,S期细胞比例无明显变化,G0/G1期细胞比例明显减少,但两组间细胞周期时相比例的差异无统计学意义(P>0.05)。结论该制备工艺可行;与POD相比,POD-NLC对H8细胞具有更强的增殖抑制和凋亡诱导效果,可使细胞阻滞于G2/M期,显示出良好的抗宫颈HPV感染的效果。     

沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 采用RNA干扰抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤中人乳头瘤病毒(human papillomavirus-16,HPV16)E6基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将HPV16 E6特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)真核表达载体转染到人宫颈癌细胞株CaSki细胞中,经G418筛选,RT-PCR检测E6基因的表达;将细胞接种到BALB/c裸鼠背部皮下,同时将该质粒注射到人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的裸鼠中,观察肿瘤出现时间及体积变化;观察肿瘤组织的病理改变.结果 成功筛选到持续表达E6 siRNA的CaSki细胞,经RT-PCR检测该细胞中HPV16 E6基因表达降低;裸鼠成瘤实验结果显示,处理后的CaSki细胞成瘤能力明显降低,抑瘤率为71.4%;注射质粒进行基因治疗后,裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与质量明显低于CaSki细胞组,差异具有显著性(P＜0.05).病理检查结果显示,经pGensil-CH2处理的肿瘤生长不佳,细胞分裂像少见,组织内有较多坏死区域.结论 沉默CaSki细胞中HPV16 E6基因的表达能明显降低宫癌细胞的成瘤作用.     

HPV16、HPV16 E7蛋白与Rb蛋白在喉癌发生中的作用

目的观察HPV16及其早期区基因E7表达蛋白与Rb蛋白在喉癌发生中的相关性,为探索喉癌的病因学提供依据。方法用免疫组织化学方法检测82例喉鳞癌、39例非癌组织标本中HPV16、HPV16 E7以及Rb的蛋白表达。结果HPV16 E7和Rb蛋白表达的阳性率在非癌及癌组织中有非常显著的差异（P〈0.01）,HPV16的阳性率在非癌及癌组织中有显著性差异（P〈0.05）。喉癌组织中,Rb蛋白在HPV16和HPV16 E7阳性及阴性组中的阳性率显著不同（P〈0.01）,而在非癌组织中则无此现象（P〉0.05）。结论喉癌组织中HPV16 E7的高表达导致的pRb功能失活是引起喉癌的主要原因之一。     

HPV16E6/E7重组体DNA免疫对小鼠脾细胞分泌活性的影响

目的研究人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E6/E7蛋白与结核杆菌热休克蛋白70(HSP70)表达重组体DNA免疫对小鼠活化脾细胞分泌活性的影响。方法采用肌肉注射DNA的方法免疫小鼠,分离脾细胞,用ELISA检测细胞因子的表达水平及抗体的水平,用RT-PCR的方法检测细胞中细胞因子mRNA的水平。结果以HPV16E6/E7为基础的DNA免疫小鼠后,检测到的细胞因子IL-2,IFNγ的含量明显升高;与结核杆菌HSP70重组后,IL-2,IFNγ的含量较重组前明显升高。与结核杆菌HSP70重组后,IL-10及抗体水平没有明显变化。结论以HPV16E6/E7为基础的DNA免疫能增强小鼠的细胞免疫反应。与结核杆菌HSP70重组后能提高细胞免疫的效果,但对体液免疫几乎没有影响。     

人乳头瘤病毒16 E7 (HPV16E7)逆转录病毒载体的构建

目的 构建人乳头瘤病毒16型E7基因片段（HPV16E7）的逆转病毒载体。方法 PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段，并用酶切，连接等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上，然后再用酶切，测序进行鉴定，通过Genbank的数据库分析软件对PV16E7进行同源性分析。结果 经酶切分析，测序证明，从HPV16cDNA克隆的300bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组，HPV16E7基因片段与数据库中的原HPV16cDNA的E7有高度的同源怀。结论 构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体，为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础。     

HPV16，HPV18，HSV-2多重感染与宫颈癌的相关性研究

目的探讨HPV16、HPV18、HSV-2多重感染在宫颈癌发病及其进展中的作用。方法选择120例宫颈癌标本及60例正常宫颈组织标本分别作为宫颈癌组及对照组,采用RT—PCR技术进行HPV16、HPV18、HSV-2检测,比较两组HPV16、HPV18、HSV-2感染情况,并分析宫颈癌HPV16、HPV18、HSV-2感染与肿瘤分化程度及肿瘤分期的关系。结果宫颈癌组HPV16、HPV18、HSV-2单独感染及混合感染构成比高于对照组。HPV16、HPV18、HSV-2多重感染与宫颈癌FIGO分期及分化程度呈现相关关系。结论HPV16、HPV18、HSV-2多重感染同宫颈癌发病具有相关性,可能是宫颈癌发病及进展的高危因素。     

宫颈癌患者HPV16感染及其血清抗体检测分析

目的：探讨宫颈癌与人乳头瘤病毒16（HPV16）感染及其血清抗体的关系，为HPV感染及宫颈癌的临床诊断提供理论依据。方法：选择28例宫颈癌患，用PCR方法检测宫颈癌组织的HPV型别；并采用重组杆状病毒－昆虫细胞系统制备HPV16病毒样颗粒（VLPs），用ELISA方法检测其血清HPV16VPLs抗体，同时以36份尖锐湿疣患血清及72份健康体检查血清作为对照。结果：宫颈癌HPV通用型DNA阳性率为50％（14／28），HPV16DNA阳性率为42．9％（12／28），HPV18DNA阳性率为3．5％（1／28），较健康对照组阳性率为1．4％（1／72）、中位数－0．0220）－0．0265）和尖锐湿疣组阳性率为8．3％（3／36）、中位数为0．0165（0．0145）差异具显性意义（P＜0．01）。HPV16DNA检测法与HPV16VLPsELISA血清抗体检测法两间呈中度相关（K＝0．471，P＜0．05）。结论：本组宫颈癌以HPV16感染为多见，HPV16VLPs血清ELISA抗体检测可用作HPV16感染的血清学诊断和宫颈癌的免疫学研究。     

HPV16／18型病毒感染与宫颈癌的关系研究

目的探讨高危型人乳头瘤病毒（human papilloma—virus,HPV）16／18型感染与宫颈癌的关系。方法应用实时荧光定量PCR（FQ—PCR）检测176例宫颈癌患者及218例宫颈炎症患者的宫颈分泌物,计算两组HPV16／18型阳性率及各组中HPV—DNA病毒载量拷贝对数值。结果宫颈癌患者组HPVl6／18型阳性率78．41％（138／176）,宫颈炎患者组HPVl6／18型阳性率29．82％（65／218）,两组阳性率经）（2检验,有显著性差异（Х^2=92．06,P〈0．01）;病毒载量前者也显著高于后者（t=2．42,P〈0．01）。结论HPVl6／18型病毒感染与宫颈癌关系密切,实时荧光定量PCR检测可以早期发现、旱期治疗。是预防宫颈癌的有效手段。