纳米级超声造影剂的研究现状与展望

随着纳米生物学技术和超声造影剂的迅速发展,造影剂粒径步入纳米时代。不同核心成分和包膜材料的纳米级超声造影剂分别表现出不同的特性。在实际应用中,纳米级超声造影剂在肿瘤显像和治疗方面有其独特的优势。本文就纳米超声造影剂的研究背景、现状及应用发展前景等方面做一综述。     

纳米级超声造影剂的技术进展

纳米级超声造影剂是指直径〈1000nm的超声造影剂。与微米级微泡相比,纳米造影剂粒径较小,渗透能力极强,可以通过血管内皮间隙,进行病变部位血管外显影。同时因为纳米系统具有一定的靶向能力,将纳米级造影系统与临床治疗相结合可以在肿瘤治疗方面表现出其特定的靶向治疗优势。现就纳米级超声造影剂的特征、国内外制备方法及研究前景进行总结。     

纳米级微泡:一种新的超声造影剂

随着分子生物学技术的发展和延伸,超声分子成像获得了飞速的发展,但由于常规造影剂微泡不能透过血管壁,超声分子成像的研究仅限于血管内的靶分子.最近纳米级微泡超声造影剂的出现为针对肿瘤细胞的超声分子成像带来了希望.本文对纳米级微泡超声造影剂的研究背景、研究现状及下一步的研究与应用进行了综述.     

自制纳米级超声微泡体外基本特性和肿瘤造影增强显影的实验研究

目的 探讨自制纳米级超声微泡的体内基本特性及体内造影增强显影效果.方法 机械振荡与低速离心法结合制备纳米级微泡,并对微泡粒径大小、分布、微观形态和稳定性进行研究.同时在裸鼠肝、肾及前列腺癌皮下移植瘤进行超声造影实验,与常规微米级造影剂对比造影效果.结果 所制备的微泡形态圆整,大小均一性较好,分布均匀无聚集,平均粒径(580.6±36.3)nm.该纳米级微泡能显著增强裸鼠肝肾及皮下移植瘤显影,与常规造影剂比较,不但增强强度相当,且显影时间显著延长.结论 自制纳米级超声微泡造影剂各项物理特性符合纳米级超声造影剂的要求,体内增强效果和稳定性较强,为下一步纳米级微泡在肿瘤显像和治疗中的应用提供实验依据.     

纳米级靶向超声造影剂的制备及对兔VX2肝肿瘤的显影试验

目的 制备一种具有靶向性的纳米级超声造影剂,测定其物理特性,并对兔VX2肝肿瘤的靶向性进行评估.方法 采用高速均质法制备纳米级靶向超声造影剂,测定粒径、Zeta电位、稳定性,观察体外显影、对体内肿瘤的显影,对肿瘤组织进行病理切片及荧光共聚焦观察.结果 纳米级靶向超声造影剂的粒径为(474.1±83.5)nm,Zeta电位为+(9.8±5.7)mV,溶液的性质稳定,其沉淀能够增强超声显影,体内能够增强肿瘤的显影,光镜下和荧光共聚焦显微镜下均能够观察到靶向造影剂聚集在肿瘤组织内.结论 自制的纳米级微球符合理想的靶向超声造影剂的要求,性质稳定,能够靶向肿瘤组织显影,有望成为一种新型的靶向超声造影剂及载基因或药物的靶向载体.     

纳米级液态氟碳靶向超声造影剂的制备及 体外寻靶的实验研究

目的制备一种新型的具备特异性肝细胞靶向性能的超声造影剂,即携半乳糖化多聚赖氨酸(Gal-PLL)的脂质包裹的纳米级液态氟碳微球超声造影剂,并研究其在体外肝细胞的寻靶能力。方法应用还原胺化法优化制备肝脏去唾液酸糖蛋白受体的配体Gal-PLL,将其磷脂膜洗脱下来并逐滴加入液态氟碳,通过超声波细胞粉碎机进行振荡获得目标造影剂,并观察其形态,检测其粒径和电位。将靶向造影剂和非靶向造影剂分别滴入贴壁生长的正常大鼠肝细胞及正常人肝细胞中,比较观察两组造影剂与肝细胞的靶向效果。结果成功制备Gal-PLL,并合成了靶向纳米液态氟碳脂质微球超声造影剂,电镜下其形态圆整、大小均一,性质稳定,平均粒径200 nm,平均电位35 m V。制备的靶向纳米液态氟碳脂质微球超声造影剂能靶向聚集于体外正常大鼠肝细胞和正常人肝细胞周围。结论自制携Gal-PLL的脂质包裹的纳米级液态氟碳微球超声造影剂具有性质稳定、靶向性等优点,为今后实时在体监测并定量评估肝脏损伤程度的超声显影研究提供了前期基础。     

纳米级超声微泡造影剂的制备及其性状的初步研究

目的制备适用于超声诊断的纳米级超声微泡造影剂,并对其性状进行初步研究。方法通过低速离心分级分离法制备纳米级的脂膜超声微泡,检测微泡大小形态、表面电位、粒径、分布,测试其与抗体结合情况,体外初步测试其增强显像效果。结果微泡呈圆形,分布均匀,粒径均值为623.4nm;微泡表面电位均值1.3mV,与抗体结合情况良好,体外初步测试能明显增强显像效果。结论通过低速离心分级分离法可以制备纯度较高的纳米级超声微泡,为超声造影剂的小型化和靶向性发展提供重要的工作平台。     

载自杀基因的靶向超声分子探针的制备及超声显像的实验研究

目的:制备一种包裹液态氟碳，载肝癌治疗基因质粒，并具有叶酸分子靶向性的纳米级超声分子探针, 研究其基本特性及超声显像能力? 方法:通过聚乙二醇亚胺在PLGA表面连接叶酸（Fa）分子，制成靶向膜材料(PLGA-Fa)后,采用双乳化法制备载有PFP的纳米级靶向超声造影剂，将其与多聚赖氨酸孵育后，形成表面带正电荷的阳离子，利用正负电荷吸附作用，使纳米粒表面载上质粒C（PLGA-Fa-PFP-C）。 分别用加热及LIFU辐照的方式处理纳米粒，于显微镜下观察其相变情况，于超声造影模式下观察其体外显影效果。另同样用双乳法制备无叶酸的非靶向造影剂，将两者分别与肝癌细胞HepG2孵育，观察其寻靶能力。 结果: 成功制备了载有质粒、PFP的纳米级靶向超声造影剂(Fa-PLGA/PFP/C)，该纳米微粒大小均匀,形态圆整,分散性好，直径分布为200.5nm，平均电位为+37MV,当加热至50度时及用LIFU5档辐照后5分钟后，显微镜下可见较多的纳米粒相变，超声造影模式下亦可见显像;并在细胞实验中观察到该靶向造影剂有明显的靶向作用。 结论:本研究成功制备了一种载质粒及PFP的纳米级靶向超声造影剂(Fa-PLGA/PFP/C)，该纳米粒可用于超声造影显像，并具有肿瘤靶向性。     

纳米级超声造影剂制备及成像的实验研究

目的 探讨纯度较高的纳米级超声微泡造影剂的理化性质及体内成像效果.方法 机械振荡法与低速离心法结合制备纳米级微泡,观察微泡形态,检测其平均粒径,并观察其增强正常兔肝显影的情况,并与微米级微泡造影剂进行比较.结果 光镜以及透射电镜观察,微泡呈圆形,分布均匀,无聚集现象.Zeta SIZIER 3000测定微泡粒径均值为623.4 nm,微泡表面电位均值1.3 mV.注射纳米级造影剂于新西兰大白兔体内能持续增强肝的显像效果,与微米级造影剂对比无明显差异.结论 纳米级的微泡造影剂大小合理,分布均匀,显像效果强,为下一步研制小型化靶向造影剂奠定了基础.     

超声微泡造影剂的肿瘤靶向治疗研究进展

近几年,国内外着眼于靶向微泡造影剂的研究,利用超声波与微泡造影剂的相互作用及所产生的生物学效应,可实现微泡所携带的基因/药物等向目标组织的转移释放,介导肿瘤细胞的凋亡及肿瘤微血管的栓塞阻断等,从而起到靶向治疗的作用。随着各种兼具诊断治疗双重作用的超声探头和靶向微泡造影剂包括纳米级微泡造影剂的研制,以及对超声生物学效应的深入研究,超声微泡介导肿瘤靶向治疗将为临床肿瘤的治疗带来新的希望。     

纳米靶向超声造影剂的研究进展

靶向超声造影是超声分子影像技术的重要部分。随着超声造影技术和生物纳米技术的发展,靶向超声造影剂步入纳米时代。近年来,纳米靶向超声造影剂的制备和在肿瘤诊治中的应用前景备受关注。本文就此进行综述。     

光热型纳米金-共聚物超声造影剂的制备和体内外显像

目的 制备外包纳米金壳内载全氟丙烷(C₃F₈)的聚乳酸羟基乙酸(PLGA)光热型超声造影剂,观察其在体内外的超声显像效果及体外的光热效能。方法 通过改进的乳化溶剂挥发法制备PLGA纳米粒子,包载C₃F₈气体后,再用种子生长法在PLGA表面形成纳米金壳,制备C₃F₈@PLGA@Au纳米粒子;检测其一般特性,并用近红外激光和超声成像仪评估其体外光热效能及体内外成像效果。结果 成功制备C₃F₈@PLGA@Au纳米粒子,该粒子的平均直径为268.2±80.5 nm,分散性好,无明显细胞毒性;在808 nm激光辐照下,粒子有很好的溶液光热效果;体内外超声成像实验中均有增强显像。结论 成功制备了光热型纳米超声造影剂,其有良好的体外光热性能和体内外超声显像效果,为乳腺癌疾病诊治提供了新思路。     

Slow-Flow Ultrasound Localization Microscopy Using Recondensation of Perfluoropentane Nanodroplets

Ultrasound localization microscopy (ULM) is an emerging, super-resolution imaging technique for detailed mapping of the microvascular structure and flow velocity via subwavelength localization and tracking of microbubbles. Because microbubbles rely on blood flow for movement throughout the vascular space, acquisition times can be long in the smallest, low-flow microvessels. In addition, detection of microbubbles in low-flow regions can be difficult because of minimal separation of microbubble signal from tissue. Nanoscale, phase-change contrast agents (PCCAs) have emerged as a switchable, intermittent or persisting contrast agent for ULM via acoustic droplet vaporization (ADV). Here, the focus is on characterizing the spatiotemporal contrast properties of less volatile perfluoropentane (PFP) PCCAs. The results indicate that at physiological temperature, nanoscale PFP PCCAs with diameters less than 100 nm disappear within microseconds after ADV with high-frequency ultrasound (16 MHz, 5- to 6-MPa peak negative pressure) and that nanoscale PFP PCCAs have an inherent deactivation mechanism via immediate recondensation after ADV. This “blinking” on-and-off contrast signal allowed separation of flow in an in vitro flow phantom, regardless of flow conditions, although with a need for some replenishment at very low flow conditions to maintain count rate. This blinking behavior allows for rapid spatial mapping in areas of low or no flow with ULM, but limits velocity tracking because there is no stable bubble formation with nanoscale PFP PCCAs.     

Toward Ultrasound Molecular Imaging With Phase-Change Contrast Agents: An In Vitro Proof of Principle

Phase-change contrast agents (PCCAs), which normally consist of nanoscale or microscale droplets of liquid perfluorocarbons in an encapsulating shell, can be triggered to undergo a phase transition to the highly echogenic gaseous state upon the input of sufficient acoustic energy. As a result of the subsequent volumetric expansion, a number of unique applications have emerged that are not possible with traditional ultrasound microbubble contrast agents. Although many studies have explored the therapeutic aspects of the PCCA platform, few have examined the potential of PCCAs for molecular imaging purposes. In this study, we demonstrate a PCCA-based platform for molecular imaging using α_vβ₃-targeted nanoscale PCCAs composed of low-boiling-point perfluorocarbons. In vitro, nanoscale PCCAs adhered to target cells, could be activated and imaged with a clinical ultrasound system and produced a six-fold increase in image contrast compared with non-targeted control PCCAs and a greater than fifty-fold increase over baseline. Data suggest that low-boiling-point nanoscale PCCAs could enable future ultrasound-based molecular imaging techniques in both the vascular and extravascular spaces.     

聚乳酸-羟基乙酸超声造影剂增强兔淋巴结显像的初步实验研究

目的 研究自制聚乳酸-羟基乙酸（poly lacticoglycolic acid，PLGA）超声造影剂增强兔肿瘤淋巴结显像的效果及其相关机制。方法采用乳液-溶剂蒸发法制备PLGA超声造影剂；经免大腿皮下注射VX2肿瘤细胞制备肿瘤淋巴结模型，肿瘤细胞生长14～18d后用于超声显像。通过问歇谐波显像观察PLGA造影剂对胭窝肿瘤淋巴结的增强作用，并通过巨噬细胞试验初步探讨增强淋巴结超声显像的相关机制。结果PLGA超声造影剂粒径分布均匀；可以明显增强肿瘤淋巴结显像；细胞试验表明巨噬细胞可以大量吞噬PLGA超声造影剂。结论PLGA超声造影剂是一种良好的肿瘤淋巴结显影剂。淋巴结内巨噬细胞吞噬造影剂后导致造影剂在淋巴结内滞留与聚集可能是其能够明显增强淋巴结显影的机制之一。     

去唾液酸糖蛋白受体介导的肝靶向纳米脂质超声造影剂的制备及体外实验

目的 以肝细胞膜特异性受体去唾液酸糖蛋白受体为靶向受体,利用共价结合的原理,制备出肝靶向性液态氟碳纳米超声造影剂,观察该造影剂的一般特性、与人肝细胞L02的靶向结合及体外聚集显像效果.方法 利用还原胺法制备去唾液酸糖蛋白特异性配体半乳糖化多聚赖氨酸(Gal-PLL);利用旋转蒸发及声振法制备液态氟碳纳米脂质超声造影剂;培养人肝细胞L02,于不同时间点观察与L02细胞的靶向结合;Philips iU 22超声诊断仪L12-5探头对比观察靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂的体外显像效果.结果 靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂粒径极小,分布均匀,形态呈圆球形,且能与L02有效结合;体外乳胶囊显示:脱气水侧呈现无回声,靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂侧呈现高回声.结论 以去唾液酸糖蛋白受体为靶向受体,自制的携半乳糖化多聚赖氨酸的靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂能有效与人肝细胞LO2靶向结合,该靶向超声造影剂能在体外聚集显影.该靶向超声造影剂粒径极小,是细胞水平上肝靶向性超声分子显像的一种理想的超声分子探针.

Abstract：

Objective To prepare the liver targeting nano-liquid perfluorocarbon ultrasound contrast agent and observe its general characteristics;to observe the targeting combined effects of the human liver cells L02 and the targeted ultrasound contrast agent ;to evaluate the gathering imaging effects of the targeted ultrasound contrast agent. Methods Amine method was used to prepared asialoglycoprotein Gal specific ligand polylysine (Gal-PLL), rotary evaporator and sonicated liquid fluorocarbon were used to prepare nano lipid ultrasound contrast agent. Human liver cell L02 were cultured, the combined effects were observed according to the reacting time of the cells and the targeted nano-lipid ultrasound contrast agent. The nanolipid ultrasound contrast agent and the degassed_ water_ were loaded into cysts and their ultrasound imaging effects were observed by ultrasound diagnostic apparatus Philips iU22. Results The particle size of the liquid fluorocarbon nano-targeted lipid ultrasound contrast agent was extremely small, uniform, cylindrical and spherical. The cysts in vitro showed that the side of the targeted liquid perfluorocarbon nano-lipid ultrasound contrast agent showed high echo. Conclusions The targeted liquid perfluorocarbon nano-lipid ultrasound contrast agent can be effectively targeted to the human liver cells L02 due to carrying home-made Gal-PLL. The targeted ultrasound contrast agents can be imaging by ultrasound and be confirmed in vitro.The size of the contrast agent was small, therefore, it can be considered an ideal ultrasonic molecular probe and achieve the ultrasound molecular imaging in cell level.     

携抗HER-2抗体PLGA高分子纳米超声造影剂的制备及其体外寻靶实验

目的以高分子聚合物聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）为成膜材料制备携抗HER-2抗体空心纳米靶向超声造影剂,并考察其体外寻靶及显像效果。方法以樟脑为致孔剂,通过改进的双乳化溶剂挥发法制备PLGA纳米超声造影剂,利用扫描电子显微镜、透射电子显微镜及激光粒度仪对其一般特性进行表征;并用碳二亚胺法将造影剂与抗HER-2抗体耦联制备携抗HER-2抗体的PLGA靶向纳米超声造影剂,用激光共聚焦扫描显微镜对其体外寻靶能力进行初步评估,考察其体外成像效果。结果 PLGA纳米超声造影剂的平均粒径为（152.00±58.08）nm,粒子呈规则球形,大小均一,分散性好。体外寻靶实验显示,携抗HER-2抗体的PLGA靶向造影剂较多牢固地聚集到乳腺癌细胞表面。体外成像实验显示,PLGA靶向纳米超声造影剂显像呈细腻均匀的点状高回声,后方回声未见明显衰减。结论本研究成功制备了携抗HER-2抗体的PLGA靶向纳米超声造影剂,其能与HER-2受体高表达的乳腺癌细胞体外特异性靶向结合,且体外显像效果较好。     

超声空化微气泡造影剂对人乳腺癌细胞影响的实验研究

目的观察不同浓度脂质体微气泡造影剂在超声照射下对体外培养的人乳腺癌细胞的影响。 方法12孔板培养人乳腺癌细胞并分为：（1）对照组；（2）单纯超声照射组；（3）单纯造影剂组；（4）造影剂＋超声照射组。不同造影剂浓度下，声波发射强度一3dB，照射时间60s。给予实验刺激后，原子力显微镜动态观察细胞膜形态的改变，PI染色后观察细胞的活性。 结果单纯超声照射组及造影剂组细胞膜形态与对照组比较无明显改变。造影剂＋超声照射组细胞膜出现大小不等的微孔，提高造影剂浓度，孔径增大，但细胞活性显著下降。 结论微气泡造影剂显著增强超声的空化效应，提高细胞的通透性，对细胞形态及细胞活性的影响与造影剂浓度有关。     

携抗P-selectin靶向超声造影剂犬体内超声分子成像

目的 制备携抗P-selectin靶向超声造影剂,探讨其评价心肌缺血再灌注损伤的超声分子成像效果。方法 采用“生物素-亲和素”桥接法制备携抗P-selectin靶向超声造影剂,建立犬心肌缺血再灌注模型,分别注入携抗P-selectin靶向超声造影剂（MBp）和空白超声造影剂（MBc）,行心肌声学造影检查,采图、存盘。应用DFY型超声图像定量分析诊断仪中的彩色编码技术对存储的图像进行脱机处理,观察MBp体内超声分子成像效果。结果 成功制备携抗P-selectin靶向超声造影剂及建立犬心肌缺血再灌注模型。彩色编码图像示MBp行心肌声学造影可见缺血再灌注区心肌显著增强;MBc于缺血再灌注区心肌造影无明显增强。结论 应用携抗P-selectin靶向超声造影剂行心肌声学造影检查能准确检测再灌注治疗后犬心肌缺血再灌注损伤。