乙型肝炎治疗的希望-RNA干扰技术

我们看到了希望:基因时代对于基因功能的研究极其重要,RNA干扰技术的出现为研究提供了有力的手段。其特异、高效、持久等特征在分析基因功能、抗肿瘤、抗病毒、抗遗传病等方面均取得突破进展。1发现与机制1.1发现:RNA干扰(RNA in terference)是一种由双链RNA诱发的基因沉默(gene s ilenc ing),是指当细胞中导入与内源mRNA编码同源的双链RNA(doub le stranded RNA,dsRNA)后,该mRNA发生降解而致基因表达沉默的现象。1995年康乃尔大学Su G uo博士〔1〕在研究蠕虫(caenorhab-d irise legans,秀丽新小干线虫)par-1基因时,在给线虫注…     

siRNA干扰CASK表达对INS-1细胞胰岛素分泌的影响

目的 探讨小分子RNA(siRNA)干扰CASK基因表达对大鼠INS-1细胞胰岛素分泌的影响.方法 用脂质体lipofectamine 2000将针对靶基因CASK合成的特异性siRNA片段转染INS-1细胞.实时定量PCR及Western blot检测CASK基因表达变化,进行有效干扰片段的筛选.放射免疫法检测钾离子刺激胰岛素分泌(KSIS)功能的改变.结果 转染100 nM siRNAs 48 h后,INS-1细胞中CASK基因表达明显降低(P＜0.01),KSIS功能显著降低(P＜0.01).结论 靶向siRNA可以特异性地抑制INS-1细胞中CASK基因表达,从而抑制钾离子诱导的胰岛素分泌.     

siRNA沉默CD147基因对肝癌细胞的影响

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默CD147基因在肝癌细胞HepG2中的表达,探讨CD147基因对肝癌细胞生长、凋亡的影响.方法 根据CD147 cDNA序列设计具有短发夹结构的两条DNA序列,与载体pSileneerTM4.1-CMV neo构建重组表达载体,鉴定后转染至HepG2细胞,Western blotting法检测抑制效果,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况.结果 成功构建了针对CD147基因表达的干扰质粒,有效抑制了HepG2细胞增殖,促进了HepG2细胞凋亡.结论 CD147靶向RNA干扰重组表达栽体为肝癌的基因治疗提供了可能.     

RNA干扰下调宫颈癌Hela细胞Survivin基因对Hela细胞增殖能力影响的研究

目的:通过RNA干扰技术下调宫颈癌Hela细胞Survivin基因表达,观察Hela细胞增殖能力的变化情况。方法:当细胞生长至70.0%左右覆盖率时进行脂质体转染,细胞分为空白组(Hela细胞未转染组)、阴性对照组(转染空质粒)、实验组[Survivin-siRNA(+)质粒转染Hela细胞]三组。采用脂质体介导的方法将特异针对Hela细胞Survivin基因的干扰RNA转染入细胞后不同时间观察细胞生长形态的变化,记录转染后第1天到第5天每天的生长情况并绘制生长曲线,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验记录24 h,48 h,72 h活细胞数量,总结分析细胞生长情况。结果:RNA干扰后出现细胞生长速度减慢,实验组与空白组比较,从第3天到第5天空白组细胞数明显高于实验组(第3天P<0.05,第4天、第5天P<0.01)。实验表明,干扰24 h后实验组活细胞数量与空白组、阴性对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),48 h及72 h实验组活细胞数明显低于空白组与阴性对照组(P<0.01)。结论:Survivin基因沉默能够有效特异地抑制宫颈癌Hela细胞的体外恶性增殖能力,有利于细胞的凋亡,Survivin基因可以作为宫颈癌基因治疗的靶点。     

RNA干扰的机制及生物学意义

RNA干扰(RNAi)是指外源或内源性的双链RNA(dsRNA)进入细胞后引起与其同源的mRNA特异性降解，因而抑制相应基因表达，表现出特定基因缺失表现的现象。它与植物中的共抑制或转录后基因沉默、真菌中的基因压制一样。均是生物体内普遍存在的、在RNA水平上调节基因表达的方式。作为一种古老的、进化保守的基因沉默机制，对细胞防御病毒的感染、     

桦木酸调控LncRNA MFI2-AS1对骨关节炎软骨细胞损伤的保护作用

目的:探讨桦木酸对骨关节炎软骨细胞损伤的影响及其对LncRNA MFI2-AS1的调控作用.方法:白细胞介素-1β(IL-1β)诱导软骨细胞建立骨关节炎软骨细胞损伤模型,用不同剂量的桦木酸处理细胞,MFI2-AS1小分子干扰RNA(si-MFI2-AS1)及其阴性对照(si-NC)转染至软骨细胞后加入IL-1β处理细胞...     

MicroRNA与癌症的研究进展

1993年,Lee等[1]首先在线虫(C.elegans)的胚胎发育期发现一种长度约为22个核糖核苷酸的小分子非编码RNA,能调节线虫细胞发育时序,将其命名为lin-4.随后几年,相关研究人员又在多种动植物中发现数百种类似表达形式的小RNA,推测其对发育和生理过程等可能具有调控作用,并将它们命名为microRNA[2],即miRNA.根据生物信息学方法预测,人类基因组中可能包含了200～255个miRNA基因,约为编码基因的1%[3].数据库中已有319个人类miRNA基因,其中234个已得到验证(http://micmma.sanger.ac.uk/).在哺乳动物中,miRNA可能参与调控20%～25%的基因表达[4].RNA干扰作为近年来的重大科学发现,如今对于这种起抑制蛋白合成作用小分子RNA的研究已成为分子生物学领域的热门.从研究利用RNA干扰技术来阻滞癌症等疾病开始,越来越多的线索表明miRNA与癌症之间存在着密切的关系,笔者就miRNA功能及其与癌症的关系和目前的研究进展作以下综述.     

DIAPH3,一个新的肝细胞癌相关基因的筛选及功能研究

目的 研究功能未知基因DIAPH3在肝细胞癌(肝癌)组织中的表达及其与肝癌细胞生长的关系.方法 利用肝癌基因表达谱数据研究发现DIAPH3基因在肝癌组织中高表达.采用RT-PCR及实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测DIAPH3在人类正常组织以及肝癌组织和癌旁组织中的表达.RNA干扰技术沉默肝癌细胞株(7701和7402)内DIAPH3基因的表达,细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验定量分析内源性DIAPH3基因被沉默前后的细胞生长曲线的变化.结果 DIAPH3基因在75％(18/24)的肝癌组织中有明显的上调.沉默肝癌细胞株7701和7402中内源性DIAPH3基因表达后,两种肝癌细胞的生长均受到明显的抑制(P＜0.01).结论 DIAPH3可能是一个新的肿瘤相关癌基因,在维持肝癌细胞恶性表型过程中可能起到重要的作用.     

肾细胞癌患者尿液miRNA的研究进展

微小RNA(miRNA)是一类在转录后水平调节基因表达的非编码单链小分子RNA,与肾细胞癌(RCC)的发生和发展密切相关。尿液留取具有无创性和易行性,故尿液miRNA有可能成为RCC新的肿瘤标志物。现就尿液miRNA在RCC中的研究进展作一综述。     

siRNA干扰技术在乳腺癌中的研究进展

<正>RNA干扰(RNAi)是指在生物进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源信使RNA高效特异性降解的现象[1]。RNA干扰其效应因子是小分子干扰RNA(siRNA)。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,因具有高特异性、高效性、细胞穿透性等特点,已成为靶向基因治疗的又一有力工具,尤其是恶性肿瘤的基因治疗。本文就近年来siRNA干扰技术及其在乳腺     

沉默Bmi-1基因表达对人小细胞肺癌细胞H1963增殖与侵袭的抑制作用

目的:探讨沉默Bmi-1基因对人小细胞肺癌细胞H1963增殖与侵袭的抑制作用。方法:用小分子干扰RNA(siRNA)沉默Bmi-1基因,以100 nmol/L特异性Bmi-1的siRNA转染H1963细胞为试验组,以未转染细胞为空白对照组,以转染阴性序列Neg-siRNA细胞为阴性对照组。采用蛋白质印迹法检测siRNA对Bmi-1的基因沉默效果;经MTT法、流式细胞术、Transwell侵袭试验分别检测各组细胞的增殖活性、周期分布及侵袭能力,再用蛋白质印迹法检测各组细胞中抑癌基因P16、P14和上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)的蛋白表达情况。结果:与空白对照组和阴性对照组比较,试验组细胞中Bmi-1蛋白的表达明显降低(P<0.05);与阴性对照组比较,试验组细胞的增殖抑制率明显升高(P<0.05),主要表现为G0/G1期细胞比例明显增加、S和G2/M期细胞比例明显减少(P<0.05);侵袭细胞数明显减少(P<0.01);细胞中N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表达明显减弱(P<0.05),而P16、P14、E-cadherin、TIMP-1蛋白表达明显增强(P<0.05)。结论:沉默Bmi-1基因可通过阻滞细胞G1/S期转化及影响侵袭相关蛋白的表达来显著抑制H1963细胞的增殖和侵袭能力。     

微RNA对肿瘤调控机制的研究进展

微RNA(miRNA)是一类长度为21~25个核苷酸的非编码小分子RNA。其通过靶向降解信使RNA(mRNA)或抑制mRNA被翻译为蛋白质参与个体发育及细胞增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程,与人类多种疾病的发生、发展密切相关。miRNA作为潜在的促癌基因或抑癌基因在结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等的发生、发展中有调控作用,可作为某些癌症的潜在治疗靶点。     

RMP基因对肝癌细胞稳定性及迁移能力的影响

目的研究RMP基因对肝癌细胞稳定性及迁移能力的影响。方法将SMMC-7721细胞等量分为对照组和实验组。合成RMP基因的小干扰RNA真核表达载体,转染到实验组肝癌SMMC-7721细胞内,用G418筛选出实验组干扰RMP基因的细胞株,RT-PCR检测两组细胞内RMP基因的表达,划痕实验法检测两组细胞的迁移能力。结果成功构建稳定的RMP基因干扰细胞株,与未干扰细胞对照组比较,实验组细胞p21基因表达减弱,细胞迁移能力降低。结论 RMP基因有维持肝癌细胞基因组稳定的重要作用,对保持细胞的迁移能力也有作用。     

RNA干扰PPAR-α基因表达对HepG2细胞部分脂代谢信号及炎症因子IL-6的影响

目的研究RNA干扰抑制PPAR-α基因表达对Hep G2部分脂代谢信号及炎症因子IL-6影响。方法在脂质体lipofectamineTM2000介导下将PPAR-αsi RNA瞬时转入人肝细胞癌Hep G2细胞,用RT-PCR方法检测转染效率及转染后LPL m RNA、IL-6m RNA、CPT-1 m RNA的表达变化。结果成功转染PPAR-αsi RNA后,与空白对照组比,转染试剂组Hep G2细胞LPL m RNA表达增高（0.002605±0.000213 vs 0.003920±0.000324,P〈0.05）、CPT-1m RNA表达稍降低（2.25831±0.06151 vs 2.06625±0.05091）,差异无统计学意义,IL-6m RNA表达显著增高（0.01604±0.00118 vs 0.02458±0.001718,P〈0.01）。结论在人肝细胞癌Hep G2细胞中抑制PPAR-α基因表达可促进LPL m RNA、IL-6 m RNA表达,促进脂蛋白酯酶合成而诱发炎症,但对线粒体氧化途径的关键酶CPT-1表达无明显影响。     

靶向人乳头瘤病毒18E6的短发夹结构RNA慢病毒载体的构建

目的:构建含有靶向人乳头瘤病毒18型E6癌基因(HPV18E6)的短发夹结构RNA(shRNA)的慢病毒载体。方法:根据HPV18E6癌基因的相关信息,设计并合成shRNA干扰序列,连入pGCSIL-GFP质粒,构建并鉴定含有shRNA的重组质粒pGC-shRNA;将重组质粒pGC-shRNA和病毒包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,进行病毒包装,收集病毒液并进行浓缩、纯化;所得病毒液感染293T细胞,测定病毒滴度,并验证其对宫颈癌HeLa细胞HPV18E6癌基因的干扰效果。结果:HPV18E6的shRNA干扰序列与人类基因组没有同源性,此插入序列转录后得到的RNA二级结构能形成发夹状结构;重组质粒pGC-shRNA经PCR鉴定及DNA测序结果显示该重组质粒构建成功;成功对病毒进行包装、浓缩及纯化后,所得病毒滴度为3×108TU/mL,并能很好地抑制HPV18E6癌基因的表达。结论:成功构建了HPV18E6-RNAi-LV慢病毒载体,为后续RNA干扰研究的开展提供了工具。     

DPF2基因RNA干扰对人胰腺癌细胞PANC-1增殖、凋亡和细胞周期的作用研究

目的已知DPF2参与白血病以及肿瘤的发生,但是DPF2是否参与胰腺癌发生和进展还不清楚,因此观察了DPF2基因RNA干扰对胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法采用慢病毒介导的DPF2基因RNA干扰敲低PANC-1细胞的DPF2表达,通过克隆形成实验和MTT实验检测DPF2基因RNA干扰对PANC-1细胞增殖的作用,通过流式细胞术检测DPF2基因RNA干扰对PANC-1细胞凋亡和细胞周期的作用。结果慢病毒介导的DPF2基因RNA干扰中剂量和高剂量(2μL和4μL)使PANC-1细胞的DPF2表达明显降低。与阴性对照组比较,DPF2基因RNA干扰明显抑制PANC-1细胞活力和克隆形成,还促进PANC-1的凋亡。此外,DPF2基因RNA干扰引起细胞周期的S期阻滞,明显减少G2/M周期的细胞数量。结论 DPF2可能参与胰腺癌细胞PANC-1的增殖、凋亡过程和细胞周期的调控,通过慢病毒介导的DPF2基因RNA干扰敲低DPF2蛋白表达,可能为寻找潜在的抗胰腺癌的新方法提供实验依据。     

大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应

目的构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响。方法设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组)。RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况。结果与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P<0.01或P<0.05)。结论成功构建neuritin基因shRNA慢病毒表达载体。其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加。     

原发性输卵管绒癌一例报告

原发性输卵管绒癌较为罕见,Gribisic复习2000多例子宫绒毛膜癌患者中,输卵管绒癌仅有60例。国内俞氏等曾报道一例。我院自1964年至1980年,在138例子宫绒毛膜癌、265例输卵管妊娠病例中,仅见一例,现报告如下:     

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 2B反义 RNA1靶向微小 RNA-339-5p对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的探讨长链非编码 RNA细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 2B反义 RNA1(lncRNA CDKN2B-AS1)对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及分子机制。方法收集南阳市中心医院 2017年 1月 2019年 1月收治的 37例乳腺癌患者的癌组织及癌旁组织。将 MDA-MB-453细胞分为 CDKN2B-AS1阴性对照( si-NC组)、 CDKN2B-AS1小分子干扰 RNA(si-CDKN2B-AS1组)、 CDKN2B-AS1小分子干扰 RNA+miR-339-5p阴性对照( si-CDKN2B-AS1+anti-miR-NC组)以及 CDKN2B-AS1小分子干扰 RNA+ miR-339-5p特异性寡核苷酸抑制剂( si-CDKN2B-AS1+anti-miR-339-5p组)。采用 RT-qPCR法对 CDKN2B-AS1及微小 RNA-339-5p(miR-339-5p)表达水平进行检测;细胞周期及增殖活性检测分别采用流式细胞术及 MTT实验;采用 Transwell小室技术对细胞迁移和侵袭进行检测;采用 Western blotting法对增殖标记蛋白细胞增殖核抗原 -67(Ki67)、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子 1A(P21)、上皮型钙黏蛋白( E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达进行检测;荧光素酶报告实验检测 CDKN2B-AS1对 miR-339-5p的靶向调控。结果在乳腺癌组织中 CDKN2B-AS1表达水平上调［( 2.23±0.08)比( 1.00±0.06)］(P<0.05)。抑制 CDKN2B-AS1可增加 G0期细胞比例［(43.29±3.76)%比( 30.25±3.01)%］、 P21表达水平升高, S期细胞比例［(21.91±3.10)%比( 34.19±3.32)%］、细胞存活率［( 53.02±5.38)%比( 100.00±7.12)%］、迁移、侵袭数以及 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平降低( P<0.05)。 CDKN2B-AS1靶向调控 miR-339-5p,抑制 miR-339-5p逆转抑制 CDKN2B-AS1对 MDA-MB-453细胞增殖、迁移、侵袭的作用。结论抑制 CDKN2B-AS可抑制乳腺癌 MDA-MB-453细胞增殖、迁移、侵袭,且靶向调控 miR-339-5p表达。关键词:乳腺肿瘤;细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 2B反义 RNA1;微小 RNA-339-5p(miR-339-5p);增殖;迁移;侵袭     

siRNA体内导入策略

以small interfering RNA (siRNA)为基础的RNA 干扰(RNA interfering,RNAi),是指当与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA(dsRNA)导入细胞后,该mRNA发生特异性降解,而导致该基因表达的沉寂.是一种dsRNA分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程,也就是序列特异性的转录后基因沉默。