短波紫外线灭活血小板中病毒的实验研究

目的建立短波紫外线(UVC)对血小板悬液中伪狂犬病毒和辛德毕斯病毒灭活的实验方法,探讨UVC法对血小板计数的影响。方法以伪狂犬病毒和辛德毕斯病毒为试验病毒,Vero细胞为培养细胞,用病毒感染细胞,制备病毒增殖液;用SSP+盐溶液替代血浆重悬血小板;含不同浓度核黄素的血小板SSP+悬液分别以不同辐照剂量的UVC照射,通过细胞感染试验评价灭活效果,筛选最佳灭活条件。用血液细胞分析仪测定UVC处理前后血小板的计数。结果短波紫外线对血小板病毒灭活作用显著,单面辐照强度为4.32 mw/cm2,照射30 s能使血小板SSP+悬液中伪狂犬病毒和辛德毕斯病毒滴度均下降超过4个对数级;照射1 min,伪狂犬病毒全部灭活(下降5.38个对数级),辛德毕斯病毒全部灭活(下降4.59个对数级),UVC处理后血小板计数明显下降,P0.05;UVC联合核黄素,在相同的照射时间下,添加核黄素组与单独使用UVC组对病毒滴度降低不明显,差异无统计学意义。在辐照剂量相同的条件下,添加核黄素组血小板计数降低较无核黄素组降低缓慢,两两比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 UVC法可有效灭活血小板中伪狂犬病毒和辛德毕斯病毒;SSP+盐溶液替代血浆重悬血小板进行UVC照射,能大大缩短病毒灭活时间,提升灭活效果;UVC联合添加核黄素对病毒灭活没有明显的协同作用,但提示对血小板有一定的保护作用。     

低浓度戊二醛灭活伪狂犬病毒中和剂选择与灭活效果的研究

目的研究低浓度戊二醛对伪狂犬病毒的灭活效果。方法采用细胞感染法进行低浓度戊二醛中和剂选择试验和对伪狂犬病毒灭活效果的实验研究。结果经中和剂及中和产物处理的PK-15细胞,接种伪狂犬病毒后出现细胞病变;经中和剂及中和产物处理的伪狂犬病毒对细胞的感染滴度与对照组基本一致,所用中和剂及中和产物对细胞和病毒无影响。用含量3000mg/L碱性戊二醛消毒液作用30min,对悬液内伪狂犬病毒可达到完全灭活。结论低浓度戊二醛可有效灭活伪狂犬病毒。     

核黄素光化学法灭活单采血小板中巨细胞病毒的效果评价

目的探讨核黄素光化学法灭活单采血小板中巨细胞病毒的效果及血小板一部分生化和生理学指标的改变。方法将14ml浓度为500μmol／L核黄素加到125ml的单采血小板悬液中,再将一定滴度约6log TCID50／ml的人类巨细胞病毒标准株（HCMV AD169）分别注入上述混悬液中,经265～370nm广谱紫外光（6．2J／m1）照射8～10min后,分别加至人胚肺成纤维细胞（HELF）单层中培养,与对照细胞比较观察细胞病变情况（CPE）,测定其滴度,并观察血小板一部分体外参数的变化情况。结果经浓度50μmol／L的核黄素结合强度为6．2J／ml紫外光照射8～10min,可将滴度为6logTCID50／ml模型病毒的组织培养半数感染量（TCID50）下降至FDA规定的灭活效果标准的下限值（〈0．43logTCID50／ml）。结论核黄素结合紫外光照射可以有效灭活人类巨细胞病毒,而单采血小板的各项生化、生理学指标和阴性对照比较差异均无统计学意义。     

核黄素和紫外线光化学法处理血浆制品中中东呼吸综合征冠状病毒的灭活效果观察

正中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)被认为是对血液制品安全性有潜在危害的一种病毒。核黄素和紫外线光化学法能够灭活血液相关病原体,使之失去传染性,且不会破坏血液制品的质量。本研究报道核黄素和紫外线光化学法对人类血浆中MERS-CoV病毒的灭活效果。材料与方法将MERS-CoV病毒(EMC菌株)接种在单位用量的血浆中,经核黄素和紫外线光化学法处理。处理前后的MERS-CoV病毒滴度通过猴肾细胞的噬菌斑     

核黄素光化学法灭活Sindbis病毒的研究

目的探究核黄素光化学反应对Sindbis病毒的灭活效果。方法将10 mmol/L的核黄素0.050 mL加入到4.95 mL的Sindbis病毒(XJ-160株)悬液中,经440 nm波段的可见光(40 J/cm2)双侧照射后,接种至幼仓鼠肾细胞(BHK-21)中培养,观察细胞病变情况(CPE),检测病毒滴度,用PCR检测病毒核酸的变化,并在透射电镜下观察病毒形态。结果经终浓度为100μmol/L核黄素结合440 nm可见光作用,可将滴度为6.5 log TCID50Sindbis病毒灭活至≤0.5 logTCID50;PCR法未能扩增出病毒核酸片段;透射电镜显示病毒颗粒塌陷。结论核黄素光化学法能有效灭活Sindbis病毒,其主要作用靶点为核酸。     

胶原蛋白海绵生产中的病毒灭活工艺效果观察

目的研究胶原蛋白海绵生产中病毒灭活工艺及其灭活病毒的效果。方法采用细胞培养法,对酸性酶解溶液和60Co-γ射线辐照法灭活病毒的效果进行了检测。结果酸性酶解溶液处理2 h,对接种在胶原蛋白海绵中的水疱性口炎病毒、伪狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒和猪细小病毒灭活对数值分别为5.54、5.71、6.30和5.13。用照射剂量为25 kGy的60Co-γ射线对胶原蛋白冻干品中的水疱性口炎病毒、伪狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒和猪细小病毒灭活对数值分别为6.00、5.75、6.00和5.00。灭活后的样品经细胞感染盲传3代均未见细胞病变。结论胶原蛋白海绵生产中采用酸性酶解溶液处理72 h或25kGy60Co-γ射线辐照灭菌工艺均可有效灭活所试验的4种指示病毒。     

利用动物模型评价核黄素光化学法灭活红细胞病毒的效果

本研究旨在评估核黄素光化学法(核黄素终浓度为150μmol/L,光照时间为20分钟,光照强度为40 000Lux)灭活红细胞中病毒的有效性。将HCMV作为指示病毒加入红细胞中。30只BALA/c小鼠设为实验组(n=10)、病毒对照组(n=10)、可见光对照组(n=5)和红细胞对照组(n=5);实验组小鼠注射经核黄素光化学法灭活处理的红细胞;病毒对照组小鼠注射未经灭活处理的红细胞;可见光对照组小鼠注射经可见光照射的红细胞;红细胞对照组小鼠注射正常红细胞。取各组小鼠进行体外病毒分离,PCR检测HCMV UL83基因,间接免疫荧光鉴定PP65抗原。结果表明:病毒对照组和可见光对照组病毒分离、PCR及间接免疫荧光检测均为阳性,而实验组和红细胞对照组所有结果均为阴性。结论:核黄素光化学法灭活红细胞病毒是有效的。     

核黄素光化学法杀灭血浆中细菌的实验研究

目的研究核黄素光化学法对血浆中细菌的杀灭效果。方法采用模拟试验方法,对核黄素与紫外线协同杀灭血浆中细菌的效果进行观察。结果血浆中加入300μmol/L核黄素单独作用,几乎无杀菌作用。单独紫外线照射对血浆中细菌杀灭所需时间较长。在血浆中加入300μmol/L核黄素经辐射强度1 920μW/cm2的紫外光照射10 min,对血浆中大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌杀灭率均达100%。结论核黄素与紫外线协同作用对血浆中大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌具有较好杀灭效果。     

紫外线与过氧化氢对甲型肝炎病毒协同灭活效果的实验观察

以细胞感染法检测紫外线与过氧化氢对甲型肝炎病毒联合灭活的效果。结果，照射强度为３００μＷ／ｃｍ２的紫外线与１％过氧化氢联合作用５分钟，可将该病毒灭活９９．９４％，远高于单以紫外线或过氧化氢作用者     

S/D法和低pH孵放法在富含IgM免疫球蛋白中脂包膜病毒的灭活研究

目的以水泡性口炎病毒(VSV)、辛德毕斯病毒(Sindbis)和伪狂犬病毒(PRV)为指示病毒,验证S/D和低pH孵放2种处理方法对富含IgM制剂的脂包膜病毒灭活效果。方法将指示病毒加入富含IgM制剂中,在无保护剂状态下,分别经S/D和低pH孵放处理后,测定残余病毒滴度,以病毒滴度下降数代表灭活效果。结果 S/D法使PRV和Sindbis的病毒滴度下降分别为2.94和5.25 Logs;低pH孵放使PRV和VSV的病毒滴度下降分别为6.03和4.94 Logs。结论 S/D法和低pH孵放2种处理方法对脂包膜病毒的模拟病毒VSV、Sindbis和PRV病毒,均能有效灭活。     

亚甲蓝/光化学法灭活病毒对血浆成分的影响

背景：对血液进行病毒灭活是保障安全输血的措施之一,亚甲蓝/光化学法灭活人血浆中病毒的效果已被证实,但其对血浆成分影响的报道很少。目的：观察亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆对血液成分结构和功能的影响。方法：随机选择40份采血后6h内400mL全血制备的新鲜血浆称质量留样,然后与亚甲蓝病毒灭活过滤器无菌连接,亚甲蓝的终浓度在0.9～1.3μmol/L。将加入亚甲蓝的血浆置入4℃病毒灭活箱的搁架上,摆动频率60次/min,利用32000～38000Lx光照强度的可见光4℃照射35min,将光照后的血浆通过病毒灭活过滤器滤除亚甲蓝和残余白细胞,混匀后留样10mL,立即置于-80℃冰箱冻存。检测照射前后样品的血浆量、亚甲蓝浓度、FⅧ∶C、FⅤ∶C、VWF、Fib含量的变化。结果与结论：血浆病毒灭活后血浆容量、FⅧ∶C、FⅤ∶C、VWF、Fib的回收率分别为（96.39±1.73）%、（82.55±9.25）%、（81.03±15.27）%、（93.25±6.17）%、（81.61±14.25）%。亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒对血浆中大多数成分的影响不明显,可以满足临床安全输血的需求。     

FFP经亚甲蓝光化学法灭活病毒并直接冻干于血袋的冻干血浆研制

目的探索制备冻干血浆的新工艺,研制适合在艰苦环境下储运和方便使用的新型冻干血浆。方法采用亚甲蓝光化学技术对新鲜冰冻血浆(FFP)做病毒灭活处理,再将FFP直接冻干于血袋中,观察不同条件下的保存效果。结果亚甲蓝光化学技术(终浓度为1μmol/L)能有效灭活血浆中的Sindbis病毒、PRV和VSV等指示病毒,处理30min后灭活效果>4.75LgTCID50,经细胞3代盲传证明灭活病毒效果可靠。新型冻干血浆外观成淡黄色疏松体,残水量为2.2%—2.5%,室温下<2min完全溶解;储存稳定性试验表明,新型冻干血浆中的FⅡ、FⅤ、FⅧ、FⅨ和FⅪ在25℃和4℃比较稳定,高温(40℃)保存对其活性有一定影响。结论采用亚甲蓝光化学灭活病毒技术和袋装血浆冻干技术制备新型冻干血浆是可行的。     

噻唑橙光化学法对血浆中病毒灭活作用的研究

目的探讨噻唑橙(TO)光化学法对血浆中伪狂犬病毒(PRV)和Sindbis病毒的灭活效果。方法配制TO-血浆溶液并测量其吸收光谱,制作照射光源;以PRV和Sindbis病毒为指示病毒,加入血浆以模拟病毒污染血浆;测量病毒灭活动力学曲线;做TO浓度(C)、光照强度(C)、光照时间(T)三因素三水平正交试验(n=4)以确定最优灭活条件;验证最优条件下裸照、血袋充氧前后的病毒灭活效果。结果 TO-血浆最大吸收峰位于476 nm处;病毒灭活动力学曲线显示:在TO 60μmol/L、光强1.06E-01 w.m-2.nm-1条件下,时间5 min,即可将血浆中绝大多数病毒灭活,此后进入平台期;正交试验显示:血浆中PRV及Sindbis病毒最优灭活条件均为:I=1.33E-01 w.m-2.nm-1,T=20 min,C=80μmol/L。在此条件下,灭活效果为裸照PRV≥6.13 LogTCID50(n=8),Sindbis病毒为(5.86±0.29)LogTCID50(n=8);血袋PRV(5.66±0.29)LogTCID50(n=4),Sindbis病毒(3.88±0.25)LogTCID50(n=4);充氧血袋PRV(6.32±0.55)LogTCID50(n=4),Sindbis病毒(6.00±0.35)LogTCID50(n=4)。结论 TO光化学法可有效灭活血浆中病毒,氧含量的增加可以提高病毒灭活的效果。     

核黄素光化学作用灭活大肠杆菌的研究

目的研究核黄素光化学反应对细菌的灭活作用,探讨分析核黄素光化学灭活病原体的机理。方法将含有细菌的培养液4.950ml注入5ml血袋中,再加入10mmol/L的核黄素溶液50μl使其终浓度为100μmol/L,将血袋置控温光照仪中接受400—500nm波段可见光双侧照射[剂量(8.0—32.0)J/cm2],照射时温度为(4±2)℃;照射后标本通过细菌培养,透射电镜影像、核酸检测(LacZ基因片段)等方法观察核黄素光化学作用灭活大肠杆菌的效果。结果400—500nm可见光激发的核黄素光化学作用可以有效灭活大肠杆菌达6log;透射电镜影像示经核黄素光化学处理的大肠杆菌其拟核所在区域出现多个空泡;PCR显示经核黄素光化学处理的大肠杆菌其LacZ基因片段的复制被完全阻止。结论可见光激发的核黄素光化学作用可以有效灭活大肠杆菌,核酸是核黄素光化学产生病原体灭活作用的主要靶点。     

核黄素光化学法对血浆中革兰阳性和阴性指示菌的减除作用和对血小板P选择蛋白表达的影响

本研究验证核黄素（维生素B2）光化学减除血浆中指示菌的实际效果和对机采浓缩血小板的活化影响。以大肠杆菌为革兰阴性和以金黄色葡萄球菌为革兰阳性指示病原体，观察核黄素结合紫外线照射的协同效应和灭菌效果；采用流式细胞术评估灭活处理后的机采浓缩血小板的活化状态。结果表明：50μmoL／L核黄素结合6．2J／ml剂量紫外线辐照，T／E比值分别为1．44和1．58，降低大肠杆菌和金色葡萄球菌3．87和3．82Log数。血小板经病原体灭活处理后于22℃保存0天和5天时CD62p的表达率分别为4．92％和36．18％，与对照3．94％和32．03％相比表达率略有增加（P〈0．05）。结论：核黄素与紫外线照射协同效应可以减除大肠杆菌和金黄葡萄球菌指示菌，对血小板无明显影响，液体血小板部分活化状态表现为贮存损伤，此损伤程度在可接受的范围之内。     

Differential sensitivities of viruses in red cell suspensions to methylene blue photosensitization

Background : Previous studies explored the feasibility of using the photosensitizer methylene blue (MB) as a virucidal agent in red cell suspensions. Under treatment conditions (5 μM [5 μmol/L] MB, 3.4 × 10(4) J/m²) that resulted in more than 6 log₁₀ inactivation of vesicular stomatitis virus (VSV) or of the enveloped bacteriophage φ6, red cell membrane alterations were observed. Increased red cell ion permeability and the binding of plasma proteins to the red cell surface were the most sensitive indicators, which varied in a dose-dependent fashion. Study Design and Methods : Inactivation of three additional extracellular viruses and intracellular human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) was assessed after MB phototreatment of red cell suspensions. Potassium leakage and IgG binding also were characterized in MB-treated red cell suspensions that were exposed to low-fluence light (6 × 10³ J/m²). Results : Different viruses exhibit a wide range of sensitivities to MB photoinactivation. For example, phototreatment conditions (5 μM [5 μmol/L] MB, 3.4 × 10⁴ J/m²) that inactivated more than 6 log₁₀ of VSV did not inactivate the nonenveloped picornavirus, encephalomyocarditis virus. In contrast, lower fluences (6 × 10³ J/m²) inactivated approximately 5 log₁₀ or more of Sindbis virus and approximately 4log₁₀ of extracellular HIV-1. These less stringent phototreatment conditions (5 μM [5 μmol/L] 6 × 10³ J/m²) caused lower rates of red cell potassium leakage (reduction by 6- fold) and little or no binding of plasma proteins to the red cell surface, compared to values observed previously with higher fluences. However, neither 6 × 10³ nor 4.1 × 10⁴ J per m² fluences resulted in any inactivation of intracellular HIV as represented by changes in the amount of p24 antigen produced during co-culture of actively infected H9 cells. Conclusion : MB-based protocols would require the use of high-efficiency (> 6log₁₀) white cell-reduction filters or additional inactivation steps to deplete or inactivate intracellular virus.     

SARS-CoV-2 variants inactivation of plasma units using a riboflavin and ultraviolet light-based photochemical treatment

BackgroundTest the ability of Mirasol Pathogen Reduction Technology (PRT, Terumo BCT, Lakewood Co, USA) treatment with riboflavin and ultraviolet light (R + UV) in reducing SARS-CoV-2 infectivity while maintaining blood product quality.Material and methodsSARS-CoV-2 strains were isolated and titrated to prepare cell free virus for plasma units infection. The units were then under treatment with Mirasol PRT. The infectious titers were determined before and after treatment with an in house microtitration assay on Vero E6 cells. Thirty-six plasma pool bags underwent PRT treatment.ResultsIn all the experiments, the measured titer following riboflavin and UV treatment was below the limit of detection of microtitration assay for all the different SARS-CoV-2 strains. Despite the high copies number detected by RT-PCR for each viral strain after treatment, viruses were completely inactivated and not able to infect VERO E6 cells.ConclusionRiboflavin and UV light treatment effectively reduced the virus titers of human plasma to the limit of detection in tissue culture, regardless of the strain. These data suggest that pathogen reduction in blood products highlight the safety of CP therapy procedures for critically ill COVID-19 patients, while maintaining blood product quality.