荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究

目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较。结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M2基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2·56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0·999,扩增效率为108·5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的：建立双重荧光定量RT—PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒，并应用于临床样本的检测。方法：在A型流感病毒M基因和B型流感病毒NP基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针，建立优化单一和双重荧光RT—PCR反应体系，评价所建双重RT—PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性，并应用于疑似流感含漱液标本检测。结果：该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性，检出限分别为0．1TCID50和0．01TCID50，可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸。构建的体系定量标准曲线相关系数分别为0．998和0．999，具有较好的稳定性。结论：本研究建立的双重荧光定量RT—PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒，灵敏度高，稳定性好，是一种快速检测流感病毒的新方法。     

荧光定量RT-PCR快速检测N_2亚型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立快速检测甲型流感病毒N2亚型的方法。方法根据N2亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系后,采用十倍稀释法检验建立体系的灵敏度并建立相对定量标准曲线;采用N1亚型毒株核酸进行方法特异性检验并对临床疑似流感样病例样本进行检测。结果N2亚型流感病毒的检测灵敏度为2.56×10-6,扩增效率为99.9%,标准曲线r=0.997,特异性为100%。临床ILI样本检测结果与HAI鉴定结果相符。结论本研究建立的荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确的检测N2亚型流感病毒。     

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR快速检测副流感3型病毒

目的:建立特异、快速、灵敏的荧光定量RT-PCR方法用于副流感3型病毒核酸检测。方法:对副流感3型病毒的N基因应用C lustalW软件进行序列同源性比对,在保守区设计特异性引物和TaqM an-MGB探针,并对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性,敏感性和稳定性,同时应用于疑似患者临床标本检测。结果:该方法对副流感3型病毒核酸检测有高度特异性,与副流感1、2、4型,甲型、乙型流感病毒,麻疹病毒,风疹病毒,腮腺炎病毒,呼吸道合胞病毒和腺病毒等均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似患者含漱液标本中直接检出,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:本研究建立的TaqM an荧光定量RT-PCR是一种快速检测副流感3型病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。     

荧光定量RT-PCR法快速检测麻疹病毒核酸

麻疹是由麻疹病毒引起的一种以发热、呼吸道症状和出疹为特征的急性传染病。目前确诊麻疹的实验室手段主要是用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测麻疹特异性IgM抗体,但在感染初期以及免疫功能低下的患者中该抗体的滴度较低,ELISA法检测可能为阴性[1]。而近年发展起来的荧光定     

荧光定量RT-PCR快速检测人副流感2型病毒的研究

[目的]建立人副流感2型病毒的实时荧光定量RT-PCR快速检测方法。[方法]根据GeneBank数据库中已有的人副流感2型毒株的HN基因核苷酸序列,用DNASTAR生物软件进行同源性分析比较,选出高度保守且特异的核苷酸区域,用Primer5软件设计人副流感2型病毒的引物和TaqMan核苷酸探针。建立PCR反应体系,并优化反应条件。[结果]建立了人副流感2型病毒的实时荧光定量PCR快速检测方法,并有较高的特异性。[结论]本研究建立实时荧光定量PCR检测方法可以快速的检测人副流感2型病毒,可以用于临床的早期诊断。     

衢州市2009年流感病毒荧光定量RT-PCR检测结果分析

目的了解衢州市流感病毒的感染情况,为制定预防和控制流感策略提供依据。方法采用荧光定量RT-PCR方法,对衢州市692例流感标本进行检测。结果共检测出甲1型流感25份,阳性率3.61%;甲3型流感117份,阳性率16.91%;乙型流感18份,阳性率2.6%;甲型H1N1流感242份,阳性率34.97%。结论衢州市流感形势不容乐观,需要有关部门加大对流感的防控力度。     

B型呼吸道合胞病毒荧光定量RT-PCR检测

目的建立B型人呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的快速荧光定量RT-PCR检测方法。用于B型RSV实验室早期诊断与病毒核酸的定量分析。方法利用B型RSVN基因保守区设计引物和TaqMan-MGB（minor groove binder，DNA小沟结合物）探针，优化反应体系和反应条件；并对方法进行特异性、灵敏度和重复性评价；同时以10倍梯度稀释的质粒为标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线，构建定量分析模型。并用该方法对100份临床呼吸道样本进行检测。结果该方法与其他呼吸道病毒均无交叉反应，检测灵敏度达1TCID50／ml 50％组织培养物感染剂量病毒滴度，临床样本中B型RSV的检测阳性率达18％。结论B型RSV荧光定量RT-PCR检测方法快速、敏感、特异，适用于B型RSV的早期诊断和核酸定量分析。     

肠道病毒EV71荧光定量RT-PCR法快速检测

手足口病 (HFMD)是由多种人肠道病毒感染引起,其中以EV71及Cox A16型最为常见 (1-3).由于肠道病毒传统的检测方法是病毒分离中和法定型,繁琐费时,不适合早期诊断.逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法敏感、特异、快速,但由于PCR扩增产物需要凝胶电泳检测,易造成实验室交叉污染.本研究建立的肠道病毒EV71TaqMan荧光定量RT-PCR方法,具有敏感、特异、快速和实时在线检测等特点,较RT-PCR法具有更多的优点,适合于突发疫情的实验室早期诊断,该方法的建立为手足口病感染实验室检测提供了有效的分子生物学检测手段.现报告如下.     

巢式聚合酶链反应检测感染树鼩中乙型肝炎病毒DNA

[目的]运用巢式聚合酶链反应(Nested-PCR)检测人HBV在树鼩体内感染,并探讨Nested-PCR在树鼩感染模型研究中的意义。[方法]用本实验室自繁树鼩,无感染史,年龄在1d龄至4月龄的树鼩,经肌肉、腹腔或者股静脉等多种途径接种人HBV(约含1×107HBV DNA copies/ml)。接种后定期抽血,用Nested-PCR检测血清中的HBV DNA情况。[结果]在111只感染了人HBV的树鼩血清中,经Nested-PCR检测,共有46只树鼩检测出HBV DNA,动物感染的阳性率为41.44%(46/111)。其中1～30d龄的66只树鼩检测出HBV DNA的有33只,阳性率50%;31d龄至4月龄的45只树鼩检出HBV DNA的有13只,阳性率28.89%,两者阳性率比较差异有统计学意义(P﹤0.05)。在Nested-PCR检测过程中,所有的动物血清的第1轮PCR扩增结果均为阴性,经第2轮PCR扩增则出现阳性结果。Nested-PCR扩增产物经测序证实为目的基因(HBV C区)的序列。[结论]选择幼年树鼩感染HBV,可提高树鼩的感染率;Nested-PCR比普通PCR方法更敏感、更特异,能有效的提高树鼩血清中HBV DNA的检出率,有较大的实用价值,为研究树鼩感染人HBV模型建立了一种良好的检测方法。     

PCR法检测食品中的致病性小肠耶尔森氏菌

目的：快速准确地检测致病性小肠耶尔森氏菌（YE）。方法：根据该菌染色体上ail基因顺序设计一对引物、通过聚合酶链反应直接检测食品中的致病性YE，扩增产物经电泳，出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的170bp的ail基因片断的条带，即判定该样品为阳性，结论：本法特异性强，灵敏度高，能在60小时内出结果，可适用于食品中的YE的快速检验。     

甲型H1N1流感病毒real-time RT-PCR检测方法的研究与应用

[目的]建立一种特异、灵敏、快速的Real-Time RT-PCR方法用于检测甲型H1N1流感病毒核酸.[方法]采用WHO所推荐的引物与探针序列,对Real-Time RT-PCR反应体系和反应条件进行调整优化,检测该方法的特异性和灵敏度.并对疑似甲型H1N1流感病例咽拭子标本进行检测.[结果]该方法对甲型H1N1流感病毒的检测的灵敏度达10-7(HA滴度为1:128),可从疑似甲流感患者咽拭子中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右.[结论]建立的TagMan探针法Real-Time RT-PCR是一种检测甲型H1N1流感病毒的快速、特异、敏感的新方法,适合于基层疾控机构及医院开展甲型H1N1流感的应急检测.     

食品中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法

[目的]建立食品中单核细胞增生李斯特菌的快速、敏感、特异的PCR检测方法。[方法]选择Hly基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对单增李斯特菌和10株非单增李斯特菌进行PCR扩增，并且用此方法对30份食品进行检测。[结果]扩增片断表现出极好的单增李斯特菌特异性，最低检出限为190cfu/ml。[结论]本实验建立的PCR检测方法为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌检测方法。     

用聚合酶链反应技术研究含氯消毒剂对乙型肝炎病毒的杀灭作用

本文研究了聚合酶链反应测定乙型肝炎病毒灭活效果的方法，并用该方法研究了氯消毒剂对乙型肝炎病毒的灭活作用，结果表明，灭活１０倍聚合酶链反应灵敏度的Ｄａｎｅ颗粒中核酸，需要有效氯２５００ｍｇ／Ｌ作用３０分钟以上，研究有机物对灭活作用的影响表明，１％小牛血清可使氯破坏作用减弱。由此推测，Ｄａｎｅ颗粒中核酸对含氯消毒剂有较高的抵抗力，并讨论了含氯消毒剂对乙型肝炎病毒的灭活机理。     

单克隆抗体对甲_1型流感病毒的抗原分析和快速诊断的研究

用宁夏地区分离的甲,型流感毒株宁防86—27(H_1N_1)制备了抗甲_1型流感病毒血凝素的McAb39株,其血抑滴度在1:2000—1:256000,Ig亚类为IgG_1、IgG2a、IgG2b。用自制的McAb对宁夏历年分离的甲_1型毒株的抗原分析表明:抗原漂移存在,且以1981和1987年的毒株抗原漂移明显。用我们的McAb对甲_1型毒株的间接免疫荧光试验,证实此法特异性好,敏感性高,确有早期快速诊断的意义。     

山东蒙阴县恙虫病立克次体的PCR检测和分型研究

本文报告采用恙虫病立克次体表面蛋白５６ＫＤａ基因编码区构建的群、型特异引物，ＰＣＲ检测１４份恙虫病患者血提取的ＤＮＡ模板，扩增后均见有３１７～３３２ｂｐ片段的扩增带。与血清学检测比较，ＰＣＲ具有敏感、早期诊断的意义。群引物扩增的阳性产物再经ＰＣＲ分型，结果证明山东蒙阴地区存在Ｋａｗａｓａｋｉ型Ｒｔ。     

石河子市2009～2010年流行性感冒病毒核酸检测结果分析

[目的]对石河子市2009年9月～2010年3月流行期流感病毒进行核酸检测及分析,了解石河子市流感流行情况.[方法]采集流感样病例的咽拭子用逆转录一聚合酶链反应（PCR法）检测流感病毒.[结果]2009年9月～2010年3月共检测1所哨点医院流感样标本385份,检出流感病毒84份,阳性率为21.82％,其中甲型H1N1...     

应用聚合酶链反应检测肝病患者HBV-DNA和HCV-RNA结果分析

应用聚合酶链反应(PCR)进行HBV-DNA和HCV-RNA检测,了解HCV在各型肝病中感染情况.