鼠源性单克隆抗体F（ab‘）2片段制备工艺

目的 制备府合临床应用质量标准的鼠源性ｍＡｂＦ（ａｂ’）２片段。方法 采用胃蛋白酶消化小鼠腹水抗体,疏水作用钯谱法纯化Ｆ（ａｂ’）２片段的新工艺,替代原有的木瓜蛋白酶消化ＩｇＧ,阴离子交换色谱法纯化的旧工艺。结果 新工艺所制备的Ｆ（ａｂ’）２片段经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测纯度达９８％以上,ＡＢＣ免疫组化法测定免疫法性为１：８０００,回收率大于５０％,核酸含量及热原均合格,整个工艺流程可在４８ｈ内完成,     

抗竹叶青蛇毒抗体F(ab′)2的制备

目的：制备特异性强、高纯度的抗竹叶青蛇毒抗体F（ab′）2。方法：以竹叶青蛇毒为免疫原免疫马,试血效价达到要求后,从免疫马血浆中先提取IgG,然后酶解、过疏水柱后得到F（ab′）2片段,以免疫扩散实验检测抗体F（ab′）2片段的特异性,以小鼠中和试验测定其中和竹叶青蛇毒的能力。结果：纯化得到的F（ab′）2活性片段纯度可达90%;F（ab′）2冻干品与竹叶青蛇毒在8∶1时出现免疫沉淀线,在20∶1时可保护小鼠100%存活。结论：纯化得到的抗体F（ab′）2活性片段对竹叶青蛇毒具有较好的中和能力。     

单克隆抗体F（ab‘）2片段2种纯化方法的建立及比较

目的：建立纯化（ｍＡｂ）Ｆ（ａｂ‘）２片段的有效方法。方法：在ｐＨ５．５环境下，用ＤＴＴ激活木瓜酶，在没有ＤＴＴ存在下消化抗人肝癌ｍＡｂ ＨＡｂ１８ ＩｇＧ１，３７℃，反应８ｈ，然后分别用Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００（１ｃｍ×６５ｃｍ）凝胶过滤柱和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－ＦＦ（２ｃｍ×１８ｃｍ）阴离子交换柱纯化。结果：经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１００ｇ／Ｌ）电泳测定，２种方法纯化的Ｆ（ａｂ’）２     

抗内毒素鸡蛋黄抗体F(ab'''')2制备

目的研究抗内毒素鸡蛋黄免疫球蛋白(IgY)用胃蛋白酶切后提取的F(ab’)2片段，探索防治内毒素血症的新途径。方法用内毒素(LPS)作抗原免疫25周龄leghorn鸡，改良水溶法提取抗内毒素IgY，胃蛋白酶切后提取IgY—F(ab’)2段，光密度法测抗内毒素IgY—F(ab’)2浓度和含量、ELISA检测抗内毒素IgY—F(ab’)2效价，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量及纯度。结果抗内毒素IgY—F(ab’)2含量为1．04mg／ml蛋黄液，效价为1：25600，纯度为90％，相对分子质量为24000。结论抗内毒素IgY—F(ab’)2产量大、效价高、特异性强。     

抗内毒素鸡蛋黄抗体F(ab′)_2制备

目的研究抗内毒素鸡蛋黄免疫球蛋白(IgY)用胃蛋白酶切后提取的F(ab′)2片段,探索防治内毒素血症的新途径。方法用内毒素(LPS)作抗原免疫25周龄leghorn鸡,改良水溶法提取抗内毒素IgY,胃蛋白酶切后提取IgY F(ab′)2段,光密度法测抗内毒素IgY F(ab′)2浓度和含量、ELISA检测抗内毒素IgY F(ab′)2效价,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量及纯度。结果抗内毒素IgY F(ab′)2含量为1.04mg/ml蛋黄液,效价为1∶25600,纯度为90%,相对分子质量为24000。结论抗内毒素IgY F(ab′)2产量大、效价高、特异性强。     

鼠源性单克隆抗体F(ab′)2片段制备工艺

目的制备符合临床应用质量标准的鼠源性mAb F(ab′)2片段.方法采用胃蛋白酶消化小鼠腹水抗体,疏水作用色谱法纯化F(ab′)2片段的新工艺,替代原有的木瓜蛋白酶消化IgG,阴离子交换色谱法纯化的旧工艺.结果新工艺所制备的F(ab′)2 片段经SDS-PAGE检测纯度达98%以上,ABC免疫组化法测定免疫活性为1∶8000,回收率大于 50%,核酸含量及热原均合格,整个工艺流程可在48 h内完成.结论新工艺制备人用鼠源性mAb F(ab′)2片段更简便高效、安全实用,能够适应中试放大及大规模生产的要求.     

哇巴因多克隆抗体对两肾夹肾血管性高血压大鼠血流动 …

为探讨哇巴因多克隆抗体的降压作用及哇巴因与高血压发病的关系，给“两肾一夹＋盐（２ｋ１ｃ＋盐）”、“两肾一夹（２ｋ１ｃ）”肾血管性高血压大鼠随机静注哇巴因多克隆抗体、硝普钠、正常兔免疫球蛋白（ＩｇＧ）及生理盐水，颈动脉插管观察注射后３ｈ内血压动态变化。结果表明：哇巴因多克隆抗体对“两肾一夹＋盐”肾血管型高血压大鼠具有明显的降压作用，而对“两肾一夹”高血压模型降压作用不明显。正常兔免疫球蛋白对高血压模     

多西环素多克隆抗体的制备及鉴定

目的:采用人工偶联方法构建多西环素完全抗原,制备多克隆抗体。方法:分别采用直接偶联法、甲醛一步法、重氮法+混合酸酐法和重氮法+碳二亚胺法等4种方法将多西环素与牛血清白蛋白(bull serum albumin,BSA)或鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)分别偶联,构建人工完全抗原。选择最好偶联效果制备的抗原免疫BALB/c小鼠,通过直接ELISA法检测多克隆抗体效价,竞争抑制ELISA法分析其灵敏性及特异性。结果:重氮法+碳二亚胺法偶联的多西环素人工完全抗原效果最好,其与BSA的偶联比为8.37∶1,与OVA的偶联比为4.92∶1。采用该方法偶联的抗原免疫小鼠获得的多克隆抗体效价在1∶8 000以上;该抗体对多西环素的半数抑制浓度(IC50)为98.89~120.32μg/L,与其他四环素类药物的交叉反应性较低。结论:重氮法+碳二亚胺法的偶联效率最高,获得的多西环素多克隆抗体效价较高,特异性和灵敏度均较理想。     

抗PIWIL2蛋白多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备兔抗人PIWIL2(P-element-induced wimpy testis like 2,或称HIWI2)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,初步探讨其在人正常及肿瘤组织中的分布.方法:人工合成特异性PIWIL2多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)为载体构建多肽免疫原,致敏大白兔,制备兔抗人PIWIL2多克隆抗体.亲和层析法纯化抗体,ELISA和Western印迹鉴定特异性,人组织芯片行PIWIL2的免疫组化研究. 结果:通过构建PIWIL2多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,制备出兔抗人PIWIL2蛋白多克隆抗体.ELISA及Western印迹证实兔抗人PIWIL2抗体可特异性识别PIWIL2多肽.人组织芯片免疫组化染色显示,PIWIL2在肿瘤细胞的表达具有组织特异性,大多数正常和癌组织的平滑肌细胞胞质中呈阳性染色. 结论:成功制备出兔抗人PIWIL2多克隆抗体,为后续研究奠定了基础.     

抗总黄曲霉毒素单克隆抗体2G2 F(ab')2片段的特性

目的:研究经无花果蛋白酶酶切后所得的抗总黄曲霉毒素单抗2G2F(ab′)2片段的特性,为研制开发特异性、灵敏度较高的黄曲霉毒素B1抗独特型单克隆、多克隆抗体提供科学依据。方法:在制备出抗总黄曲霉毒素单克隆抗体2G2株及其2G2F(ab′)2片段的基础上,采用非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(非还原SDS-PAGE)和酶联免疫吸附法(ELISA)对单抗2G2及其F(ab′)2片段的特性进行研究并加以比较。结果:单抗2G2F(ab′)2片段和单抗2G2的相对分子质量分别为105000和180000。单抗2G2F(ab′)2片段和单抗2G2的比效价分别为3.33和1.25。单抗2G2F(ab′)2片段的最低检出限和达到50%竞争抑制率时的检出限分别为0.17μg/L和0.67μg/L,单抗2G2的分别为0.47μg/L和1.92μg/L。单抗2G2F(ab′)2片段的亲和力常数为2.95×10-9mol/L,单抗2G2的亲和力常数为1.52×10-10mol/L。结论:单抗2G2F(ab′)2片段灵敏度优于完整抗体,可利用其生产特异性和灵敏度较高的黄曲霉毒素B1抗独特型多克隆和单克隆抗体。     

抗哇巴多克隆抗体的制备及免疫周期和剂量的研究

制备抗哇巴因多克隆抗体,探讨最佳的免疫周期及免疫剂量。应用哇巴因（ｏｕａｂａｉｎ）－牛血清白蛋白（ＢＳＡ）结合物为抗原免疫家兔,每周从兔耳缘静脉采血,监测哇巴因特异抗体的产生;以０．２５ｍｇ／次,１ｍｇ／次,１．７５ｍｇ／次,２ｍｇ／次四种不同免疫剂量进行最佳免疫剂量的研究。     

高效液相排阻色谱技术在抗哇巴因多克隆抗体制备中的应用

目的 :探讨高效液相排阻色谱技术 ( HPSEC)在抗哇巴因多克隆抗体的制备及纯化中应用的意义。方法 :免疫新西兰大白兔制备出抗哇巴因多克隆抗体。在优化色谱条件下 ,应用 HPSEC技术纯化抗哇巴因多克隆抗体。采用酶联免疫吸附法 ( ELISA)及考马斯亮兰法进行定性、定量分析 ,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯度。分别选用三种标准蛋白。在优化的色谱条件下 ,分别测定标准蛋白的洗脱体积 ,并根据分子量的对数与洗脱体积绘制标准曲线。在相同的色谱条件下 ,测定抗哇巴因多克隆抗体的洗脱体积 ,从而测定分子量。结果 :优化的色谱条件为流动相 0 .0 5 mol/ L的磷酸盐缓冲液 ,p H6.0 ,流速 0 .30 ml/ min,进样量 5μl。纯化后抗体效价 1∶ 5 0 ,蛋白浓度 2 0μg/ ml。纯化后抗体电泳图谱仅可见一条色谱带。在优化的色谱条件下 ,测得抗哇巴因多克隆抗体的分子量为 166k D。结论 :HPSEC是一种有效、快速纯化抗哇巴因多克隆抗体的方法 ,为日后制备高纯度、高活性的抗哇巴因多克隆抗体奠定基础。同时 HPSEC也是测定分子量的有效方法。     

血清脂蛋白（a）多克隆试剂ELISA法的方法学初探

为了将血清Ｌｐ（ａ）测定引入教学并期望在较多临床实验室推广，对南京军区总医院生化科的多克隆试剂盒作了初步的方法学探讨。该法的线性范围在０．０３￣０．９６ｍ／Ｌ；批内ＣＶ为２．１５％，批间ＣＶ为７．５５％；平均回收率为９７．２％；不受ａｐｏｓＡⅠ、ＡⅡ、Ｂ１００，白蛋白和纤溶酶原等的干扰；与单克隆试剂测定结果比较，相关良好（ｒ＝０．９００７，Ｐ〈０．０１）。对４８份中老年健康者血清Ｌｐ（ａ）测定，其     

金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）多克隆抗体并用金黄色葡萄球菌野生株对其进行验证,为进一步研究SEA在金黄色葡萄球菌致病机制中的作用提供基础。方法：PCR方法扩增肠毒素A基因（sea）,构建原核表达载体p ET 30 a/sea,经PCR方法和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌DH 5α,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Bloting,WB）分析鉴定。蛋白经纯化后作为免疫原免疫新西兰大白兔,得到抗血清并纯化,采用sea基因阳性的金黄色葡萄球菌野生株S8和S 23株的菌体蛋白进行鉴定。结果：pET 30 a/sea重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统中可实现高表达,纯化后得到高纯度的SEA蛋白,经临床分离金黄色葡萄球菌S 8和S 23株菌体蛋白验证,证实得到理想的兔抗SEA多克隆抗体。结论：通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌SEA蛋白在构建的原核表达系统中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白的生物学活性及抗体的保护作用奠定了基础。     

新耐药基因HA117多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备HA117多克隆抗体。方法以HA117表达质粒pAdTrack-HA117为模板,PCR扩增HA117基因,扩增产物转入BL21(DE3)感受态细胞,进行HA117蛋白诱导表达,采用SDS-PAGE检测表达产物。纯化HA117蛋白后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。通过间接ELISA检测其效价。将转染携带HA117重组腺病毒的HEK293细胞为实验组,未转染的HEK293细胞为对照组,用细胞免疫荧光和Western blot方法检测其过表达的HA117蛋白,验证制备的HA117多克隆抗体的特异性。结果成功获得HA117多克隆抗体,间接ELISA法检测显示抗HA117血清效价为1∶729 000。细胞免疫荧光和Western blot检测示制备的HA117多克隆抗体可以特异性识别HA117抗原蛋白。结论获得了效价和特异性较高的HA117多克隆抗体。     

小鼠Rnf141多克隆抗体的制备及鉴定

目的 获得小鼠Rnf141多克隆抗体,并对其功能进行初步研究.方法 利用多聚酶链反应(PCR)扩增获得鼠Rnf141基因并且与原核表达载体pGEX-5X-3(含GST标签)进行重组,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG在25 ℃条件下诱导,用SDS-PAGE检测,获得GST-Rnf141融合蛋白高效表达后,通过Glutathione Sephorase 4B纯化.纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学的方法检测抗体的特异性.结果 成功构建了重组质粒pGEX-Rnf141,该质粒能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-Rnf141,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的46%,制备的多抗效价达1∶128000,它可以与GST-Rnf141重组蛋白和小鼠不同脏器组织Rnf141蛋白发生特异的抗原抗体反应,在脾脏和脑组织中Rnf141蛋白表达量较高.结论 成功制备小鼠Rnf141多克隆抗体,该抗体为研究Rnf141的表达与功能提供了有用的工具.     

抗抗总黄曲霉毒素单抗F(ab’)2多克隆抗体的制备及特性

目的:以抗总黄曲霉毒素单抗2G2株F(ab’)2片段作为免疫原制备抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多克隆抗体。方法:制备抗总黄曲霉毒素单抗2G2株F(ab’)2片段,分别用F(ab’)2片段和F(ab’)2-KLH免疫日本大耳白兔,制备抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多克隆抗体。采用ELISA检测该抗体替代黄曲霉毒素B1(AFB1)的情况,并分析与其他单克隆抗体的交叉反应情况。用该多克隆抗体免疫BALB/C小鼠,采用间接非竞争ELISA检测小鼠血清,鉴定该抗体的亚型。结果:由2G2株F(ab’)2片段所得的抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多克隆抗体纯化后,替代游离AFB1达到20%、50%和80%竞争抑制时的质量浓度分别为1、4和25mg/L,分别相当于0.47、2.74和16.00μg/L游离AFB1;该抗体替代AFB1包被抗原达到20%、50%和80%竞争抑制时的质量浓度分别为1、4和19mg/L,分别相当于0.33、1.35和5.45μg/L游离AFB1。小鼠生物鉴定显示该多克隆抗体为Ab2β型。结论:成功制备了抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多克隆抗体,为研制AFB1无毒检测试剂盒提供了依据。     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

抗rhANG多克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备抗重组人血管生长素(recombinant human angiogenin，rhANG)多克隆抗体，并初步应用于消化道肿瘤实验研究。方法 用重组基因工程菌表达，SDS法纯化的rhANG蛋白免疫新西兰兔，制备并纯化多克隆抗体，并用免疫组织化学和ELISA等方法对多克隆抗体进行测定。结果 此次获得的抗血清ELISA方法效价达1：12800，检测ANG灵敏度最低为8～16μg／L，不与其他细胞因子和血清反应。该抗体与20％～30％消化道恶性肿瘤呈阳性反应。结论 ANG多克隆抗体对表达ANG的肿瘤组织反应特异性强，ELISA方法检测灵敏度高，该抗体可用于ANG的检测。