用双夹心斑点免疫金银染色法检测病人血中疟疾循环抗原

应用抗间日疟原虫和抗恶性疟原虫红内期抗原单克隆抗体建立了双夹心斑点免疫金银染色法和双夹心免疫酶斑点法并用于检测间日疟和恶性疟患者血清中循环抗原。共检测20份间日疟血清和15份恶性疟血清,双夹心斑点免疫金银染色法阳性率分别为90％和93％,可检出最低原虫密度为0.0009％;双夹心免疫酶斑点法阳性率分别为85％和87％,可检出最低原虫密度为0。0075％。与包虫病。弓形虫病和乙肝表面抗原阳性血清无交叉反应,检测60份健康献血员血清,两法分别有5％和8％假阳性。初步结果提示双夹心斑点免疫金银染色法检测疟疾循环抗原敏感度较高,若经过适当改进,有可能用于疟疾现场诊断和流行病学调查。     

动物疟原虫与人疟原虫的交叉反应抗原

目的分析5种疟原虫（间日疟原虫、恶性疟原虫,食蟹猴疟原虫、伯氏症原虫,约氏疟原虫）中,可被间日疟、恶性疟病人血清识别的交及反应抗原。方法用50％、60％Percoll不连续梯度分离疟原虫感染红细胞,20mmolPBS被红细胞后,收集红内期原虫,以1％NP—40提取可溶性抗原。各种抗原经SDS—PAGE电泳后,转移至硝酸纤维膜上,分别用间日疟、恶性疾病人血清进行免疫识别。结果3神动物疟原虫红内期抗原中有多条蛋白区带可被间日疟或恶性疟病人血清识别。其中合蟹报疟原虫有14条蛋白带被间日疟病人血清识别,伯氏疟原虫有16条蛋白区带被恶性疟病人血清识别,分别多于其它疟原虫。间日疟病人血清可识别5种疟原虫共有的72kD蛋白,而恶性疟病人血清不识别该蛋白。结论人疟原虫和动物疟原虫之间有一系列支又反应抗原。会压滤疟原虫与间日疟原虫,伯氏疟原虫与恶性疟原虫之间抗原相似程度高于其它疟原虫。72kD．蛋白在间日疟无疾学诊断方面可能有实用价值。     

彝良县重点疟区乡镇十年发热病人疟原虫血检调查

1996年一2005年在彝良县间日疟流行的牛街、洛旺、柳溪等重点疟区乡镇,进行发热病人疟原虫血检监测十年,监测结果血检当地无外出史发热病人12579例,检出间日疟疟原虫阳性77例,阳性率为0.61％;血检当地居民外出打工回归的发热病人610例,检出疟原虫阳性病例66例(间日疟63例,恶性疟3例),阳性率为10.82％。提示,当地居民外出感染回归发病的疟疾病例已占当地疟疾疫情总数的46.15％,流动人群疟疾管理问题不可忽视。     

用McAb检测患者血清循环抗原诊断黑热病的研究

作者首次报道应用单克隆抗体(McAb)检测黑热病患者血清内循环抗原获得成功。发现硝化纤维滤膜可以较好地吸附该循环抗原,再与高滴度McAb C-2结合及 ELISA显色(McAb-AST)可取得很好的效果。对20例确诊黑热病患者血清的试验结果,19例呈阳性反应,阳性率95％。正常人对照、间日疟及吸虫患者均显阴性反应。检测结果说明本试验的敏感性、特异性及重复性都很好,方法简易可行,对我国黑热病的诊断具有较好的前景。     

间日疟原虫重组蛋白用于检测间日疟患者抗体水平的观察

目的观察间日疟原虫重组蛋白PvMSP1-19用于检测间日疟患者抗体水平的效果。方法采用His-tag亲和层析柱对间日疟原虫PvMSP1-19重组蛋白初步分离,再经快速蛋白液相色谱仪（FPLC）XK16/70 Superdex75预装柱进一步纯化和Western blot分析。用纯化后的PvMSP1-19重组蛋白包被ELISA板,检测间日疟现症患者、既往感染者和正常人血浆IgG1、IgG4、IgM、IgD、IgE抗体水平。结果间日疟现症患者血浆中抗PvMSP1-19 IgG1抗体水平明显高于间日疟既往感染者和正常人（t=5.535,P〈0.05）。结论间日疟现症患者血浆中含有高水平的抗PvMSP1-19抗体IgG1。     

应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人，手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照献用恶性疟原虫PF1－2和间日疟原虫PV3－5为特异性引物，同在一个反应体系常规进行PCR，扩增片段分别为206bp和431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫／μl血和10个间日疟原虫／μl血的感染；检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65．1％，而镜检法为64．4％，且有1例漏诊和3例误诊，两法符合率为97％。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测，较镜检敏感、特异，适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断，还可用于血检质量的监控。     

昭通地区彝良县三个乡镇流动人群外出感染疟疾血检调查

1996年～2000年在彝良县,间日疟流行的牛街、洛旺、柳溪三个重点乡镇,进行发热病人疟原虫血检监测五年,血检当地无外出史发热病人7781例,检出间日原虫阳性53例,阳性率为0.68％,血检当地居民外出打工回归的发热病人403例,检出疟原虫阳性病例48例(间日疟46例,恶性疟2例),阳性率为11.91％。提示,当地居民外出感染回归发病的疟疾病例已占当地疟疾疫情总数的47.52％,流动人群疟疾管理问题不可忽视。     

用^32P标记海南株基因组DNA探针检测我国恶性疟原虫

作者从人工培养的海南株恶性疟原虫提取基因组DNA,以~(32)P-dATP用切口移位法标记,采用斑点杂交法检测培养的海南株、云南株及女徽株恶性疟原虫及其提取的DNA.结果表明,该探针可检测出各株疟原虫的密度和DNA水平如下:海南株为0.0001％和1pg众两株均为0.001％和10pg.诊断海南省和云南省恶性疟患者的血标本共39份,其中38份阳性.在10份间日疟患者血标本中7份出现交叉反应.此探针与约氏疟原虫、食蟹猴疟原虫和诺氏疟原也呈现交叉反应,但不与正常人血细胞发生杂交反应。     

云南省昭通市疟疾的实验室诊断研究

目的通过多种实验室方法综合诊断昭通市疟原虫疑似病例,为疟疾防治提供参考。方法用疟原虫检测试纸条(immune colloidal gold technique,ICGT)先做快速检测,然后按照镜检标准制作厚、薄血涂片,经常规吉氏染色后在油镜下(×1 000)的薄血膜观察疟原虫形态,鉴定虫种。最后针对间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)4种疟原虫的18s rRNA基因进行巢式PCR扩增。结果 10份县区采集的疑似病例,快速试纸条1532未做,3份可诊断为恶性疟,其它6例皆不能明确诊断;显微镜下4份可明确诊断为恶性疟,其中1201为高密度恶性疟,3份可明确诊断为间日疟,1649县级初次镜检误诊为间日疟,省级镜检确诊为卵形疟,1532县级初次镜检误诊为恶性疟,省级镜检未发现疟原虫;所有病例皆经省级采用巢式PCR扩增,4份确诊为恶性疟,3份确诊为间日疟,1649确诊为卵形疟,1532和A无条带。经快速检测、镜检、巢式PCR,证实昭通市2013年9月以来报告的10例疟疾病例分别为3例间日疟、4例恶性疟、1例卵形疟、2例阴性。结论基层镜检技术不稳定;胶体金法诊断结果不能作为确诊依据,镜检准确性依赖于镜检人员技术水平,剿式PCR法诊断最为准确;疟疾确诊需逐级复核和多种实验室方法综合判断。     

间日疟现症患者外周血树突状细胞亚群的变化

目的:观察间日疟现症患者外周树突状细胞(dendritic cells,DC)亚群比例的的变化,探讨DC亚群在间日疟发病机制中的作用。方法:采用流式细胞术四色荧光分析法检测18例间日疟现症患者(疟疾组)和36名健康成人(对照组)外周血的浆细胞样DC(pDC)和髓样DC(mDC)的比例。结果:疟疾组患者pDC明显低于对照组(P0.01),mDC/pDC明显高于对照组(P0.01),而mDC在2组间无明显不同(P0.05)。结论:间日疟现症患者机体呈现免疫抑制状态,间日疟原虫与DC相互作用,可能通过调整mDC/pDC的比值参与间日疟感染的Th1型免疫应答的诱导和调控。     

间接荧光抗体试验在疟疾血清流行病学监测中的应用

目的 评价IFAT在湖南省疟疾监测中的应用效果。方法 选择桂东等35个县(市)为调查点,新化等5县(市)为纵向监测点。以食蟹猴疟原虫作抗原,1：20稀释样本血,用IFAT对疟疾的免疫诊断、血清流行病学调查和监测进行了观察。结果 间日疟抗体阳性符合率99.08％,GMRT62．34,假阳性率0．82％。佳东等35个县(市)疟疾年发病率降至0．1‰以下4—18年以后,IFAT平均阳性率1．65％(670／40676)。新化等5县(市)纵向监测点平均阳性率2．11％(511／24211)。结论 IFAT在间日疟诊断、血清流行病学监测中的敏感性、特异性高;同时表明全省疟疾防治效果巩固。     

OptiMAL疟疾快速诊断试纸条的现场应用评价

目的 评价检测疟原虫乳酸脱氢酶快速诊断试纸条产品OptiMAL现场应用效果。方法 以疟原虫镜栓诊断为标准，用OptiMAL试纸条检测疟区门诊发热病人中的疟疾病人。结果 检测间日疟的敏感度为59％（95％CI：0．4754—0．6983），特异度为95％（95％CI：0．9268～0．97）；检测恶性疟的敏感度为60％（95％CI：0．2307～0．8824），特异度为99％（95％CI：0．9803—0．9985）。出现1例间日疟交叉反应。结论 快速诊断试纸条能够在基层简易、快捷的用来诊断间日疟和恶性疟。     

云南省一类疟区间日疟原虫IgG抗体血清流行病学调查

目的监测云南省一类疟区人群的间日疟原虫抗体(Ig G)水平,为云南省消除疟疾行动的流行预测和防控效果评价提供科学依据。方法 2013—2014年在云南6个一类疟区县(市)采用分层随机抽样采集居民滤纸血膜,采用ELISA试剂盒检测间日疟原虫特异性抗体,采用SPSS 20.0统计软件进行抗体阳性率及抗体滴度检验,变量间相关性进行Pearson分析。结果共检测腾冲、盈江、耿马、瑞丽、孟连、盐津6县(市)的7 050份血样,间日疟原虫抗体(Ig G)阳性率为9.05%,各县间抗体阳性率差异有统计学意义(P0.05),且5个边境县的平均抗体阳性率显著高于内地县盐津的阳性率,差异有统计学意义(P0.05);女性的阳性率9.98%显著高于男性7.95%,差异有统计学意义(P0.05);学生的阳性率10.79%显著高于居民7.74%,差异有统计学意义(P0.05);少年儿童、青壮年和中老年组的阳性率分别为9.52%、7.59%和9.40%,各组间差异无统计学意义(P0.05);全省合计及6个县(市)2013年和2014年的抗体阳性率差异均无统计学意义(P0.05)。结论云南省一类疟区的人群间日疟原虫抗体(lg G)水平能反映前期的疟疾流行强度,女性、学生人群间日疟原虫抗体水平高的现象值得重视。     

胶体金层析法检测恶性疟原虫HRPⅡ抗原的应用研究

建立一种简易快速，适于基层或流行病学调查的自测试胶体金免疫层析法用于检测恶性疟原虫中ＨＲＰⅡ抗原，判定是否现症感染。方法用ＧＩＣＡ测试条检测全血及滤纸血样中的ＨＲＰⅡ抗原。结果４０例恶性全血及滤纸血ＨＲＰⅡ抗原阳性检出率均为１００％，与镜检结果相符合；２５例间日疟均为阴性。     

42例间日疟患者血小板值变化相关分析

目的 研究间日疟患者血小板计数的变化,探讨疟原虫与血小板减少之间的关联性.方法 选取42例间日疟患者,机械与手工联合进行血小板计数.结果 42例患者经油镜检查疟原虫,均证实为间日疟.其中33例患者有血小板计数的降低,占患者总数的78.6%,所有患者平均血小板计数65×1012/L.结论 疟原虫感染可以引起血小板减少,与血小板减少相关联.在临床上高热患者的诊断中,重视血小板减少患者的疟原虫检查,可以提高疟疾患者的确诊率,减少漏诊,对疟疾的早期诊断、早期治疗都能起到积极的作用.     

用食蟹猴原虫抗原作间接荧光抗体试验对间日疟和恶性疟的检测效果比较

间接荧光抗体试验(IFAT)是一种较广泛应用于疟疾血清学诊断的方法。目前国内均用食蟹猴疟原虫抗原作IFAT调查疟疾,为了解不同疟原虫种感染对此种抗原的敏感性,以便为不同虫种的疟疾流行区调查提供依据,我们于1988年选择部份间日疟和恶性疟患者进行比较观察。     

间日疟原虫在郑州中华按蚊体内的易感性和发育过程

目的：了解郑州中华按蚊感染间日疟原虫后,疟原虫在其体内的易感性和发育过程。方法：以羊膜饲血法供郑州中华按蚊吸食间日疟患者血液,养殖饱吸血液的雌蚊,定期解剖观察疟原虫在体内的生长与发育。结果：疟原虫雌、雄配子体在其胃内15 min即发育成熟,45min结合为动合子,26h动合子发育成熟,48h胃壁出现囊合子,7～8 d子孢子即已进入唾液腺。胃囊合子阳性率为26．4％,腺阳性率为19．4％,总阳性率为45．8％,从第7 d起有少量子孢子进入唾液腺,8 d后进腺率显著增高,子孢子进腺过程是分批的连续过程,不是同步的。结论：郑州中华按蚊对间日疟易感性较高,吸间日疟原虫配子体阳性血液后7～8 d即可传播疟疾。     

多重巢式聚合酶链反应在疟疾混合感染检测与分型中的应用

目的:应用能够同时检测恶性疟(P.falciparum)、间日疟(P.vivax)、卵形疟(P.ovale)、三日疟(P.malarie)及其混合感染的多重巢式PCR方法,对疑似疟疾混合感染样本进行检测,评价其在疟原虫混合感染及分型中的应用价值,旨在为疟疾流行病学调查、疟疾混合感染的确诊提供一种快速高效、特异性强、灵敏度高的实验室诊断方法,为传统的镜检法提供有效的补充。方法:根据恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的18SSU rRNA基因序列设计5对引物(1对通用引物、4对特异性引物),以等比例混合的4种疟原虫核酸为模板,建立疟疾多重巢式PCR检测方法,并应用该法对28份疑似疟疾混合感染样本进行检测及测序验证,将其结果与镜检法比较。结果:28份疑似混合感染样本中混合感染样品数为6例,其中恶性疟和间日疟混合感染样品5例,恶性疟和卵形疟混合感染样品1例。结论:本研究建立的多重巢式PCR检测方法能够同时用于恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟及其混合感染样本的检测,在疟疾混合感染的确诊与分型上较镜检法有明显的优势和更高的应用价值。     

间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

武汉市两种输入性卵形疟巢式PCR检测

目的 了解巢式PCR鉴别卵形疟curtisi及变种wallikeri效果。方法 收集武汉市2008—2015年疟疾患者血样和流行病学资料。提取患者血样中的疟原虫DNA,进行巢式 PCR 检测。结果 采用巢式PCR检测疟疾患者282例,其中恶性疟原虫206例、间日疟原虫62例、三日疟原虫6例、卵形疟原虫19例。巢式PCR结果显示,卵形疟原虫经典型curtisi 和变种型wallikeri 分别扩增出800 bp和780 bp目的 条带。2012—2015年卵形疟占当年疟疾患者分别为4.1%（2/49）、12.2%（9/74）、8.2%（4/49）、11.4%（4/35）,卵形疟总数占全部病例的6.74%,其中,经典型curtisi 14例,变种型wallikeri 3例,混合感染2例,变种型wallikeri检出率占卵形疟26.3%。19例卵形疟病例全部为男性,感染输入地主要分布在撒哈拉沙漠以南地区,2例卵形疟混合感染分别来自安哥拉和尼日利亚。其中有2例卵形疟原虫curtisi型镜检 结果分别为间日疟和恶性疟,1例血片重新复核后为卵形疟,另1例巢式PCR检测为间日疟和卵形疟混合感染型。结论 分子生物学技术可以减少卵形疟误诊的情况;加强卵形疟curtisi及变种wallikeri的巢式PCR 检测,避免误诊。