嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞迁移的影响

目的：血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）迁移在血管成形术后再狭窄的发生中起着关键作用。ｃ－ｍｙｃ是对多种刺激ＳＭＣ迁移的生长因子作出迅速早期反应的基因。推测采用与ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ互补的寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）的反义战略可达到抑制ＳＭＣ迁移的目的。方法：将嵌合性硫代磷酸修饰的反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ通过ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＳＭＣ后,采用改良的Ｂｏｙｄｅｎｃｈａｍｂｅｒ方法检测ＳＭＣ的迁移率。结果：反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ作用的ＳＭＣ对１０％ＦＢＳ的化学趋化活性明显减弱,反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ显著抑制了ＳＭＣ迁移。而正义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ和错配ｃ－ｍｙｃＯＤＮ处理的ＳＭＣ,与对照组相比,迁移率无差别。结论：（１）反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ对体外ＳＭＣ迁移的抑制具有序列特异性;（２）ｃ－ｍｙｃ基因表达在ＳＭＣ迁移的信号通路中起关键作用;（３）本研究为采用ｃ－ｍｙｃＯＤＮ的战略抑制ＳＭＣ迁移进而防止血管成形术后再狭窄的发生奠定了基础     

嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究

目的：探讨ｃ－ｍｙｃ基因表达在血管平滑肌细胞增殖信号传导通路中的作用和采用反义ｃ－ｍｙｃ寡脱氧核苷酸抑制血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）增殖的作用。方法：采用针对大鼠ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ包括ＡＵＧ在内的翻译起始区的前５个密码子的嵌合性硫代修饰的反义ｃ－ｍｙｃ寡脱氧核苷酸（ＡＳ－ＯＤＮ）,以ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＳＭＣ后,通过细胞计数和３Ｈ－ＴｄＲ掺入观察其对ＳＭＣ增殖的抑制作用。结果：ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ不仅对从静止状态刺激的ＳＭＣ增殖有抑制作用,而且对处于增殖状态的ＳＭＣ的增殖也有显著抑制作用,这种抑制作用可因加入正义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ而减弱甚至消除,而且随着剂量的增加,抑制作用越来越明显。一次性应用ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ可达到较持久的作用。而正义ＯＤＮ和错配ＯＤＮ对ＳＭＣ增殖无影响。结论：ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ以剂量依赖和序列特异方式抑制ＳＭＣ增殖。ｃ－ｍｙｃ基因表达在ＳＭＣ增殖的信号传导通路中起重要作用。为采用ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ抑制ＳＭＣ增殖的反义战略防治再狭窄研究奠定了基础。     

反义硫代寡核苷酸体外抑制柯萨奇病毒B3增殖的研究

目的 在ＣＶＢ３易感的Ｖｅｒｏ细胞系中观察与ＣＶＢ３ＲＮＡ５’ＮＣＲ的ｎｔ５８１－６０１区域区补的２１聚硫代ＡＯＤＮ抗病毒活性。方法 采用ＭＴＴ法测定细胞活性,直接观察ＣＰＥ,测定培养上清ＴＣＩＤ５０,并分别用ＥＬＩＳＡ和往点杂交法检测ＣＶＢ３抗原及其ＲＮＡ。结果 １．ＡＯＤＮ可推迟和减轻ＣＰＥ,且随ＡＯＤＮ浓度增加,对ＣＰＥ的抑制作用增强,感染细胞存活率也随ＡＯＤＮ浓度升高而升高;２．ＡＯＤＮ可     

T细胞受体Vβ基因在识别HSV—2过程中的表达水平和特点

本课题主要研究Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）识别抗原后Ｖβ基因发生重排，ｍＲＮＡ表达水平改变。用紫外线处理的单纯疱疹病毒－２型（ＨＳＶ－２）、ＨＳＶ－２及ＰＨＡ分别感染或刺激正常人的ＰＢＬｓ，培养４～６天后，提取ｍＲＮＡ，并采用ＲＴ－ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交发现识别ＨＳＶ－２的ＴＣＲＶβ２、６、７、８基因在体外选择性扩增。在采用ＨＳＶ－２攻击皮肤病患者发作期、缓解期以及再发作期的ＰＢＬｓ时，发现ＴＣＲＶβ基因表达随着病程变化而改变，尤其Ｖβ７亚家族表达水平显著高于其它亚家族基因，这显示了ＴＣＲＶβ基因的变化是恒定特异性的。     

表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D的重组痘苗病毒活疫苗株的建立

我们以前曾报道，表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白Ｄ（ＨＳＶ－２ｇＤ）的重组痘苗病毒（实验疫苗株）能保护被免疫小鼠抵抗致死量ＨＳＶ－２病毒的攻击。在此工作基础上，严格按人用疫苗研究要求的实验条件，成功地建立了表达ＨＳＶ－２ｇＤ的重组痘苗病毒活疫苗株。首先将经聚合酶链反应（ＰＣＲ）修饰的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入痘苗表达质粒ｐＪＳＢ１１７５，置于痘苗病毒Ｐ７５Ｋ早／晚期启动子控制下。将此重组质粒用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ＋痘苗病毒天坛７６１株感染的人胚肺二倍体细胞。经同位素探针（３２Ｐ－ＨＳＶ－２ｇＤ）原位杂交法和３轮蚀斑纯化，筛选出基因组内整合有ＨＳＶ－２ｇＤ基因的重组痘苗病毒。斑点和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实，ＨＳＶ－２ｇＤ基因已插入痘苗病毒基因组内预期的ＴＫ区段，间接免疫荧光检测显示，重组病毒感染细胞后能有效地表达ＨＳＶ－２ｇＤ蛋白。     

IL-18与HSV-2gD模拟抗原表位DNA疫苗的免疫效果观察

目的:研究串联重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSVP6和pcDNA3.1-IL-18-HSVNP6对机体的免疫效果。NP6为与HSV-2gD模拟抗原P6最相似的天然抗原表位序列(Accession Number:E00394)。方法:将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-18、pcDNA3.1-IL-18-HSVP6和pcDNA3.1-IL-18-HSVNP6肌内注射免疫接种BALB/c小鼠3次,每次间隔1周。末次免疫后1周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量;末次免疫后一月,处死小鼠,无菌分离脾脏,MTT法测定脾淋巴细胞增殖率。结果:重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSVP6免疫小鼠后可刺激血清特异性抗体的产生,诱导分泌较高水平的IFN-γ和IL-18。可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。结论:重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSVP6能诱导较强的细胞免疫和体液免疫,从而为构建更加有效的HSV-2DNA疫苗奠定了良好的基础。     

人类疱疹病毒6、7型体外感染淋巴细胞对CD抗原表达的影响

人类疱疹病毒6 、7型(HHV-6、HHV-7)是近年发现的人类疱疹病毒家族的新成员,它们对淋巴细胞具有高度的亲嗜性,同属于人类β-疱疹病毒.HHV-6根据体外生长特点,对单抗的反应性及限制性酶切图谱等方面特征又分为2种类型:A型和B型[1].本文研究了HHV-6A型株GS及我室分离的HHV-6 B型株 CN5、HHV-7YY5 3株病毒感染淋巴细胞对CD抗原表达的影响[2,3],并对其免疫机理作了初步探讨.     

原癌基因c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)在哮喘发病中作用的实验观察

目的：观察原癌基因c-myc、增殖细胞核抗原（PCNA）在正常和哮喘豚鼠气道肺组织中的表达与哮喘发病的关系。方法：应用Dot和Northen分子杂交和免疫组化技术。结果：c-mycmRNA及PCNAmRNA在正常豚鼠气道及肺组织可见低度表达。豚鼠哮喘发作后。c-myc及PCNAmRNA增高,30min达高峰分别为正常的3．51．4倍（P＜0．05）,免疫组化显示c-myc与PCNA蛋白主要分布在气道上皮细胞,平滑肌细胞,其分布及密度无显著差别。结论：c-myc及PCNA基因表达增高在哮喘病理过程中可能起重要作用。     

HSV-2gD模拟抗原表位、HBsAg与IL-18融合蛋白DNA疫苗的免疫效果观察

目的:研究串联重组核酸疫苗pc(pcDNA3.1)-S(HBsAg)-P6-IL18和pc(pcDNA3.1)-S(HBsAg)-NP6-IL18对机体的免疫效果,P6是我们前期采用噬菌体展示技术筛选出的HSV-2gD的模拟抗原表位,NP6为与HSV-2gD模拟抗原表位P6最相似的天然抗原表位序列。方法:分别将空质粒pcDNA3.1(阴性对照组)和构建的真核表达质粒pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18肌内注射免疫接种BALB/c小鼠3次,每次间隔2周。末次免疫后2周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量;末次免疫后一月,处死小鼠,无菌分离脾脏,用刀豆蛋白A刺激淋巴细胞,采用MTT法测定脾淋巴细胞增殖率。结果:重组核酸疫苗pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18免疫小鼠后可刺激血清特异性抗体(抗HBsAg抗体和抗HSV-2gD模拟表位抗体)的产生,与阴性对照组相比可诱导分泌较高水平的IFN-γ和IL-18,可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。结论:重组核酸疫苗pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18能诱导较强的细胞免疫和体液免疫,可用于今后预防HBV和HSV-2感染的研究。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白D主要抗原表位区的表达、纯化及鉴定

 目的 原核表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1) 糖蛋白D(gD)主要抗原表位区,纯化融合表达蛋白并对其进行鉴定。方法 用Lasergene7.0中Protean软件对HSV-1 gD氨基酸序列进行抗原表位预测和分析,筛选出gD主要抗原表位区(gD MED),人工合成该区域cDNA序列,构建原核表达载体pET-GST-gD MED;将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3) pLysS,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过GST?Bind 纯化试剂盒对gD MED融合蛋白进行纯化;Western blot对gD MED融合蛋白的免疫活性进行分析。结果 HSV-1 gD在266~394区域富含抗原表位,人工合成了该区域的cDNA序列,并成功构建了原核表达载体pET-GST-gD MED;gD MED融合蛋白主要以可溶形式表达,分子质量约为45 ku,纯度能达95%;Western blot结果显示,gD MED融合蛋白能与感染HSV-1患者的血清发生特异结合。结论 成功表达和纯化了具有良好抗原性的HSV-1 gD MED融合蛋白,为HSV免疫诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核壳蛋白在转基因小鼠中的表达及与Fas抗原关系的初步研究

将中国人丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）分离株的５’－非编码区和结构基因（５ＵＴＲ＋Ｃ＋Ｅ１＋Ｅ２）区基因插入到ｐｃＤＮＡ３载体中构成表达质粒，通过显微注射法将此质粒注射入Ｆ１代杂交鼠（Ｃ５７ＢＬ／６ＸＩＣＲ）受精卵，并植入假孕母鼠输卵管中，经筛选获得整合有目的基因的转基因小鼠系。免疫组化研究表明，ＨＣＶ核壳蛋白在转基因小鼠各组织中皆有表达，多呈核型染色，心肌细胞中可见浆型。核壳蛋白在各组织中的表达水平；心＞肺＞肾＞肝，同时在转基因小鼠心、肾、肝中检出Ｆａｓ抗原的表达，其表达水平与核壳蛋白的表达呈正相关关系。提示ＨＣＶ核壳蛋白的表达可引起Ｆａｓ抗原的表达。     

乙型肝炎病毒表面抗原S基因在人5型重组腺病毒中的表达及其特性

The hepatitis B virus (HBV) S gene, PreS2 + S genes and the late phase expression cassette (MTI) + HBV S genes were separately cloned into Ad5 vector downstream of E3 promoter (pAd5 deltaE3 provided by Wyeth Co.). The above constructed plasmids and Ad5 DNA EcoR I A fragment were cotransfected into 293 cells. The progeny adenoviruses named rAd5S, rAd5MS, rAd5S2S were harvested for analysis. The recombinants were isolated and analyzed by PCR, using two primers specific to the HBV S genes. The expressed products were detected by ELISA and RIA. The recombinant containing MIT + HBV S genes (rAd5MS) was identified to be ELISA positive, whereas the other two recombinants (rAd5S, rAd5S2S) were negative to ELISA, but positive to RIA. The results indicated that adenovirus E3 early promoter could express the inserted foreign genes, and MIT worked well in the E3 region of Ad5 and could increase the expression capacity of the recombinants. The conditions for foreign gene expression and genetic stability of the recombinant viruses were studied in detail. There was no wild Ad5 discovered during the cotransfection experiments. The present study provides some experiences for studying adenovirus recombination.     

TORCH与优生：Ⅱ．羊水细胞、绒毛、畸胎组织及宫颈分泌物等单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的PCR检查

我室应用聚合酶链反应(PCR)技术，采用自行设计和合成的三条引物(一条为两型共同引物，两条为两型特异引物)蛆成一个反应扩增体系，对63例羊水或绒毛、14例畸胎组织、100例宫颈分泌物及50例宫颈石蜡包埋切片进行单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的检测，其阳性率分别为4．8%，14．3%，16%及10%。阳性标本中90%是HSV—Ⅱ，10％为HSVⅠ型或Ⅰ Ⅱ型混合感染。提示：HSV—Ⅱ感染与胎儿先天性畸形有关，与宫颈组织炎性浸润、细胞过度增生也有关系。     

人乳头瘤病毒、沙眼衣原体和单纯疱疹病毒Ⅱ型感染与宫颈疾病的相关性研究

目的 探讨人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,CT)和单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virusⅡ,HSV-Ⅱ)感染与宫颈疾病的关系.方法 采用核酸分子快速杂交基因分型技术对598例宫颈脱落细胞进行HPV感染基因型分型测定,同时应用实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测CT和HSV-Ⅱ两种病原体的感染情况.结果 HPV、CT和HSV-Ⅱ的阳性检出率分别为24.9％、9.2％和8.9％,且随着宫颈病变程度加重而逐渐增高,宫颈炎组和宫颈癌病变组三种病原体的感染率差异均有统计学意义.HPV感染以高危型为主(占77.9％),低危型为22.1％.HPV高危型和阴性组比较两种病毒的感染率有统计学差异(CT:x2=26.97,P＜0.05;HSV-Ⅱ∶x2=65.93,P＜0.05).各宫颈病变组均有多病毒混合感染情况出现,其中宫颈癌组混合感染率为22.2％.结论 HPV、CT和HSV-Ⅱ感染与宫颈癌的发生密切相关,多病原体混合感染会促进宫颈癌的发生.     

人乳头瘤病毒16型致瘤基因E6在昆虫细胞中表达及其蛋白抗原特性的初步研究

目的研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）相关肿瘤患者的ＨＰＶ１６Ｅ６抗体水平及其流行病学意义；探讨用杆状病毒－昆虫细胞表达载体系统表达的ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白的抗原性。方法用ＰＣＲ从ＨＰＶ１６基因组中扩增出ＨＰＶ１６Ｅ６完整基因，克隆至转移载体ｐＶＬ１３９３中，重组质粒ＤＮＡ与线性杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ－９，经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６基因的重组杆状病毒株，并在昆虫细胞中表达。结果Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和高效液相色谱法检测ＨＰＶ１６Ｅ６表达蛋白，其分子量约为１８０００。免疫印迹检测显示其能与兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６多抗特异性结合。酶联免疫吸附试验表明此重组蛋白能被人ＨＰＶ１６阳性血清所识别。结论昆虫细胞表达的ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白，具有良好的抗原性，可用于检测ＨＰＶ１６Ｅ６特异性免疫球蛋白ＩｇＧ和ＩｇＭ抗体     

灯盏花素干预糖尿病模型大鼠睾丸组织增殖细胞核抗原和c-fos的表达

背景：有研究表明灯盏花素可影响2型糖尿病大鼠的生殖能力,但其作用机制少有报道。 目的：探讨灯盏花素对2型糖尿病大鼠睾丸增殖细胞核抗原和原癌基因c-fos表达的影响作用。 方法：选取36只健康雄性大鼠随机分为对照组、模型组和灯盏花素组各12只。模型组和灯盏花素组采用链脲佐菌素连续腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型,大鼠血糖监测达到16.7 mmol/L作为建模标准,对照组大鼠予以同等容积的柠檬酸缓冲液单次腹腔注射。灯盏花素组采用灯盏花素注射液10 mg/(kg•d)连续4周腹腔注射,其他2组在相同时间注入等量生理盐水。 结果与结论：干预4周后,血清睾酮检测、免疫组织化学染色和PCR检测结果显示,血清睾酮水平、增殖细胞核抗原、c-Fos蛋白及mRNA表达：对照组>灯盏花素组>模型组(P < 0.05);血糖水平：对照组<灯盏花素组<模型组(P < 0.05)。结果证实,灯盏花素可以通过增强增殖细胞核抗原和c-fos的表达,保护2型糖尿病大鼠的生殖功能。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

P型铜转运ATP酶和增殖细胞核抗原在大、小鼠肝的表达

目的:研究P型铜转运ATP酶(ATP7B)与增殖细胞核抗原(PCNA)在大鼠和小鼠肝组织中的表达.方法:采用免疫组织化学法检测肝中ATP7B与PCNA的表达.结果:ATP7B在大鼠和小鼠的肝细胞质表达,表达较广泛.肝细胞PCNA的表达强弱不一,强阳性细胞较少,大鼠和小鼠肝的ATP7B和PCNA积分光密度间的差异均无统计学意义;在大鼠或小鼠肝,ATP7B与PCNA的免疫反应阳性物积分光密度间无显著相关性.结论:ATP7B和PCNA在大鼠和小鼠肝组织均有表达,表达的关联性不明显.     

人类白细胞Ⅱ类抗原DR、DQ基因型与妊娠期糖尿病的相关性研究

目的探讨人类白细胞II类抗原DR、DQ基因型与妊娠期糖尿病的相关性。方法对26例GDM孕妇及同期入院的42例正常健康孕妇,采用序列特异性引物聚合酶链反应技术(PCR-SSP)检测HLA-II类抗原DR和DQ的等位基因。结果研究中发现,DQA1*0101、DQA1*0201、DQB1*0609、DRB l*07-DQA1*0201-DQB1*0201基因频率在GDM中显著高于正常对照组,两组比较,统计学有差异(Ρ<0.05)。DQB1*0301基因频率在GDM中显著低于正常对照组,两组比较,有统计学差异(Ρ<0.05)。结论人类白细胞II类抗原DR、DQ基因型与GDM的易感性和保护性存在关联。DQA1*0101、DQA1*0201、DQB1*0609、DRB l*07-DQA1*0201-DQB1*0201基因是GDM的易感基因。DQB1*0301基因是GDM的保护基因。