蛋白激酶C突变体的构建及其在C2C12细胞中的表达

本实验构建了4个蛋白激酶C(PKC)α突变体-GFP真核表达载体,并使它们在C2C12细胞中得到表达,为研究PKCα结构与转位的关系奠定了基础.     

人CD40L真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞膜上的表达

目的：扩增人CD40L基因并在细胞膜上表达,建立一种不需蛋白纯化获得人CD40L的简单方法,为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用及机制奠定基础。方法：利用梯度RT-PCR从Jurkat细胞中扩增CD40L基因,测序证明序列正确后构建pcDNA3.1-40L真核表达载体,转染NIH3T3细胞,流式细胞仪检测目的基因的表达。结果：从Jurkat细胞内成功扩增人CD40L基因,筛选到一个序列无误的克隆;成功构建pcDNA3.1-40L真核表达载体;经转染NIH3T3细胞和G418初步筛选,流式细胞检测证明约41％的NIH3T3细胞膜上有CD40L基因表达。结论：利用RT-PCR技术可以从Jurkat细胞内扩增CD40L基因,利用pcDNA3.1表达载体可以实现人CD40L基因在NIH3T3细胞膜上的表达。     

人干细胞因子cDNA克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

以超速离心法提取的HepG2细胞总RNA为模板，应用RT-PCR技术扩增得到编码人干细胞因子（SCF）全长CDNA（约0.8kb）。克隆、序列分析确证编码人SCF膜外活性区的CDNA（约0.5kb）结构正确，构建了含有该基因的表达质粒（PBV-mhSCF）并在大肠杆菌中获得高效表达。     

重组载体pLNCX/iNOS的构建及其在NIH3T3细胞中滴度的测定

目的 :构建重组质粒pLNCX/iNOS。方法 :用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长cDNA ,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒pLNCX/iNOS ;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA3 17中 ,经G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 :经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒构建正确。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 .1×10 4CFU·ml-1。结论 :逆转录病毒载体pLNCX可有效地介导iNOS的转染     

α2-肾上腺素受体在T淋巴细胞中的表达

目的：从分子水平揭示T淋巴细胞表达α2-肾上腺素受体（α2-AR）mRNA的现象，为神经内分泌系统调节免疫功能的机制提供更多新的证据。方法：取大鼠肠系膜淋巴结细胞，用尼龙毛柱粘附法分离和纯化T淋巴细胞，应用E花环法检测T细胞的分离纯度，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测T细胞中α2-AR mRNA的表达。结果：经过对肠系膜淋巴结细胞的分离和纯化，获得的T细胞的纯度明显高于未分离和纯化的淋巴细胞，但分离纯化后的T细胞，其活性仍然保持与分离前T细胞的活性相似；这些纯化的T细胞可表达α2-AR mRNA。结论：淋巴细胞可能像机体的其它组织细胞一样能表达和合成α2-AR。     

Eotaxin原核表达载体的构建及初步表达

目的：获得人嗜酸性粒细胞趋化因子Eotaxin基因，构建其原核表达载体，并初步表达成熟的Eotaxin，为进一步构建其N-端突变体，检测其生物学活性作准备。方法：提取外周血单个核细胞细胞总RNA，经RT-PCR扩增编码人Eotaxin全长cDNA序列，并将其克隆至T载体进行序列测定，然后构建于原核表达载体pET30a^＋中，并转入大肠杆菌表达。结果：RT-PCR扩增得到了400bp左右的DNA片段，序列分析发现其中包含了GenBank中报道的编码EotaxincDNA序列，并获得了正确表达。结论：EotaxincDNA的克隆及其原核表达载体的构建及表达，为进一步构建其N-端突变体，纯化和检测其生物学活性奠定了基础。     

大鼠GDNF真核表达载体的构建及其真在核细胞中的表达

目的：构建ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达．方法：将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应产物克隆至ｐｃＤＮＡ３真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性．结果：酶切鉴定及测序分析表明重组ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的ＧＤＮＦ蛋白．结论：以脂质体介导     

抗人凝血因子Ⅷ-C1C2区单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人凝血因子Ⅷ（FⅧ）C1C2区单克隆抗体（mAb）,并对其进行生化和生物学鉴定。方法采用基因重组技术表达FⅧ-C1C2区蛋白（rFⅧ-C1C2）,以rFⅧ-C1C2免疫8周龄Balb/C小鼠,小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,ELISA法筛选阳性克隆,制备稳定分泌抗rFⅧ-C1C2mAb的细胞株,并对mAb进行生化和免疫学鉴定。结果获得一株抗rFⅧ-C1C2区单克隆抗体阳性克隆2B11,命名为SZ-133。琼脂糖双扩散鉴定为IgG1类,Westernblot法证实SZ-133可与rFⅧ-C1C2区蛋白及重组的全长FⅧ特异性结合,但不影响FⅧ的凝血活性。结论表达了rFⅧ-C1C2,并制备出了抗人凝血因子Ⅷ的单克隆抗体SZ-133,它能特异识别血浆及重组的FⅧ,有可能用于基础和临床应用研究。     

MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达

目的构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌（E．coli）BL21中的表达，为制备以黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础。方法通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法制备MAGE-3目的基因，以pGEM—T Easy为克隆载体，DGEX-4T-1为原核表达载体，将MAGE-3目的基因克隆至pGEM—TEasy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上。筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E．coli BL21．经IPTG诱导，12％SDS—PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3；在E．coli BL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35kD的融合蛋白；基因测序结果表明，阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致。结论成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白，为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础；为后续实验提供了依据。     

分化抑制因子Id2和Id3在肿瘤细胞中的表达

目的 研究分化抑制因子（Id）基因家族在不同肿瘤细胞及健康人外周单个核细胞（PBMC）中的表达情况，为探讨尉基因与肿瘤生长的关系提供实验依据。方法：提取血液病患者和健康人PBMC、人Burkitt’s B淋巴瘤细胞（Daudi）、人T淋巴细胞性白血病细胞（Jurkat）、人慢性髓性白血病细胞（K562）、人组织细胞性淋巴瘤细胞（U937）、人前列腺癌细胞（PC-3）、人胃癌细胞（SGC）、人肺癌细胞（SPC），人卵巢癌细胞（COC2）的细胞总RNA，根据Id2和Id3cDNA全长序列合成两对引物，运用RT-PCR方法，对以上细胞中Id2和Id3mRNA的表达进行半定量分析。结果：不同的尉基因在不同人肿瘤细胞中的表达具有一定差异性：Id2在健康人PBMC和各类肿瘤细胞中均呈普遍表达趋势；Id3在健康人淋巴细胞中未见表达或表达水平极弱，而在不同肿瘤细胞中的表达有差异．Id3在PC-3中的表达最高，K562中最低。不同的尉基因在同种细胞中的表达的差异性也较大，Id2mRNA的表达水平显著高于Id3mRNA的表达水平。Id2、Id3mRNA在血液病患者PBMC中均有不同程度的的表达。结论：不同的纪基因在不同的肿瘤细胞中有不同的表达水平，Id3的异常表达在肿瘤细胞增殖及肿瘤的发生中可能发挥一定的作用。     

人骨桥蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建人骨桥蛋白(hOPN)表达载体,体外表达及表达产物的纯化.方法培养人脐静脉内皮细胞,提取总RNA,反转录合成cDNA第一链,以此cDNA为模板经PCR合成插入片段,连接至载体pGEX-6P-1,转化到XL1-blue中进行诱导表达.表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,切下目的蛋白进行洗脱纯化.结果构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA测序,证明所构建的质粒是pGEX-6P-OPN.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现该重组质粒经IPTG诱导后表达一种新的蛋白(表达量为16.7%),这种蛋白不存在于诱导后的pGEX-6P-1表达产物中,纯化后蛋白纯度为99%.结论成功构建了hOPN表达载体,并进行体外表达.     

蛋白激酶C在大鼠重症急性胰腺炎中的表达

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)家族成员PKCα和PKCδ在重症急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺及肺脏中的动态表达情况和组织病理改变的关系.方法: 胰胆管逆行注射牛黄胆酸钠制成大鼠SAP模型,观察胰腺及肺脏病理学变化,采用免疫组织化学方法分别检测PKCα,PKCδ在SAP大鼠胰腺和肺脏中的表达情况,并进行对比分析.采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测96只大鼠胰腺组织中PKC mRNA的表达情况.结果: 建模后1,6,12和24 h假手术(SO)组胰腺中PKCα表达分别为0.70±0.04,0.71±0.05,0.75±0.04和0.71±0.07;SAP组分别为0.83±0.05,0.95±0.09,1.10±0.10和1.08±0.16,两组各时间点之间差异均有统计学意义(P<0.01).轻型急性胰腺炎(MAP)组大鼠建模后胰腺中PKCα表达分别为0.73±0.04,0.73±0.03,0.85±0.08和0.84±0.06,与SO组各时间点相比,在12 h和24 h差异具有统计学意义(P<0.05),与PKCα相类似,PKCδ的表达在1 h开始增高,12 h达到高峰,且维持时间较长.MAP组PKCδ在12 h达到高峰,但维持时间较短,24 h时有所减低.结论: PKCα在SAP的病程发展中起重要作用.监测PKCα水平可为SAP的早期诊断提供帮助.     

基质金属蛋白酶2在肾细胞癌中的表达及意义

目的探讨基质金属蛋白酶2（MMP2）在肾细胞癌（RCC）中的表达及意义。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及表达丰度定量法检测肾细胞癌组织和正常对照组中MMP2基因mRNA的表达。结果RCC组MMP2基因mRNA表达水平均明显高于正常对照组（P〈0．01）。 结论RCC组织中MMP2基因mRNA的表达较正常肾组织高，与肿瘤分期、分级相关，可作为判断肾癌预后的指标。     

聚合酶链反应在MLCK表达载体构建中的应用

用聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）方法扩增 出含有Ｓａｌ Ⅰ位点和转录起始点ＡＴＧ的肌球蛋白轻链激酶（ｍｙｏｓｉｎ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＭＬＣＫ）ｃＤＮＡ片段，并入质粒ｐＢＫｒｓｖ中，构建成能在宿主细胞中表达的表达本，并通过酶切图谱、ＳａｌⅠ位点ＤＮＡ序列是到证实。为进一步研究ＭＬＣＫ的表达奠定基础。     

COX-2基因在人脑星形细胞肿瘤组织中表达及其与Fas基因表达的相关性

目的：探讨COX-2 mRNA在星形细胞肿瘤组织中的表达及与Fas mRNA表达的相关性。方法： 应用RT-PCR技术检测不同级别星形细胞肿瘤组织及非肿瘤组织中COX-2 mRNA和Fas mRNA的表达水平。结果：COX-2 mRNA表达阳性率分别为：非肿瘤组织33.3%,肿瘤组织78.4%;Fas mRNA阳性表达率分别为：非肿瘤组织8.3%,肿瘤组织74.5%;二者在肿瘤组织中的表达显著高于其在非肿瘤组织中的表达（P<0.05）,且有良好的相关性（r=0.525,P=0.008）。结论：COX-2 mRNA表达与星形细胞肿瘤的发生、发展有关,是评估星形细胞肿瘤恶性生物学行为的可靠指标;COX-2 mRNA表达与Fas mRNA密切相关,两者可能存在共同的激活机制,构成抑制肿瘤细胞凋亡的多种途径。     

逆转录病毒载体介导人凝血因子Ⅷ在哺乳细胞中的高效表达

目的　建立逆转录病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ (FⅧ )体外高效表达体系。方法　将一B区缺失 (76 0aa～ 16 39aa)的人FⅧcDNA(FⅧcDNABD)克隆至逆转录病毒载体pLNCX ,构建了重组表达载体LNC ⅧBD。经PA317细胞包装后 ,感染多种靶细胞。分别采用一期法、ELISA法和RT PCR检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性 (FⅧ∶C)和抗原含量 (FⅧ∶Ag)以及细胞中FⅧcDNABD的转录。结果　重组逆转录病毒载体LNC ⅧBD在四种靶细胞中有不同程度的表达。其中以NIH3T3细胞的表达最高 ,FⅧ∶C为 1.6U/ 10 6细胞·2 4hrs 1,FⅧ∶Ag为 5 0 0ng/ 10 6细胞·2 4hrs 1。CHO细胞表达的FⅧ∶C活性为 0 12U/ 10 6细胞·2 4hrs 1,FⅧ∶Ag为 6 2 4ng/10 6细胞·2 4hrs 1。FⅧ在Cos 7和一正常成人肝细胞系L 0 2中表达较低。RT PCR可检测到靶细胞中人FⅧcDNABD的转录的mRNA。结论　逆转录病毒载体能够介导人FⅧ的体外高效表达 ,为血友病A的基因治疗奠定了基础     

Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3在人脑胶质瘤中的表达

目的 研究Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)在人脑胶质瘤组织中的表达,探讨NLRP3在人脑胶质瘤的发生、发展中的作用.方法 按照2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类及分级标准,将所收集的49例人脑胶质瘤组织根据其病理类型分为低级别组(20例)和高级别组(29例),并收集脑外伤后行颅内减压手术切除的正常脑组织10例做对照.应用免疫组织化学技术,并采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)和免疫印迹技术,检测NLRP3在各组人脑胶质瘤及人正常脑组织中的表达.结果 NLRP3在正常脑组织中表达不明显,在低级别胶质瘤中表达较少,在高级别胶质瘤中表达明显.NLRP3 mRNA在正常脑组织(1.04±0.52)、低级别组(1.85±1.02)和高级别组(3.36±1.38)比较,差异有统计学意义(P＜0.01).人脑胶质瘤组织中NLRP3在mRNA水平及蛋白水平均高于正常脑组织(P＜0.01).NLRP3的表达与人脑胶质瘤的恶性程度呈正相关.结论 人脑胶质瘤中存在NLRP3的异常表达,其表达量随胶质瘤恶性程度的升高而增加,NLRP3在人胶质瘤的发生和侵袭中可能发挥着重要的作用,检测NLRP3的表达有助于胶质瘤分化程度的判断.     

人akt1基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建带有flag标签的人akt1及豆蔻酰化akt1真核表达载体,并检测其在真核细胞中的表达及对细胞周期的影响.方法:应用RT-PCR的方法从人牙髓组织mRNA中扩增出akt1和myr-akt1基因,并在其C-末端带上含24bp的flag标签,克隆到pMD-18T载体并测序,再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测flag-akt1及flag-myr-akt1在细胞中的表达,同时流式细胞术观察细胞周期.结果:测序证实从人牙髓组织mRNA中扩增出的flag-akt1及flag-myr-akt1融合基因的序列以及读框全部正确;脂质体法转染COS-7后检测到预期目的蛋白的表达.流式细胞术的结果显示当AKT1过度表达以及过度活化时对COS-7细胞周期未产生明显影响.结论:成功构建了C-末端带flag标签的akt1及豆蔻酰化akt1真核表达载体,并使其在真核细胞COS-7中表达.但是AKT1对细胞周期的调控有待进一步研究.     

人lrp-cDNA全长编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:扩增人lrp-cDNA全长编码区、并在大肠杆菌中表达和鉴定.方法:提取脂多糖刺激后HEK293细胞的总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出全长人lrp序列,将其克隆入原核表达载体pcTAT后转化大肠杆菌诱导表达,做SDS-PAGE分析;并用免疫印迹法鉴定6His-TAT-LRG融合蛋白表达.结果:测序结果表明,获得了全长人lrp-cDNA全长编码区,其序列与GenBank已经公布的不完全一致;SDS-PAGE分析表明,6His-TAT-Lrp融合蛋白在大肠杆菌中成功表达,表达量约占菌体总蛋白的17%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生阳性反应.结论:得到人lrp-cDNA全长编码区序列,并成功表达,为人lrp功能的深入研究奠定了基础.