模拟咬合压力对人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响

目的：观察模拟咬合压力对人牙周膜成纤维细胞环氧化酶-2(COX-2)基因表达的影响。方法：原代培养人牙周膜成纤维细胞，应用可控压力细胞加载装置模拟咬合压力，分别施加30、60、90kPa的间歇性压力，每次15min，每天3次，在3、5d后提取细胞总RNA，定量后点于尼龙膜上，同时利用引物扩增COX-2基因的一段特异性片段作为cDNA探针，将探针同位素标记后与膜杂交，以观察COX-2在mRNA水平表达的变化。结果：加载模拟咬合压力的人牙周膜成纤维细胞COX-2表达水平明显高于对照组，而且在一定范围内表达水平与加压力值成剂量依赖关系；各加压组加压3d与5d之间细胞COX-2mRNA表达无明显差异。结论：加载模拟咬合压力条件下培养的人牙周膜成纤维细胞COX-2基因表达增高。     

人牙周膜成纤维细胞体外培养条件的优化

目的：优化体外人牙周膜成纤维细胞(HPLF)培养条件，以提高原代HPLF培养成功率。方法：采用玻璃及塑料培养瓶、DMEM、RPMI1640培养液以及胎牛血清、小牛血清，分别比较原代牙周膜成纤维细胞游出率。结果：塑料培养瓶细胞游出率以及细胞游出最短时间均优于常用玻璃培养瓶；两种不同血清比较，胎牛血清的组织块贴壁以及细胞游出率均明显优于小牛血清；RPMI1640比DMEM培养液更适合于HPLF培养。结论：商品塑料培养瓶、胎牛血清、RPMIl640是提高体外HPLF培养成功率的关键。     

人牙周膜成纤维细胞增殖与压力关系的初步观察

目的：在体外培养环境下观察压力对人牙周膜成纤维细胞（HPLF）增殖的影响。方法：取第4－6代培养的HPLF,应用可控压力细胞加载装置分别间断性施加30、60、90kPa的压力,分别在培养3、5、7d后用MTT法测定各组的A值。结果：HPLF在30、60、90kPa的压力培养环境下MTT反应的A值显著小于对照组,压力值越大,A值越小。结论：30、60、90kPa间断性压力显著抑制PLF细胞增殖,该抑制作用随压力值增大而增强。     

人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞生物学活性的研究

目的:体外原代培养人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞,并对其生物学活性作初步探讨.方法:采用组织块法原代培养牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞,绘制生长曲线,测定二者碱性磷酸酶活性;流式细胞术和免疫组化染色法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原、骨形成蛋白的表达情况,观察对比两种细胞的生物学特性的异同.结果:牙龈成纤维细胞原代培养成功率及细胞增殖活性明显高于牙周膜细胞.在牙周膜细胞中,Ⅰ、Ⅲ型胶原均为阳性表达,棕黄色颗粒克满整个胞浆内.在牙龈成纤维细胞中Ⅰ型胶原为弱阳性表达,Ⅲ型胶原阳性表达更弱.牙周膜细胞的ALP水平明显高于牙龈成纤维细胞.牙周膜细胞BMP2表达为强阳性,而牙龈成纤维细胞表达弱阳性.结论:牙周膜细胞具有较强的成骨能力,是理想的牙周组织工程的种子细胞.牙龈成纤维细胞易于培养成活,增殖力强,具有牙周膜细胞的一些特点,组织取材方便,也可作为牙周组织工程的种子细胞.     

两种体外培养人牙周韧带成纤维细胞方法比较

目的探索一种在体外短时间内简便、可靠获取大量人牙周韧带成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast,HPLF)、建立稳定的体外培养体系的方法。方法采用酶消化法和组织贴块法进行HPLF体外原代培养及传代培养的对比研究。通过细胞形态学、超微结构观察及波形蛋白和角蛋白免疫组化染色等对细胞进行定性研究;测定细胞生长曲线了解细胞生长基本规律及其增殖能力。结果采用酶消化法和组织贴块法均可成功的进行HPLF连续传代培养。最高传代数为30代。培养的细胞具有成纤维细胞的典型形态,波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,生长稳定期倍增时间为48~72h。组织块培养法需培养时间长,原代培养获取的细胞量较少,较难传代。酶消化法可短时间内获取大量细胞,细胞产量高,但操作手续复杂易污染,细胞易受损伤。结论成功建立了一个稳定的HPLF体外培养体系。除常用的组织块法外,胰蛋白酶及胶原酶联合消化法不失为一种简便、快速、可靠的组织原代分离培养方法。     

压力作用时间对人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1的影响

目的:探讨压力作用不同时间对人牙周膜成纤维细胞表达TGF-β1的影响.方法:本实验采用细胞加载装置,对人牙周膜成纤维细胞施加1.0MPa的压力,分别持续1Omin、30min、50min、通过酶联免疫吸附实验,分别检测细胞受力后6h、12h、18h、24h时TGF-β1的含量.结果:加载1Omin组在细胞受力后的各个时段TGF-β1含量与对照组相比无显著性差异(P>0.05).加载30min组(0.51±0.06)和加载50min组(0.46±0.06)TGF-β1含量在细胞受力后的第12h同对照组(0.78±0.08)相比明显降低(P<0.05).结论:在一定加载时间内,人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1量随着压力作用时间的延长而有所降低.     

雌激素受体β对牙周膜成纤维细胞RANKL表达的影响

目的：研究雌激素受体β（estrogen receptorβ,ERβ）对人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament,HPLF）核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）表达的影响。方法：采用基因干涉方法抑制了HPLF细胞中ERβ基因的表达,用雌激素干预ERβ抑制的和未抑制的HPLF细胞,研究细胞RANKL表达的情况。结果：雌激素明显降低了ERβ抑制的HPLF细胞RANKL的表达,但对ERβ未抑制的HPLF细胞RANKL的表达没有显著影响。结论：雌激素可能通过ERβ抑制牙周膜成纤维细胞RANKL的表达。     

尼古丁对人牙周膜成纤维细胞中Fas/Apo-1（CD95）表达的影响

目的：研究尼古丁（nicotine）对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）中Fas/Apo-1（CD95）表达的影响。方法：采用组织块培养法培养原代人牙周膜成纤维细胞并传代取处于对数生长期的第6代细胞用于实验,采用浓度为2mg/L的尼古丁处理第6代牙周膜成纤维细胞72h,通过免疫组织化学染色法检测尼古丁对人牙周膜成纤维细胞中Fas表达的情况。结果：证实尼古丁作用于人牙周膜成纤维细胞后,胞膜中Fas/Apo-1（CD95）抗原呈阳性表达。结论：提示尼古丁可通过Fas系统这一途径导致人牙周膜成纤维细胞的凋亡,从而加重牙周组织破坏的程度和影响牙周组织的再生。     

Nd：YAG激光照射对提高人牙周膜成维细胞增殖力的作用

目的观察Nd：YAG激光对人牙周膜成纤维细胞增殖和碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法采用酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞，并进行波形蛋白及角蛋白的免疫细胞化学染色，对所培养的细胞进行鉴定。将牙周膜成纤维细胞分组，接受不同能量密度的Nd：YAG激光照射。测定牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性并观察其生长情况。结果5个实验组的细胞增殖速度及碱性磷酸酶含量均高于对照组，其中能量密度为60j／cm^2组、80j／cm^2组、100i／cm^2组与对照组相比有统计学的差异。结论低能量密度，短时间的Nd：YAG激光照射能促进牙周膜成纤维细胞的增殖，提高碱性磷酸酶活性。     

p38丝裂原激活蛋白阻断剂对机械压力诱导人牙周膜成纤维细胞表达白介素-6的影响

目的分析p38丝裂原激活蛋白(MAPK)在压力诱导人牙周膜成纤维细胞(HPLF)合成炎症因子白介素(IL)-6过程中所起的作用。方法以p38MAPK阻断剂SB203580对HPLF预处理60min,然后用酶联免疫吸附法检测HPLF受200kPa压力刺激后培养上清内IL-6蛋白水平,比较预处理组与对照组2之间IL-6含量的差异。结果加压后16和24h两时间点加力组均较对照组1IL-6表达量显著增高;而预处理组较对照组2IL-6表达量下降。结论p38MAPK是机械压力诱导HPLF产生IL-6的重要环节。     

GM-CSF对牙周膜和牙髓成纤维细胞的生物学作用

目的 :观察GM -CSF对牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞的生物学作用。方法 :原代培养牙髓成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞 ,用MTT法测定细胞增殖 ,酶动力学方法测定ALP活性。结果 :在观察期 (3～7d)GM -CSF可使两种细胞出现明显的增殖 ,而不能诱导ALP的表达。结论 :GM -CSF的浓度在 0 .0 0 1～ 1mg/L之间对牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞有明显的增殖效应 ,大于 1mg/L时对增殖有明显的抑制作用。     

人牙周膜成纤维细胞的培养及牵张应变诱导凋亡研究

目的:探讨人牙周膜成纤维细胞的分离、培养及在牵张应变作用下发生早期凋亡的情况。方法:刮取健康人前磨牙牙周膜,进行牙周膜成纤维细胞的分离、培养及生长曲线描绘。经3～4代传代培养后,对细胞加载1%～20%的牵张应变,加载时间分别为30min,1h、6h、12h然后通过流式细胞仪检测Annexin V-FITC(异硫氰酸荧光素)及激光扫描共聚焦显微镜进行细胞的早期凋亡鉴定。结果:人牙周膜成纤维细胞传代到12代以后,细胞逐渐呈衰老生状,胞体变大,细胞生长缓慢。人牙周膜成纤维细胞的凋亡率在30min组低于对照组,但两者间无统计学差异。在6h内,人牙周膜成纤维细胞的凋亡情况随加载时间和加载应力的增加而增加(P<0.05)。在12h时所有组的细胞凋亡均减少。结论:人牙周膜成纤维细胞的使用最好在12代以内,尤其是3～4代细胞的活力、增殖能力较好。牵张应变可以诱导细胞发生早期凋亡。     

人牙髓成纤维细胞等的体外培养、生长特性和鉴定

本实验从人恒牙分离牙髓组织,牙周组织和取鼠胚胎骨作体外培养。收集标本40个,培养出牙髓成纤维细胞7株,牙周膜成纤维细胞16个标本生长原代细胞8株,5个胚胎骨组织均生长7d以上。牙髓和牙周膜成纤维细胞形态典型,抗波形丝蛋白阳性。证明是中胚层来源的成纤维细胞,细胞生长曲线分裂指数显示细胞增殖正常,牙周膜细胞增长速度快于牙髓细胞。说明体外培养人牙髓和牙周膜细胞是可行的。     

体外培养牙周膜成纤维细胞矿化能力的实验研究

研究牙周膜成纤维细胞的体外矿化能力。方法用组织块培养法进行人牙周膜成纤维细胞的原代培养，第三代细胞用矿化液长期培养，倒置显微镜下观察矿化情况，ｖｏｎ－Ｋｏｓｓａ染色显示钙盐沉积，扫描电镜下察矿化结节。     

人牙龈成纤维细胞和牙周膜成纤维细胞的培养和生物学特征

目的：探讨采用不同方法建立体外培养人牙龈成纤维细胞和人牙周膜成纤维细胞并对其生物学特性作初步探讨。方法：分别采用消化培养法和组织块培养人的牙龈和牙周膜成纤维细胞。通过倒置显微镜活体观察，以及光镜、透射电镜、免疫组化和生长曲线等方法对其生物学特性作初步观察。结果：消化培养法成功率低于组织块培养法。光镜下和透射电镜下观察两种细胞在形态和结构上相似。免疫组化染色证实此两种细胞均来源于中胚层的纤维母细胞。生长曲线表明牙龈成纤维细胞的倍增时间比牙周膜成纤维细胞稍短，而牙周膜成纤维细胞的增殖活性比牙龈成纤维细胞高。结论：组织块培养法适用于此二种细胞的培养。细胞生物学特征方面有许多相似形，提示这两种细胞来于同一个细胞群。     

人牙周膜细胞在弹性牵张力作用下核心结合因子mRNA的表达

目的 :探讨人牙周膜细胞在应力作用下的成骨特性和核心结合因子 (core bindingfactor α1,CBF α1)在正畸成骨中的作用机制 ,及其在正畸牙齿移动中的作用机制。方法 :组织块法原代培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞 ,用大鼠颅骨成骨细胞进行CBFα1cDNA片段的克隆和序列测定。制备大鼠CBF α1cDNA探针。组织块法原代培养人牙周膜细胞 ,弹性膜及体外培养细胞加载系统加载弹性牵引力 ,在加力状态下细胞分别培养 12h ,2 4h和 4 8h ,对照组培养板在同一孵箱内培养。原位杂交方法检测CBF α1mRNA的表达。结果 :倒置显微镜下观察 ,原代培养的成骨细胞呈多角形 ,呈复层重叠生长 ,可形成钙化结节。人牙周膜细胞的形态为长梭形 ,呈放射状生长。RT PCR方法从大鼠颅骨成骨细胞RNA中克隆出的CBF α1cDNA片段 ,大小约 70 0bp。正常人牙周膜细胞未检测到CBF α1mRNA阳性表达。加力 12h ,2 4h和 4 8h的人牙周细胞中均见有CBF α1mRNA阳性表达的细胞。结论 :弹性牵张力可以诱导人牙周膜细胞向成骨样细胞分化 ;CBF α1是正畸成骨的调控途径之一。     

用原代培养方法建立炎症性牙龈和牙周膜组织细胞有限细胞系

体外培养方法、培养条件、病例标本来源的特殊性、细胞种类及实验技巧等均影响各自原代细胞培养的成功率,同时也是限制了很多研究的原因之一.虽然已有报道尝试通过克隆杂交、基因转染技术建成体外无限细胞系,但不可避免地含有部分肿瘤样细胞的特性,其结果的参考价值受到影响.临床健康者来源的牙龈和牙周膜成纤维细胞培养方法已有介绍且成功率较高[1～4],但炎性病变时牙龈和牙周组织的表现和反应至今未见专门报道.作者结合有关炎症牙周组织成纤维细胞体外培养实验报道[5～7],将培养牙周炎症组织原代成纤维细胞的方法介绍如下.     

机械压力对人牙周膜成纤维细胞TGF-β1蛋白表达的影响

目的：探明机械压力与人牙周膜成纤维细胞转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1,TGF-β1）蛋白表达的关系。方法：本实验采用细胞加载装置,对人牙周膜成纤维细胞施加0kPa、250kPa、500kPa、1000kPa的压力,通过酶联免疫吸附实验,分别检测细胞受力后6h、12h、18h、24h时TGF-β1的含量。结果：加载250kPa组、500kPa组在细胞受力后各个时段TGF-β1含量没有变化;1000kPa组在细胞受力后的第12h,TGF-β1含量显著降低。结论：人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1受到机械压力的调控;在一定载荷作用下,TGF-β1的含量随着压力的增大而有所降低。     

体外培养人牙周膜成纤维细胞及其成骨表型特征检测

目的　探讨牙周膜成纤维细胞作为牙周组织工程种子细胞的可行性。方法　采用酶消化法体外培养人牙周膜成纤维细胞 ,以人胎儿皮肤成纤维细胞为对照检测细胞碱性磷酸酶表达及矿化能力。结果　体外培养人牙周膜成纤维细胞与人胎儿皮肤成纤维细胞相比表达更高水平的碱性磷酸酶 (P <0 .0 5 ) ,矿化诱导液连续培养 30d均可观察到矿化结节形成。结论　采用酶消化法可快速简便地获取原代人牙周膜成纤维细胞。体外培养牙周膜成纤维细胞具有成骨样细胞表型特征 ,与人胎儿皮肤成纤维细胞相比更具分化潜能 ,可作为牙周组织工程种子细胞来源     

雌激素受体β对牙周膜成纤维细胞OPG表达的影响

目的:研究雌激素受体β(ERβ)对人牙周膜成纤维细胞(HPLF)的骨保护因子(OPG)表达的影响.方法:合成ERβ基因的干涉载体,以脂质体法转染至HPLF中,Western blot及RT-PCR法检测转染效率.鉴定后用雌激素干预ERβ十涉载体转染和未经转染的HPLF,研究细胞OPG的表达情况.结果:ERβ干涉载体可特异地抑制HPLF中ERβ的表达.雌激素明显增强了未转染的HPLF的OPG表达,但对稳定转染的HPLF的OPG表达没有显著影响.结论:雌激素主要通过ERβ促进人牙周膜成纤维细胞OPG的表达.