CCAAT/增强子结合蛋白α对K562细胞分化和凋亡的影响及其机制

目的:研究CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein-alpha,C/EBPα)对K562细胞株分化和凋亡的影响及对相关基因的调控,为慢性粒细胞白血病的治疗提供新的治疗靶点.方法:将C/EBPα表达质粒pEGFP-C/EBPα及空载体对照质粒pEGFP分别经阳离子脂质体2000介导转染K562细胞,用G418筛选出C/EBPα稳定表达细胞株.Wright-Giemsa染色观察细胞形态学变化,FCM分析细胞表面分化抗原CD11b的表达、细胞周期及细胞凋亡,电子显微镜观察细胞凋亡,RT-PCR和Western印迹法检测细胞中相关基因Per 2、cyclin B1和C-myc的表达.结果:筛选得到稳定表达C/EBPα的细胞株pEGFP-C/EBPα-K562.与空载体转染组及对照组细胞相比,转染组K562细胞分化明显,同时粒系细胞表面分化抗原CD11b表达增加;细胞周期分析发现,转染组细胞中G2期细胞增多,与空载体组和对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),同时出现细胞凋亡峰.细胞凋亡检测结果显示,转染组细胞凋亡明显增加(21.1%),与空载体组(6.0%)和对照组(4.2%)比较,差异有统计学意义(P＜0.05);电子显微镜观察发现,转染组细胞中出现染色质浓集、断裂和核固缩等现象,并见凋亡小体;RT-PCR和Western印迹法检测发现,C/EBPα明显上调Per 2 mRNA和蛋白表达,抑制cyclinB1、C-myc mRNA和蛋白的表达.结论:C/EBPα能促进K562细胞分化,并诱导细胞凋亡,其机制可能是通过对细胞周期相关基因的调控来实现的.     

CCAAT增强子结合蛋白α在甾醇类新药NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化中的作用

目的 探讨CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在甾醇类新药NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化中的作用.方法 采用NSC67657诱导HL60细胞分化,流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD14的表达.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法连续检测C/EBPα基因和蛋白在细胞分化前后的表达情况.构建pDsRed-C/EBPα真核表达载体,基因测序后采用电转染技术,将真核表达载体转入HL60细胞中,并进行表达验证.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、瑞氏染色和流式细胞技术,观察转染细胞在NSC67657作用前后的增殖和分化情况.结果 10 μmol/L NSC67657可以诱导HL60细胞向单核系分化,连续诱导5 d后,有93.9%的细胞有CD14阳性表达.分化后的HL60细胞中,C/EBPα基因和蛋白表达均先升高后下降,分别在第2天和第3天达到峰值.真核表达载体构建成功,通过电转染和G418筛选,可获得90%以上阳性克隆.C/EBPα高表达可使HL60细胞增殖明显减缓,表面抗原CD11b的表达可达到(50.44±4.92)%.在NSC67657处理的重组质粒转染HL60细胞中,细胞单核系分化受到抑制,保留部分粒系分化.结论 NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化不一定通过C/EBPα蛋白的协调作用,但C/EBPα蛋白高表达可以阻止NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化的进程.     

人CCAAT增强子结合蛋白α基因影响骨肉瘤细胞生长活性研究

目的：构建带Myc(pXJ-40)标签的CCAAT增强子结合蛋白α(CCAATenhancerbindingproteinα,C/EBPα)的真核表达载体,并检测其对骨肉瘤细胞生长的影响。方法应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR )技术从人乳腺文库中扩增出C/EBPα全长编码区基因;将扩增基因克隆到Myc载体中,并将重组质粒转染人胚胎肾293T细胞;Western blotting检测表达情况;另将重组Myc-C/EBPα质粒转染人骨肉瘤细胞系U2OS (实验组)、Myc空载体质粒转染U2OS细胞(对照组),生长实验检测C/EBPα对肿瘤细胞生长的影响。结果成功构建Myc-C/EBPα真核表达质粒,重组质粒转染人胚胎肾293T细胞后成功表达。生长实验显示Myc-C/EBPα转染的U2OS细胞的生长明显受限,随着培养时间延长,受抑制的程度逐渐增大,培养至第5天,Myc-C/EBPα转染的实验组细胞生长抑制率为58%,且细胞的生长速率OD＝0.495明显低于空白对照组1.179,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 C/EBPα对骨肉瘤细胞的生长具有抑制作用。     

CCAAT增强子结合蛋白γ、肺耐药相关蛋白在卵巢癌中的表达及与患者预后的关系

目的 探讨CCAAT增强子结合蛋白γ(CEBPG)及肺耐药相关蛋白(LRP)在卵巢癌中的表达及与患者预后的关系.方法 选取71例卵巢癌患者作为卵巢癌组,取其卵巢癌组织标本.另外选取49例子宫肌瘤同时行附件切除患者作为对照组,取其正常卵巢组织.观察不同组织中CEBPG及LRP的表达情况,分析卵巢癌患者预后的影响因素.结果...     

多聚胞嘧啶结合蛋白E2的RNA干扰对白血病32DP210细胞分化影响的分子机制探讨

目的:Bcr/abl诱导多聚胞嘧啶结合蛋白E2 [poly(rC)-binding protein-E2,hnRNP-E2]的异常表达在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)急变中起着重要作用.本研究旨在探讨hnRNP-E2特异性小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对小鼠白血病32DP210细胞分化的影响,并初步探讨其可能的分子机制.方法:构建能表达特异性抑制小鼠hnRNP-E2基因表达的shRNA(即sh-hnRNP-E2)反转录病毒载体,经Phoenix-Ampho细胞包装后, 取上清液感染小鼠白血病32DP210细胞, 然后采用RT-PCR和Western 印迹法验证sh-hnRNP-E2对hnRNP-E2 mRNA的干扰以及蛋白表达抑制效果,瑞氏染色法观察靶细胞分化情况,FCM法检测粒系分化抗原Gr-1表达情况,Western印迹法检测下游野生型CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα)的表达情况.结果:sh-hnRNP-E2反转录病毒感染32DP210细胞后,显著抑制靶细胞内hnRNP-E2 mRNA和蛋白的表达;靶细胞形态学出现粒系分化特征,细胞表面粒系分化抗原Gr-1表达被诱导;同时,靶细胞内野生型C/EBPα蛋白的表达恢复.结论:sh-hnRNP-E2特异性沉默靶细胞内hnRNP-E2基因表达后,可促进32DP210细胞向粒系分化;其机制可能与hnRNP-E2表达受抑制后,不能再对C/EBPα的翻译模式进行异常调控,从而恢复野生型C/EBPα的表达有关.     

探讨多聚胞嘧啶结合蛋白E2诱骗RNA对32D-BCR/ABL细胞增殖的影响

目的:在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)由慢性期向急性期的过渡阶段伴随有多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-binding protein E2,hnRNP E2]的异常表达.本研究初步探讨hnRNP E2诱骗RNA(decoy RNA)对32D-BCR/ABL细胞增殖的影响及其可能的分子机制.方法:用电转染方法将hnRNP E2诱骗RNA野生序列和突变序列的表达载体(pGD和pGM)转入32D-BCR/ABL细胞,用G418筛选出稳定表达诱骗RNA的细胞.锥虫蓝染色法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力.FCM分析细胞周期,RT-PCR和Western印迹法检测下游CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα)和c-Myc的表达.结果:筛选出稳定表达野生型和突变型诱骗RNA 的32DP210-pGD细胞和32DP210-pGM细胞.野生型32DP210-pGD细胞与未转染32D-BCR/ABL细胞相比,其细胞增殖抑制率为(69.48±5.21)%,克隆形成能力明显减弱,细胞周期由G0/G1期向S期进展受阻;C/EBPα mRNA水平无改变,但在蛋白水平上42 ku-C/EBPα的表达增加(43.83±4.91)%;c-Myc mRNA水平下降(35.67±6.64)%,蛋白水平降低(30.91±3.84)%.突变型32DP210-pGM细胞与未转染32D-BCR/ABL的细胞相比,其上述各指标无明显差异.结论:hnRNP E2诱骗RNA能够抑制32D-BCR/ABL细胞的增殖,其机制可能是诱骗RNA阻断hnRNP E2和C/EBPα mRNA的结合,引起42 ku-C/EBPα表达增加,进而引起其下游靶基因c-Myc下调.     

泛素连接酶β-TrCP降解BCR-ABL 融合蛋白对白血病K562 细胞增殖的抑制*

目的:t（9;22）（q34;q11）突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML ）发病中发挥重要作用。本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N 端寡聚化区域（Oligomerization domain,OD）特异性结合的嵌合泛素连接酶E3 β-TrCP 的β-TrCP-OD-HA 的重组腺病毒载体,经泛素- 蛋白酶体途径降解BCR-ABL融合蛋白对白血病K562 细胞增殖的影响。方法:HEK293 细胞扩增野生型Ad5β-TrCP-OD-HA、突变型Ad5 Δ F-TrCP-OD-HA 及空载Ad5GFP 重组腺病毒载体,感染K562 细胞。以未感染K562细胞作空白对照,流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测外源性重组蛋白和BCR-ABL融合蛋白的表达,通过细胞增殖曲线、甲基纤维素集落形成试验、细胞周期检测β-TrCP-OD-HA 对K562 细胞增殖的影响。结果:成功建立携β-TrCP-OD-HA 重组腺病毒载体的K562 细胞株,重组腺病毒载体感染效率达66.4% 以上,β-TrCP-OD-HA、Δ F-TrCP-OD-HA 可在K562 细胞中表达。三组重组腺病毒载体感染K562 细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA 组Western blot检测BCR-ABL融合蛋白含量下降;K562 细胞生长和集落形成能力均受抑制;细胞周期显示S 期细胞数下降至10.88%±2.42% 、G0/G1 期升高至85.6%±5.61% ,与Ad5 β-TrCP-OD-HA 组、Ad5GFP 组及对照组相比,差异具有统计学意义（P 均<0.05）。 结论:重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA、Δ F-TrCP-OD-HA 能够在白血病K562 细胞中表达;β-TrCP-OD-HA 可以抑制K562 细胞的生长增殖,其机制可能与其降解BCR-ABL融合蛋白、阻滞细胞周期而实现。      

应用X线照射后的Balb/c小鼠制备白血病模型的方法学研究

目的:探索用SPF级Balb/c小鼠经X线照射后,尾静脉注射转染GFP及NeoR基因的K562细胞株以制备白血病模型的方法。方法:实验组小鼠分别经X线照射2Gy和3Gy,24小时后取对数生长期的K562(GFP+/Neo+)细胞尾静脉注射2×106个/只。对照组不予特殊处理。结果:实验组在接种5-7天时发病,分别于30、24天内全部死亡;生存天数显著短于对照组(P<0.01)。体重较对照组显著下降(P<0.05)。小鼠的白血病发病率为100%,无自发缓解。随照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中白血病细胞所占比例增加。流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP+细胞和NeoR基因在外周血、骨髓、肝、脾中的存在。结论:Balb/c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以获得白血病模型。     

三氧化二砷与HMBA对白血病K562细胞增殖抑制作用及其分子机制的研究

目的:探讨诱导分化荆对K562细胞增殖抑制的作用与分子机制.方法:通过MTT试验和细胞形态学观察K562细胞增殖的改变和分化情况.通过流式细胞仪实验检测细胞周期改变,RT-PCR检测EⅥ1、TGF-β1和WT1基因表达的变化.结果:K562细胞经六亚甲基二乙酰胺(HMBA)和(或)三氧化二砷(As2O3)作用后增殖明显受到抑制,并向不同方向分化,细胞被阻滞在G1期.K562细胞的增殖抑制作用与EVI1和WT1基因表达下调,TGF-β1基因表达上调一致.EⅥ1/β-aetin从0.925 3渐降至0.137 9,WT1/β-actin从0.995 3降至0.197 8.TGF-β1/β-actin从0.331 5增至1.245 2.结论:HMBA、As2O3及其联合抑制K562细胞增殖作用与EⅥ1和WT1基因表达下调,TGF-β1基因表达上调有关.     

刺梨汁对人白血病K562细胞生长的抑制作用

目的　通过观察刺梨汁对人白血病K5 62细胞生长的影响 ,探讨刺梨汁的抗癌作用。方法　以细胞计数和MTT法测定刺梨汁对细胞增殖的抑制作用 ,以测定细胞的乳酸脱氢酶释放量作为刺梨汁对细胞的毒性作用 ,并以K 5 62细胞形态的改变作为观察指标。结果　每mL培养液含 1μL刺梨汁即对肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用 ,每mL培养液含 2 μL刺梨汁抑制作用达到最大 ,为 83 .4% ,再加大剂量抑制作用无明显升高 ,各种剂量的刺梨汁对细胞均无毒性 ,刺梨汁的加入使得细胞体积明显变小 ,细胞核形态发生改变 ,异染色质增多。结论　刺梨汁具有一定的抗癌作用。     

水通道蛋白1基因过表达对K562细胞红系分化和增殖的影响

目的:探讨水通道蛋白1(aquaporin-1,AQP1)过表达对人慢性髓细胞白血病(chronic myeloidleukemia,CML) K562细胞红系分化和增殖的影响.方法:以人脑cDNA文库为模板,通过PCR扩增出AQP1基因的编码序列,构建pBABE-puro-AQP1真核表达载体;感染K562细胞,筛选建立稳定过表达AQP1基因的K562细胞株(命名为K562-AQP1);实时荧光定量PCR法、细胞免疫荧光染色法及蛋白质印迹法分别检测AQP1转录和蛋白表达水平.通过MTT法检测细胞生长增殖、实时荧光定量PCR法检测γ珠蛋白表达和分光光度法检测血红蛋白含量,研究AQP1过表达对K562细胞红系分化和增殖的影响.结果:与空载体对照组相比,pBABE-puro-AQP1转染入K562细胞后AQP1 mRNA和蛋白表达水平皆有显著升高(P＜0.01),K562-AQP1细胞中红系分化指标γ珠蛋白和血红蛋白表达水平明显增加,同时细胞生长速度明显降低(P＜0.05).结论:AQP1过表达可以显著促进K562细胞向红系分化,同时抑制细胞增殖.推测AQP1可能成为临床诱导分化治疗CML的基因靶点之一.     

靶向激活蛋白激酶PKR对白血病K562细胞增殖的影响及机制

背景与目的:由t(9;22)(q34;q11)导致的bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中起着重要的作用.本研究运用CML特异的bcr/abl融合基因的mRNA与外源重组反义RNA形成双链RNA (double strand RNA,dsRNA)能激活双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)的策略,研究其对白血病K562细胞增殖的影响及可能的机制.方法:将dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞啶酸(Polyriboinosinic Polyribocytidylic Acid,polyIC)、含ber/abl融合基因序列40bp的逆转录病毒载体RV-40AS、RV-40AS 2-氨基嘌呤(2-aminopurine,2AP)和含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的逆转录病毒载体RV-GFP作用于K562细胞,并以ECV304细胞作对照细胞株.通过细胞计数、MTT法和半固体集落形成实验检测其对细胞生长增殖的影响,用流式细胞仪检测处理前后细胞周期的变化,用Western blot法检测细胞内PKR、磷酸化PKR(phosphated PKR,p-PKR)、真核翻译启始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)、磷酸化eIF2α(phosphated eIF2α,p-eIF2α)蛋白表达的变化,用3H-亮氨酸掺入实验检测细胞总蛋白合成水平的变化.结果:polyIC对K562细胞和ECV304细胞生长和增殖均具有非特异性抑制作用.而RV-40AS仅对K562细胞具有特异性的抑制效应.PKR抑制剂能阻断RV-40AS对K562 细胞的抑制效应.polyIC和RV-40AS作用K562细胞24 h 后,S期细胞减少[polyIC组(37.26±2.35)%,未处理组(58.53±5.42)%,P＜0.05;RV-40AS组(31.48±3.65)%,未处理组(58.53±5.42)%,P＜0.05],G0/G1期细胞增多[pdylC组(50.97±2.18)%,未处理组(36.44±4.20)%,P＜0.05;RV-40AS组(57.47±3.61)%, 未处理组(36.44±4.20)%,P＜0.05].polyIC处理K562细胞组、ECV304细胞组以及RV-40AS处理K562细胞组的p-PKR和p-eIF2α蛋白表达显著上调,且总蛋白合成水平下降[RV-40AS处理的K562细胞组(3.5±1.9)cpm/ng,未处理组(26.8±2.6)cpm/ng,P＜0.05].结论:外源重组反义RNA与bcr/abl融合基因的mRNA形成的dsRNA可通过激活PKR而抑制K562细胞的生长增殖,其机制是通过活化的PKR使蛋白合成启始因子eIF2a磷酸化,从而阻断细胞内蛋白合成的启动,及阻止细胞周期进程来实现.     

大蒜素对K562细胞株及裸鼠移植瘤的抑制作用

目的探讨大蒜素对K562细胞株及裸鼠移植瘤的作用。方法利用MTT法检测不同浓度大蒜素对K562细胞的增殖抑制影响;Annexin V—FITC标记法检测K562细胞凋亡;建立K562细胞Balb／c裸鼠皮下移植瘤模型,荷瘤小鼠随机分成4组,分别用1．5、3、6mg／ml大蒜素和生理盐水对瘤体进行局部注射,每次0.1ml,隔日1次,连续7次,观察瘤体变化。结果不同浓度大蒜素对K562细胞均有抑制作用,呈明显的剂量依赖性,抑制率分别为21．5％、55．1％、81．6％（P〈0．05）;0．005mg／ml大蒜素诱导K562细胞凋亡作用最显著,0．025mg／ml大蒜素使K562细胞呈中毒反应,凋亡作用不明显;大蒜素组瘤体生长较对照组明显受到抑制,抑瘤率分别为18．5％、79．2％、91．6％。结论大蒜素具有显著抑制K562细胞增殖及促凋亡的作用．能有效抑制K562细胞Balb／c裸鼠移植瘤的生长．     

转录因子CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)与肺癌

C/EBPα在细胞的增殖、分化、代谢、炎症、新陈代谢等反应中发挥重要作用。机体通过蛋白质-蛋白质相互作用、基因突变和翻译后修饰等方式引起C/EBP a转录抑制或活性丧失,从而可能诱发肿瘤。近年来研究发现C/EBPα可能通过Ras、p53、c-Myc等信号传导通路上调或下调癌基因从而促进或抑制肿瘤发生,尤其是肺癌。本文结合国外研究现状,对C/EBPα在肺癌中可能发挥的作用进行综述。     

浙江蝮蛇蛇毒成分的分离及其对K562细胞的增殖抑制作用

[目的]分离纯化浙江蝮蛇蛇毒主要组分并分析其对抑制白血病细胞株K562的细胞增殖作用。[方法]采用DEAE-Cellulose、CM-Sephadex C-50和Sephadex G-75柱层析,以离子交换和凝胶过滤法从蝮蛇蛇毒中分离纯化主要组分;SDS-PAGE检测其纯度和估计其分子量;MTT及FCM方法检测蛇毒主要组分对白血病细胞的增殖抑制。[结果]从浙江蝮蛇蛇毒中分离纯化得到一分子量约为30kD组分,该组分对白血病细胞具有较强的细胞增殖抑制作用,且呈剂量依赖性关系,5.0、10.0mmol/L浓度时对K562细胞增殖抑制率分别达26.32%和32.28%,并使细胞阻滞于G2/M期。[结论]浙江蝮蛇蛇毒可抑制白血病细胞的增殖,其有较好的应用前景。     

人核糖体蛋白L6对白血病K562/A02细胞耐药性的影响

目的观察核糖体蛋白L6(RPL6)表达的改变对白血病耐药性的作用。方法通过RT-PCR方法获得RPL6cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1( )分别构建正向插入和反向插入的RPL6cDNA重组质粒。以脂质体将正义RPL6cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6cDNA真核表达质粒转染K562/A02细胞,以MTT观察其对化疗药物耐药性的作用。结果转染正义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562细胞对阿霉素的耐药性比未转染的K562细胞增强3.25倍,转染反义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药性比未转染的K562/A02细胞降低62%。结论RPL6基因过表达在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用。     

应用X线照射后的Balb／c小鼠制备白血病模型的方法学研究

目的：探索用SPF级Balb／c小鼠经x线照射后,尾静脉注射转染GFP及NeoR基因的K562细胞株以制备白血病模型的方法。方法：实验组小鼠分别经x线照射2Gy和3Gy,24小时后取对数生长期的K562（GFP＋／Neo＋）细胞尾静脉注射2×10 6个／只。对照组不予特殊处理。结果：实验组在接种5—7天时发病,分别于30、24天内全部死亡;生存天数显著短于对照组（P〈0．01）。体重较对照组显著下降（p〈0．05）。小鼠的白血病发病率为100％,无自发缓解。随照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中自血病细胞所占比例增加。流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP＋细胞和NeoR基因在外周血、骨髓、肝、脾中的存在。结论：Balb／c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以获得白血病模型。     

新型维甲酸衍生物ATPA对白血病细胞株K562增殖及分化的影响

目的:本研究探讨新型维甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基依曲替酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl acitretinate,ATPA)对白血病K562细胞体外增殖和分化的作用。方法:用不同浓度的ATPA作用白血病K562细胞后,在体外通过MTT法检测和绘制细胞生长曲线来分析细胞增殖;瑞特染色法观察细胞形态学改变;氯化硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium chloride,NBT)还原实验分析细胞的分化指标;采用FCM法检测细胞表面分化抗原及细胞周期的变化。结果:ATPA呈浓度依赖性抑制K562细胞增殖,明显的抑制作用从药物作用48h后开始出现,在72h后作用更明显。倒置显微镜下观察发现ATPA作用后K562细胞形态趋向成熟,NBT阳性细胞率增加;G0/G1期细胞表达量增加,S期细胞表达量减少,呈G0/G1期阻滞;细胞表面分化抗原CD71表达减少。结论:ATPA对白血病K562细胞具有抑制增殖和一定的诱导分化作用。