恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的　表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi)Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白 ,探索其作为诊断抗原的可能性。方法　采用PCR方法 ,从Ot Gilliam株菌种基因组DNA中扩增出 5 6kDa外膜蛋白基因片段 ,将目的基因片段定向插入原核表达载体pQE30 ,再用重组质粒转化大肠杆菌 ,最后用IPTG诱导转化菌 ,SDS -PAGE和Western -blotting检测重组质粒目的基因的表达。结果　 (1)获得长约 15 0 0bp的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因 ,SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量5 6× 10 4处有表达带 ;(2 )DNA测序证明重组质粒 pQE30 / 5 6中插入的基因片段的序列与已报告的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因序列基本一致。 (3)诱导表达菌体经超声破碎后 ,显示目的蛋白主要以包涵体形式存在 ;(4 )免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子量约为 5 6× 10 4的独特蛋白带 ,该蛋白约占细菌蛋白总量的 2 9 4 %。结论　Ot Gilliam株5 6kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性 ,与Ot Gilliam株感染的小鼠血清在免疫印迹中呈阳性反应。     

恙虫病东方体sta56部分基因的克隆和表达

目的 构建恙虫病东方体sta56基因的重组表达质粒,并在E.coli中表达Sta56重组抗原。方法 从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段,用TA克隆技术将此大片段克隆,并以重组质粒为模板,扩增编码Sta56抗原亲水氨基酸区的一段长342bp的DNA,插入pProEX HTb载体,转化大肠杆菌DH5a,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western blot进行分析。结果 从恙虫病东方体基因组中扩增出sta56基因的ORF,以截短片段构建了重组表达质粒pHTbOt342,SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为15.4kDa,Western blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别。结论 在大肠杆菌中表达的Sta56重组蛋白具有免疫反应性。     

恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因的原核表达及初步鉴定

目的　对恙虫病东方体Gilliam株 5 6kDa蛋白部分基因进行原核表达 ,以获得高效表达、有生物活性目的蛋白 ,为恙虫病诊断试剂的研制打下基础。方法　根据Gilliam株东方体 5 6kDa蛋白基因序列设计特定引物 ,用PCR法扩增出编码5 6kDa抗原富含亲水区及同源性高的C端一段长约 70 0bp的DNA ,插入原核载体PGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌TGI ,抽提质粒 ,酶切鉴定 ,含插入片段的重组质粒进行序列分析 ,再转化表达宿主菌大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,用SDS -PAGE及Western -blot进行分析鉴定。结果　SDS -PAGE检测表明该截短片段以融合蛋白的方式得到成功表达 ,在相对分子量 5 8kDa处有表达条带 ,经薄层扫描分析 ,目的蛋白条带占全菌蛋白的 30 5 %。Western -blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清识别。结论　表达产物初步鉴定具有生物活性 ,有望应用于恙虫病诊断试剂的研制     

恙虫病东方体Karp株56kDa与47kDa外膜蛋白基因的嵌合和嵌合基因在大肠杆菌的表达

目的　将恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株的 5 6kDa和 4 7kDa外膜蛋白基因嵌合 ,并使嵌合基因在大肠杆菌细胞内表达 ,产生双抗原融合蛋白。方法　采用PCR方法 ,从OtKarp株基因组DNA中扩增 5 6kDa蛋白基因片段 ,将该片段分别与原核表达载体pQE30及 4 7kD蛋白基因重组质粒 pQE30 / 4 7连接 ,构建 pQE30 / 5 6及pQE30 / 5 6 - 4 7重组质粒 ;用IPTG诱导转入大肠杆菌内的重组质粒的目的基因表达。结果　SDS -PAGE显示 ,pQE30 / 5 6转化的大肠杆菌产生一约 4 5kDa的融合蛋白和 pQE30 / 5 6 - 4 7转化大肠杆菌产生一约 90kDa融合蛋白 (5 6 - 4 7融合蛋白 ) ,免疫印迹分析显示两融合蛋白均与OtKarp株感染鼠血清产生特异性反应 ,5 6 - 4 7融合蛋白分别与 4 7kDa、5 6kDa重组蛋白免疫的小鼠血清产生特异性反应 ,以及 5 6 - 4 7融合蛋白免疫血清与 5 6kDa和 4 7kDa重组蛋白反应。结论　OtKarp株的 5 6kDa与 4 7kDa外膜蛋白基因嵌合后在大肠杆菌细胞内实现了表达 ,表达的融合蛋白具有 5 6kDa和 4 7kDa外膜蛋白的抗原特性。     

恙虫病东方体疫苗研究进展

虫病东方体旧称恙虫病立克次体,是恙虫病的病原体,对人致病性很强,临床上以突然高热、淋巴结肿大、虫咬溃疡和皮疹为主要特征.恙虫病是一种古老的自然疫源性疾病,早在公元313年,我国古代科学家葛洪就曾描述过微小的沙虱传播恙虫病的过程.随着20世纪20年代恙虫病东方体的成功分离以及二战期间参战军队大量发生恙虫病流行,对该病的研究和防治进入了一个快速发展的新时期.几十年来,对该病的免疫预防特别是疫苗研制进行了大量的研究,但是由于对恙虫病东方体的抗原性、免疫原性、株型及血清型的研究仍不够深入,其疫苗研究一直未能获得满意结果,主要原因有:第一,恙虫病东方体具有相对较低的免疫原性,在用非复制性疫苗预防接种时,需要接种的抗原量大.第二,恙虫病东方体在组织培养中生长慢且培养条件要求严格,难以制备大量的高纯度病原体.第三,恙虫病东方体株抗原类型多,异源保护性差,从而使得发展单价高效无毒疫苗的可能性很小.现将几十年来这方面的相关研究综述如下:     

恙虫病立克次体sta56基因片段的克隆

应用半套式PCR技术从Karp株恙虫病立克次体基因组中扩增出872hpDNA片段。该片段经Pstl消化后，与经PStl酶解的pUC18连接，转化大肠杆菌，电泳初筛得pUCRL3等重组质粒。pUCRL3经PCR及酶切证实含约294hp恙虫病立克次体sta56基因片段，可作为检测恙虫病立克次休的特异核酸探针。     

南澎列岛恙虫病东方体分离株的基因分型

目的 用分子生物学技术鉴定南澎裂岛恙虫病东方体及其分型。方法 以巢式聚合酶链反应（NPCR）检测南澎列岛恙虫病东方体8个分离株的56kD蛋白基因片段,阳性产物进行限制性片段长度多态性分析（RFLP）。选择其中4株的PCR产物克隆进pGEM－T载体并且测序,测序结果在国际互联网作多序列比较和进化树分析。结果 7株分离株扩增出500bp目的片段,RFLP分析表明南澎列岛存在三种不同的恙虫病东方体。从4个样品获得7个克隆,序列分析证实2个克隆（DY1,DY21）与Yonchon同源性99％,3个克隆（DY22,NY12,NS2）与Karp株同源性92％,2个克隆（NY11,NS1）与Kato株同源性98％。南澎列岛存在Karp,Kato,Yonchon三种类型的恙虫病东方体。     

恙虫病立克次体Karp株Sta56部分基因片段的扩增、克隆及鉴定

目的为了进一步完善恙虫病立克次体的株型鉴定技术,并且为临床提供诊断试剂。方法本文采用ＮＰＣＲ技术,参考并自行设计两对寡核苷酸引物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４）,从恙虫病立克次体Ｋａｒｐ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出编码Ｓｔａ５６抗原的部分基因片段,经纯化后用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切后,克隆到质粒ＰＵＣ１８中,转化大肠杆菌ＴＧ１,经ＰＣＲ和双酶切鉴定。结果与结论构建了重组质粒ＰＵＣ１８－ＲＫ,从而为该基因片段的表达奠定了基础。     

恙虫病立克次体Sta58主要抗原基因片段的克隆

作者利用其采用ＰＣＲ技术从恙虫病立克次体基因组中扩增出Ｓｔａ５８主要抗原基因的部分片段，约１ｋｂ，克隆入质粒ｐＳＰ７２的ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ位点，建重组质粒ｐＳＰＲＫ９，又将ｐＳＰＲＫ９中的ＡｃｃＩ小片段约５００ｂｐ亚克隆至ｐＳＰ７２构建重组质粒ｐＳＰＲＫ７。以上无性繁殖系的建可为我国开展恙虫病立克次体核酸杂交研究提供特异核酸探针。     

恙虫病立克次体Gilliam株56—kDa蛋白基因的克隆及其5‘—和3’—？…

克隆恙虫病立克次体Ｇｉｌｌｉａｍ株５６－ｋＤａ蛋白基因,作为优化ＰＣＲ反应时的标准模板和为Ｇｉｌｌｉａｍ株５６－ｋＤａ蛋白基因的表达作准备。方法利用ＰＣＲ反应和Ｔ载体分别扩增和克隆目的基因片段,并用序列分析方法鉴定克隆基因的正确性。     

恙虫病东方体黑龙江分离株的PCR分型

目的　鉴定恙虫病东方体黑龙江分离株的基因型。方法　采用PCR技术对分离自黑龙江省密山地区的 6株恙虫病东方体sta5 6kD目的基因进行分析研究 ,并与国际参考株进行比较。结果　MSAa930 1株、MSAa930 3株、MSAa930 4株及MSAp930 5株属于Gilliam型 ;MSAa930 6株属于Karp型 ;MSAp930 2株属于Kato型。 结论　黑龙江密山地区恙虫病东方体存在Gilliam、Karp和Kato 3种型别。     

应用PCR/RFLP对山东地区恙虫病东方体的基因型分析

目的　鉴定山东地区恙虫病东方体的基因型。方法　采用聚合酶链反应 /限制性片段长度多态性分析 (PCR/RFLP)技术对恙虫病东方体山东分离株、小盾纤恙螨匀浆及恙虫病病人全血中提取的DNASta5 6基因进行分析研究 ,并与NestedPCR基因分型的结果进行比较。结果　山东地区 35份标本 ( 2 3株恙虫病东方体山东分离株、2份采自黑线姬鼠体外的小盾纤恙螨匀浆及 10份恙虫病人全血 )提取的DNA群引物扩增产物经HinfⅠ、HhaⅠ、SnaBⅠ酶切后呈现 2种不同的RFLP图谱 ,经与已知序列的Ot内切酶图谱相比 :33份Ot内切酶图谱与文献报告的日本地方株—Kawasaki株具有相似的酶切图谱 ,但缺乏HhaⅠ的酶切位点 ;另 2份与Karp参考株具有相同的酶切图谱。该结果与NestedPCR基因分型的结果相一致。结论　山东地区恙虫病东方体流行株主要基因型与日本地方株Kawasaki型类似 ,但与日本地方株存在遗传差异 ;同时还有Karp型Ot存在。采用PCR/RFLP方法可以准确对Ot-Sta5 6基因分型。     

恙虫病东方体Karp株56kD表膜蛋白基因的表达及免疫诊断应用研究

目的实现恙虫病东方体56kD表膜蛋白的原核表达并评价重组蛋白作为抗原的免疫诊断价值。方法亚克隆技术构建原核表达质粒载体pGEX-Sta56,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-Sta56融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白,应用ELISA以评价其免疫诊断价值。结果pGEX-Sta56经测序鉴定Sta56基因以正确的表达框架连入载体,经过诱导表达得到正确大小的融合蛋白,应用纯化的GST-Sta56的ELISA检测结果与全细胞抗原有很高线性相关性,在小鼠血清检测中敏感性,特异性和准确性分别大于90%,70%和80%。结论成功表达重组的56kD表膜蛋白并可能替代传统的全细胞纯化蛋白,为建立快速、敏感和特异的免疫学诊断奠定了基础。     

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。     

PCR及相关技术在恙虫东方体检测和研究中的应用

随着PCR技术在医学领域的广泛应用和深入研究,PCR及其相关技术在检测恙虫东方体领域亦取得了一系列进展,对恙虫病的早期诊断和恙虫东方体的基础研究产生了深远影响。本文对PCR及其相关技术在恙虫东方体检测和研究中的应用状况进行综述。     

环泰山区域恙虫病东方体感染状况调查及基因序列分析

目的了解环泰山区域恙虫病东方体(Ot)感染情况,确定是否存在恙虫病疫源地。方法应用PCR技术和血清学等方法调查泰山西南麓、东南麓部分村庄及泰山景区人、鼠Ot感染情况,病人发病情况采用个案表调查。结果血清抗-Ot8例现症病人全部阳性,14例既往病人4例阳性,均为Gilliam型;115名健康人抗-Ot阳性率为8.70%,发病区域和无发病区域分别为26.92%和3.37%,差异有统计学意义(P0.05)。PCR检测Ot基因,4份病人焦痂3份阳性,100份鼠脾,4份阳性,其中黑线姬鼠3份,小家鼠1份。序列同源性分析和系统发生树分析显示,2份阳性鼠标本的PCR产物核苷酸序列完全相同,与Sdu-1型的核苷酸序列同源性为99.77%,与Kawasaki型的同源性为95.74%。另2份阳性鼠标本的核苷酸序列与TA686型的同源性分别为86.27%和77.11%。病人发热、皮肤焦痂或溃疡发生率较高,达98.08%和92.31%。结论环泰山区域人、鼠间均存在Ot自然感染,恙虫病自然疫源地已经形成,病人集中出现在每年的9～11月,10月份为主要发病月,属典型的秋冬型疫源地;宿主动物呈非单一性,黑线姬鼠为Ot的主要储存宿主;人群中存在Ot隐性感染;Ot血清型为Gilliam型,基因型Kawasaki相似型为流行株,鼠间还存在TA686型相似株,呈基因多样性倾向。     

恙虫病东方体在无生命培养基内生长的研究

目的　恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi;Ot)被认为属专性细胞内寄生。特别是制备大量抗原培养难的问题 ,是近一个世纪以来人们渴望解决的难题。为证实是否能在无生命培养基生长。方法　用Vero -E6个单层组织细胞培养OtJL - 90株与标准Gilliam株 ,在合适时取该培养物接种于Ⅲ号无生命固体培养基培养 ,置 36℃ (± 1℃ )培养 18- 2 4h。结果　可见生长一群无色透明或半透明光滑、湿润、圆形或枫叶样小菌落 ,并产生一种难闻的臭味。两种方法培养物分别做了生物学性状鉴定、形态染色、小白鼠致病力、血清学特异性间接免疫荧光检测。各株Ot经两种培养获得培养物特性基本一致。结论　Ot能在细胞内生长也能在无生命培养基内生长 ,解决了Ot大量抗原培养难的困扰。