吸水链霉菌井冈变种原生质体的制备与再生

目的研究井冈霉素产生菌吸水链霉菌井冈变种的原生质体制备与再生的最佳条件。方法使用溶菌酶水解菌体细胞壁法,分别考察影响吸水链霉菌井冈变种原生质体的制备与再生的各种因素。结果在R2YE液体培养基中,一级菌丝体的最佳培养时间为24 h,二级菌丝体的最佳培养时间为16 h,最佳甘氨酸质量浓度为5 g.L-1,最佳溶菌酶质量浓度为2 g.L-1,最佳酶解时间为60 min,最佳再生培养基为R2YE,原生质体的再生率最高可达到15.79%。结论本实验确定了吸水链霉菌井冈变种的原生质体制备与再生的最佳条件,能够得到较高的再生率。     

阿卡波糖产生菌原生质体的制备与再生

目的研究阿卡波糖产生菌原生质体制备与再生的条件。方法通过溶菌酶破壁的方法制备原生质体,考察影响原生质体制备与再生的因素。结果和结论确认原生质体的制备条件为:一级培养采用SM2液体培养基,培养时间为33 h,转二级培养的转种体积分数为15%;二级培养采用R2YE培养基,培养时间为20 h,甘氨酸质量分数为0.7%;溶菌酶作用质量浓度为3 g.L-1,作用时间100 min,最大原生质体制备量达到8×1010个.L-1。考察了原生质体再生培养基的组成,在优化的再生培养基上,再生率达到9.2%。     

刺糖多孢菌原生质体制备与再生条件优化

目的研究多杀菌素产生菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)原生质体制备与再生的最佳条件。方法利用数理统计的方法研究了不同制备培养基、菌龄、甘氨酸浓度、溶菌酶处理条件以及再生培养基对原生质体制备和再生的影响,并考察了原生质体的适宜保藏温度。结果菌体在添加0.3%甘氨酸的EHC培养基中培养72h,用2mg/mL溶菌酶32℃酶解40min后,涂布在再生培养基R6上再生,原生质体制备率超过99%,再生数可达到107cfu/mL。刺糖多孢菌原生质体可置于4℃短期保存72h,长期保存需要放置于-80℃条件下。结论优化的结果为刺糖多孢菌原生质体融合育种和遗传转化体系建立奠定了基础。     

黑暗链霉菌原生质体制备、再生及其DNA转化条件的研究

利用CP培养基培养黑暗链霉菌 (Streptomycestenebrarius) 990 4,采用二级培养即首先在37℃培养 48h ,然后按 10 %的转种量转种于新鲜的培养基中 ,同时补加 2 %甘氨酸 ,2 8℃培养 2 0h ,收获的菌丝体对溶菌酶敏感。在适宜的酶解条件下可形成 4 6 2× 10 9/mL原生质体 ,再生率为18%。利用经修饰的质粒DNA转化冻存的原生质体获得成功 ,转化率为 10 3～ 10 4 / μgDNA。     

利用原生质体诱变筛选L—异亮氨酸高产菌株

在棒杆菌原生质体制备中,以单一甘氨酸代替青霉素与溶菌酶进行细胞脱壁处理,以含0.3M蔗糖的普通肉汤培养基作为再生培养基,L-异亮氨酸产生菌A6在肉汤中培养至对数期,加入0.3M蔗糖和3%甘氨酸,继续培养8h,原生质体的形成率达98%,原生质体经洗涤后的再生率为81.6%,不经离心直接涂皿的再生率为81.2%.A6菌株的原生质体经紫外线诱变处理后,再生菌株在L-异亮氨酸产量高达14.3mg/ml,比原菌株产量提高30%左右。     

利用原生质体诱变筛选L-异亮氨酸高产菌株

在捧杆菌原生质体制备中,以单一甘氨酸代替青霉素与溶菌酶进行细胞脱壁处理,以含0.3M蔗糖的普通肉汤培养基作为再生培养基。L-异亮氨酸产生菌A6在肉汤中培养至对数期,加入0.3M蔗糖和3%甘氨酸,继续培养8h,原生质体的形成率达98%。原生质体经洗涤后的再生率为81.6%,不经离心洗涤直接涂皿的再生率为81.2%。A6菌株的原生质体经紫外线诱变处理后,再生菌株的L-异亮氨酸产量高达14.3mg/ml,比原菌株产量提高30%左右。     

林肯链霉菌原生质体的形成、再生及其影响因素

林肯链霉菌林肯变种(Streptomyces lincolnensis var.lincolnensis)在含有0.5%甘氨酸的 S培养基上生长的菌丝体对溶菌酶敏感,酶解后产生10~8/ml 的原生质体。在适当的条件下可有20%的原生质体再生成细胞。原生质体在4℃贮存20h 后再生活力下降至原来的20%以下。原生质体在紫外光照射下比孢子更易发生突变。     

原生质体诱变选育阿霉素高产菌株及发酵产品质量的初步分析

目的 利用原生质体诱变方法从一株链霉菌原始菌株Streptomyces sp.H-323 (CGMCC 4827)选育阿霉素高产突变菌株,以提高阿霉素的发酵单位,并对发酵产品的质量进行了初步研究.方法 通过研究不同甘氨酸浓度、溶菌酶酶解时间、酶解温度、酶浓度对H-323原生质体形成的影响,确定了原生质体的最佳制备和再生条件.通过阿霉素抗性选育,诱变原生质体筛选阿霉素高产突变菌株.最后通过高效液相、核磁等波谱分析法初步确定发酵法生产的阿霉素产品的质量.结果 制备Streptomyces sp.H-323原生质体的最佳条件:种子培养基中甘氨酸浓度0.5％、溶菌酶浓度3mg/mL、酶解时间60min、酶解温度30℃.通过原生质体诱变结合阿霉素抗性选育,得到一株高产突变株,阿霉素发酵单位由出发菌株的300mg/L提高到700mg/L.通过波谱分析,发酵产物达到国外注册标准.结论 通过原生质体诱变和抗性选育大大提高了阿霉素的产量,为高产阿霉素产业化提供方法支持.     

产黄青霉原生质体制备和再生影响因子分析

产黄青霉原生质体制备过程中,菌丝体最佳酶解条件与原生质体释放最适条件不同,菌丝体培养基含有0．05％L－天冬酰胺时,选取培养48h的菌丝体,在裂解酶(Lysing enzyme)浓度15mg/ml,0.7mol/L KCl作为渗透压稳定剂的条件下酶解,可获得大量原生质体;同时,再生培养基中含有25mmol/L Ca^2 离子、上层琼脂浓度1．1％,可获得较佳原生质体再生率。     

普那霉素产生菌的原生质体诱变育种

普那霉素产生菌始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis ）11．2在含0．5％甘氨酸的种子培养基中培养到对数生长期，收集菌丝体，经2mg／ml溶菌酶在30℃下作用90min可获得大量的原生质体，其再生率为5．1％。始旋链霉菌11.2原生质体经UV诱变并在含普那霉素的再生平板上筛选普那霉素抗性菌株，从中获得一高产：突变株始旋链霉菌ZP-07，普那霉素产量达到1．59g／L，比出发菌株提高101．3％。     

毛细管气相色谱法测定鱼腥草中4种挥发油的含量

目的建立鱼腥草挥发油的气相色谱法,并用该法对不同产地鱼腥草挥发油中α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮进行同时的含量测定,根据含量水平对鱼腥草药材进行聚类分析。方法采用挥发油提取器,利用GC测定4种化学成分的含量。采用HP-5石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm),程序升温,流速为1 mL.min-1,分流比为10∶1,进样量为1μL,采用SPSS 16.0统计软件进行聚类分析。结果α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮的线性范围分别为0.052～0.783 g.L-1、0.097～1.464 g.L-1、0.112～1.685 g.L-1、0.377～5.663 g.L-1,平均回收率分别为101.3%、97.3%、101.7%、96.9%,RSD分别为1.9%、1.2%、1.7%、1.6%,所分析的鱼腥草药材大致划分为两类。结论该方法准确、重复性好,可用于鱼腥草干品的质量控制。     

GC法同时测定韭菜中3种硫化物的含量

目的建立GC法同时测定韭菜中烯丙基甲基二硫醚、二甲基三硫和甲基硫代磺酸甲酯含量的方法。方法采用GC内标法。色谱柱为DB-17石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);FID检测器;内标物为十一碳烯。结果烯丙基甲基二硫醚、二甲基三硫和甲基硫代磺酸甲酯质量浓度分别在0.014 4～0.130 g.L-1(r=0.999 6)、0.203～1.831 g.L-1(r=0.999 6)、0.412～3.710 g.L-1(r=0.999 8)内与峰面积呈良好的线性关系(n=5)。3种成分的加样回收率均高于97.5%,RSD均小于2.9%。结论该方法快速、准确,重现性好,为韭菜作为一种新保健品的质量控制提供依据。     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在那西肽产生菌—活跃链霉菌中的表达

目的将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到那西肽产生菌—活跃链霉菌(Streptomyces actuo-sus)的染色体上进行表达,从而提高菌体对溶解氧的利用,提高那西肽的发酵产量。方法采用分子生物学方法构建了携带vgb的重组质粒pZV02,采用接合转移的方法将其导入那西肽产生菌—活跃链霉菌中,采用抗生素抗性标记筛选法获得了基因重组菌株。结果在低溶氧的发酵条件下,重组菌株的那西肽产量显著高于对照菌株。结论 vgb在活跃链霉菌中的表达,可以改善菌体对溶解氧的利用,在低溶氧的条件下可以提高发酵产物那西肽的产量。     

活跃链霉菌nshA基因失活对那西肽发酵的影响

目的通过对活跃链霉菌那西肽生物合成基因簇中的nshA基因进行内部片段缺失,考察其对那西肽生物合成的影响。方法利用重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)的方法失活nshA基因,并构建具有接合转移功能的大肠杆菌-链霉菌重组质粒pSH03,通过接合转移将重组质粒pSH03导入到活跃链霉菌细胞内,并通过同源交换形成活跃链霉菌基因组上的nshA基因失活。采用摇瓶进行发酵,采用HPLC的方法检测发酵液中诺西肽的含量。结果重组菌株的那西肽发酵产量较对照菌株有明显提高。结论 nshA基因对那西肽的生物合成有负调节作用,该基因的失活,有利于那西肽生物合成酶结构基因的表达,使诺西肽的产量有明显提高。     

HPLC法测定L-肌肽中的游离氨基酸的含量

目的采用柱前衍生高效液相色谱法对L-肌肽原料药中的游离氨基酸进行测定。方法采用异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)柱前衍生高效液相色谱法,使L-肌肽中游离的β-丙氨酸和L-组氨酸衍生物达到完全分离,并测定其含量。色谱柱为DiamonsilTM C18(200 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-0.05 mol.L-1醋酸钠溶液(体积比为13∶87),流速为1.0 mL.min-1,检测波长为254 nm,柱温为35℃。结果HPLC法测定β-丙氨酸和L-组氨酸的线性范围分别为2.01～20.10 mg.L-1(r=0.999 7)和2.00～20.00 mg.L-1(r=0.999 3);平均回收率分别为110.6%和98.2%。结论HPLC法无需专业的氨基酸分析仪,可用于L-肌肽中游离氨基酸的检查。     

黔产淫羊藿中淫羊藿苷和淫羊藿定C的含量测定

目的建立同时测定淫羊藿中淫羊藿苷和淫羊藿定C含量的方法 ,为淫羊藿质量控制提供依据。方法采用RP-HPLC法测定含量。色谱柱为Spherisorb C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈-水为流动相梯度洗脱,流速为1.0 mL.min-1,检测波长为270 nm,柱温为25℃。结果淫羊藿定C质量浓度在12.0~300.0 mg.L-1内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为101.05%,RSD为3.01%;淫羊藿苷质量浓度在0.4~10.0 mg.L-1内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为100.51%,RSD为2.53%。结论本方法分析时间短且重现性和稳定性较好,可作为控制淫羊藿质量的检测方法 。     

RP-HPLC法同时测定茵陈中5种化学成分的含量

目的建立同时测定茵陈中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量的方法,为茵陈药材的质量控制提供依据。方法采用RP-HPLC法。色谱柱:LunaC18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈-体积分数0.04%磷酸水溶液(体积比17∶83);检测波长:345 nm。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷质量浓度分别在0.942~18.84 mg.L-1(r=0.9995)、1.190~23.79 mg.L-1(r=0.9995)、1.107~22.14 mg.L-1(r=0.9994)、56.78~1.136×103mg.L-1(r=0.9990)、0.621 9~12.44 mg.L-1(r=0.9998)内与峰面积呈良好的线性关系(n=5);方法回收率(n=9)分别为98.1%、100.7%、98.4%、100.2%、101.7%。结论该方法可用于茵陈药材的质量控制。     

RP-HPLC法测定板栗种仁中原儿茶酸、对羟基苯甲酸和异香草酸的含量

目的建立同时测定板栗种仁中原儿茶酸、对羟基苯甲酸、异香草酸含量的方法。方法采用Dikma Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-体积分数为0.05%的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL.min-1,检测波长为260 nm,柱温为室温。结果原儿茶酸?对羟基苯甲酸、异香草酸质量浓度分别在10~100 mg.L-1?5~50 mg.L-1?50~500 mg.L-1内与峰面积具有良好的线性关系(r≥0.999 8,n=6),方法平均回收率分别为98.5%?98.0%?99.6%。结论本方法可用于同时测定板栗种仁中原儿茶酸?对羟基苯甲酸、异香草酸的含量。     

RP-HPLC法同时测定白英中绿原酸及咖啡酸的含量

目的建立RP-HPLC法同时测定白英药材中绿原酸、咖啡酸含量的方法。方法色谱柱为Di-amonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-体积分数0.05%的磷酸水溶液(体积比25∶75),检测波长327 nm,柱温45℃,流速1.0 mL.min-1。结果绿原酸质量浓度在0.5~32.0 mg.L-1(r=0.999 9)内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为99.9%,RSD为1.52%。咖啡酸质量浓度在10.0~640.0μg.L-1(r=0.999 9)内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为99.9%,RSD为1.35%。结论该方法简便、准确、重复性良好,可用于白英药材的质量控制。