黏附诱导卵巢癌细胞基质金属

目的 观察黏附纤黏连蛋白后肿瘤细胞基质金属蛋白酶（MMP）基因的表达,揭示细胞侵袭发生的机理。方法 纤黏连蛋白与A2780人卵巢癌细胞相互作用后,用反转录PCR观察MMP mRNA的表达;从HT1080细胞基因组DNA克隆MMP9启动子区基因,构建MMP－9－gGL2报告基因载体,瞬时转染A2780细胞,通过测定萤火虫酶活性,观察纤黏连蛋白对MMP9启动子活性的影响。结果 A2780细胞不表达MMP基因,,黏附后细胞内MMP－9mRNA含量明显增加,这一作用与黏附时间有关。克隆MMP－9基因启动子并转染细胞,黏附后转染细胞内MMP－9基因启动子活性明显增强。结论 细胞－细胞外基质黏附可刺激MMP基因转录活性,诱导MMP基因表达,进而促进细胞侵袭。     

HAb18G/CD147刺激人肝癌细胞分泌基质金属蛋白酶的机制探讨

目的探讨HAb18G/CD147诱导肝癌细胞基质金属蛋白酶(MMP)分泌和活化的机制.方法应用明胶酶谱分析方法观察HAb18G/CD147分子及其细胞内、外片段高表达对人SMMC-7721肝癌细胞分泌MMP(MMP-2和MMP-9)及其活化的影响,以及细胞内Ca2 信号调控在此过程的作用.结果HAb18G/CD147分子的高表达明显诱导MMP-2和MMP-9的分泌和活化,分泌总量升高(30.45±3.41)%(P＜0.01),而细胞内、外各片段的表达均不能有效刺激MMP的分泌与活化.细胞内Ca2 库释放诱导剂Thapsigargin(Tg)在未转染7721细胞可有效诱导MMP-2和MMP-9的分泌与活化,较对照组升高(58.63±31.04)%(P＜0.05),其诱导作用可受到细胞内Ca2 调节抑制剂S-亚硝基-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine,SNAP)的明显抑制,而HAb18G/CD147的高表达则抑制了以上细胞内Ca2 信号通路对MMP分泌和活化的调节作用,使转染的T7721细胞MMP的分泌与活化始终处于高水平稳定状态.结论全长的HAb18G/CD147分子可通过抑制细胞内Ca2 信号调控通路诱导肝癌细胞稳定高表达和活化MMP.     

p38 MAPK在胃泌素诱导结肠癌细胞表达u-PA中的作用

目的研究胃泌素对人结肠癌细胞尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)mRNA和蛋白表达的影响,探讨信号分子p38 MAPK在其中的作用。方法采用脂质体介导法,将胃泌素受体(CCK_2R)的真核表达载体pCR3.1/CCK_2R稳定转染人结肠癌细胞株colo320,上调胃泌素的作用;用胃泌素拮抗剂(L-365、260)下调胃泌素的作用。给予10nmo/L胃泌素刺激不同时间,阻断实验以SB203580阻断p38通路,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内u-PA mRNA的表达,采用Western blot检测细胞内u-PA和p38 MAPK蛋白表达的强度。结果胃泌素可明显增强colo320/ CCK_2R细胞u-PA mRNA和蛋白的表达,并可激活p38 MAPK蛋白的磷酸化,具有时间依赖性,但对colo320细胞的影响程度明显低于colo320/CCK_2R细胞。使用L-365、260后,胃泌素对u-PA和phospho p38 MAPK的诱导作用明显下降。SB203580可明显抑制胃泌素诱导的p38 MAPK激酶的磷酸化,用其阻断p38激酶信号通路后,胃泌素对u-PA的诱导作用受到显著的抑制,并且具有剂量依赖性。结论胃泌素与其受体结合后,可通过p38 MAPK信号转导通路诱导结肠癌细胞表达u-PA。     

FOXC2对卵巢癌血管生成及作用机制的研究

目的 探讨叉头框C2(forkhead box C2,FOXC2)对人卵巢癌肿瘤血管生成及作用机制.方法 应用FOXC2慢病毒基因转染技术,将FOXC2-LV和空载体基因分别转染到人卵巢癌A2780细胞株.细胞分为未转染组、空载体组和FOXC2过表达组.Matrigel基质胶血管形成实验和Transwell小室检测各组细胞上清作用下人脐静脉内皮细胞(HUEVCs)成管能力和迁移能力的变化.RT-PCR检测各组细胞FOXC2、DLL4/Notch1、内皮细胞粘附分子(Platelet endo-thelial cell adhesion molecule-1,CD31)和基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP2)mRNA表达,Western blot检测各组细胞FOXC2、DLL4/Notch1、CD31和MMP2蛋白表达.结果 FOXC2过表达组A2780细胞上清诱导HUEVCs闭合小管数和迁移细胞数均显著高于未转染组、空载体组(P<0.05).FOXC2过表达组DLL4/Notch1、CD31和MMP2 mR-NA表达水平均显著高于未转染组和空载体组(P<0.05).FOXC2过表达组DLL4/Notch1、CD31和MMP2 mRNA蛋白表达水平均显著高于未转染组和空载体组(P<0.05).结论 FOXC2可能通过上调DLL4/Notch1、CD38及MMP2表达促进HUEVCs成管能力和迁移能力,影响卵巢癌发展.     

H1299细胞中Plk3对p73转录活性的影响

背景与目的：研究表明蛋白激酶Plk3可以增加肿瘤抑制因子p53的转录活性,但对p73转录活性的影响尚不清楚,因此本实验旨在研究蛋白激酶Plk3对p73转录活性的影响。方法：选用p53缺失型人类肺癌细胞系H1299,采用荧光素酶报告剂分析、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）及克隆形成实验的方法研究蛋白激酶Plk3及激酶活性缺失的Plk3（K52R）对p73转录活性的影响。结果：荧光素酶报告剂分析结果显示,单独转染p73基因可以增加p21WAF1和Bax启动子介导的荧光素酶的表达（P〈0.05）;共转染p73基因和Plk3基因,p21WAF1和Bax启动子介导的荧光素酶的表达与单独转染p73基因组相比显著降低（P〈0.05）,且呈浓度依赖性;而激酶活性缺失的Plk3（K52R）对p21WAF1和Bax启动子介导的荧光素酶的表达没有显著影响（P〉0.05）。RTPCR检测结果也显示,p73诱导p21WAF1和Bax的mRNA表达（P〈0.05）,Plk3降低了p73诱导的p21WAF1和Bax的mRNA表达水平（P〈0.05）;而激酶活性缺失的Plk3（K52R）对p73诱导的p21WAF1和Bax的mRNA表达水平无显著影响（P〉0.05）。克隆形成实验结果显示,p73抑制了H1299细胞克隆的形成（P〈0.05）,Plk3降低了p73对H1299细胞克隆形成的抑制（P〈0.05）,而激酶活性缺失的Plk3（K52R）对p73抑制H1299细胞克隆形成无显著影响（P〉0.05）。结论：Plk3可以抑制p73的转录活性,而激酶活性缺失的Plk3（K52R）对p73的转录活性无明显影响。     

蛇葡萄素通过Dermcidin蛋白调节肝癌细胞株HepG2侵袭活力及侵袭基因表达的实验

 目的 研究蛇葡萄素（AMP）对肝癌细胞株HepG2侵袭活力及侵袭基因表达的调节作用及分子机制。方法 培养肝癌细胞株HepG2后用不同剂量的AMP处理（20、40、60、80 μmol/L）、转染Dermcidin的siRNA,测定细胞的迁移能力、侵袭能力以及Dermcidin、侵袭基因mRNA表达量。结果 不同剂量AMP处理后细胞的迁移、侵袭数目及细胞中Dermcidin、基质金属蛋白酶（MMP）2、MMP9、MMP10 mRNA水平均低于对照组,且AMP剂量越大,细胞的迁移、侵袭数目及细胞中Dermcidin、MMP2、MMP9、MMP10 mRNA水平越低;80 μmol/L AMP联合dermcidin siRNA后,HepG2细胞的迁移、侵袭数目以及细胞内MMP2、MMP9、MMP10 mRNA表达水平均增多。结论 AMP通过下调Dermcidin蛋白来抑制肝癌细胞株HepG2的侵袭活力、降低侵袭基因的表达水平。     

H1299细胞中P1k3对p73转录活性的影响

背景与目的:研究表明蛋白激酶P1k3可以增加肿瘤抑制因子p53的转录活性,但对p73转录活性的影响尚不清楚,因此本实验旨在研究蛋白激酶P1k3对p73转录活性的影响.方法:选用p53缺失型人类肺癌细胞系H1299,采用荧光素酶报告剂分析、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及克隆形成实验的方法研究蛋白激酶P1k3及激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73转录活性的影响.结果:荧光素酶报告剂分析结果显示,单独转染p73基因可以增加p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达(P<0.05);共转染p73基因和P1k3基因,p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达与单独转染p73基因组相比显著降低(P<0.05),且呈浓度依赖性;而激酶活性缺失的Plk3(K52R)对p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达没有显著影响(P>0.05).RT-PCR检测结果也显示,p73诱导p2~(WAF1)和Bax的mRNA表达(P<0.05),P1k3降低了p73诱导的p21~(WAF1)和Bax的mRNA表达水平(P<0.05);而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73诱导的p21~(WAF1)和Bax的mRNA表达水平无显著影响(P>0.05).克隆形成实验结果显示,p73抑制了H1299细胞克隆的形成(P<0.05),P1k3降低了p73对H1299细胞克隆形成的抑制(P<0.05),而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73抑制H1299细胞克隆形成无显著影响(P>0.05).结论:P1k3可以抑制p73的转录活性,而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73的转录活性无明显影响.     

破坏泛素依赖的蛋白水解通路对p53转录激活的抑制作用

目的 :研究功能性泛素化及蛋白酶体水解过程对p5 3转录激活的影响。方法 :通过瞬时转染报告基因法 ,测定内源、外源性p5 3或p5 3转录活性片断的转录能力 (荧光素酶活性 ) ;Western blot法测定细胞内p5 3及其靶蛋白p2 1waf1 的表达水平。结果 :抑制蛋白酶体水解过程 ,细胞内源、外源性p5 3及p5 3转录活性片断的转录能力均降低 ;泛素化途径缺失时 ,p5 3转录能力被显著抑制 ,虽然细胞内p5 3蛋白堆积 ,但其下游靶蛋白p2 1waf1 的表达却无增加。结论 :p5 3泛素蛋白酶体水解途径与其转录激活过程存在功能性联系     

2,3-吲哚醌诱导成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡过程中部分凋亡调控基因的变化

目的:研究2 ,3-吲哚醌(2, 3-dioxoindoline, isatin,ISA)诱导人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的分子机制.方法:体外培养人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞,将SH-SY5Y细胞随机分为对照组和ISA不同浓度(100、200和400 μmol/L )处理组,采用Hoechst 33258荧光染色、DNA ladder分析细胞凋亡,RT-PCR检测不同浓度ISA处理后基因VEGF、bcl-2、 bax、survivin及p53在mRNA水平上表达的变化,FCM法检测caspase-3蛋白表达的变化.结果:不同浓度的ISA(0、100、200和400 μmol/L)作用SH-SY5Y细胞48 h后,在荧光显微镜下观察到400 μmol/L ISA组细胞出现典型的凋亡形态学改变:细胞核染色质聚集、碎裂,细胞质浓缩;琼脂糖凝胶电泳显示400 μmol/L ISA处理组细胞出现明显的梯状条带.RT-PCR结果显示:随着ISA作用浓度的增加,bcl-2、VEGF和survivin mRNA的表达均逐渐减少(P<0.05),bax mRNA表达水平未见明显变化(P>0.05) ;而随着ISA浓度的增加, p53 mRNA表达水平逐渐增加(P<0.05),并呈浓度依赖关系.FCM结果显示,随着ISA作用浓度的增加,活化的caspase-3蛋白表达率分别为18.38%、26.93%和35.66%,明显高于对照组的11.23%(P<0.05).结论:ISA能明显诱导SH-SY5Y细胞凋亡,其机制可能与ISA促进p53 mRNA转录、抑制bcl-2和survivin mRNA转录以及使细胞内活化的caspase-3蛋白水平增加有关.另外,ISA能抑制VEGF mRNA转录,对抑制肿瘤生长及转移有重要意义.     

Adhesion induces matrix metalloproteinase-9 gene expression in ovarian cancer cells

The processes of cell invasion includes adhesion, proteolysis of extracellular matrix (ECM) and migration. It is not only related to cancer cells metastasis, but also involved in infiltration of immune effector cells,embryogenesis and angiogenesis. During the invasioncells attach and spread on the ECM, secrete proteinase to hydrolyze ECM, and then move through interstitial stroma. Matrix metalloproteinases (MMP), especially MMP-2 and MMP-9, play an important role in this processe[1,2].…     

LPA2和LPA3对卵巢癌细胞系MMP-2和MMP-9释放与活化调控的研究

目的:将溶血磷脂酸受体(LPA2、LPA3)基因转染卵巢癌细胞系SKOV3和3AO,探讨稳定表达LPA2和LPA3对细胞MMP-2和MMP-9活性的影响。方法:将pcDNA3.1flag-LPA2及pcDNA3.1flag-LPA3用脂质体介导转染SKOV3和3AO细胞,蛋白质印迹法鉴定细胞LPA2和LPA3蛋白表达。明胶酶谱法检测稳定表达LPA2和LPA3对卵巢癌细胞MMP-2和MMP-9表达及活性的影响。结果:LPA2和LPA3稳定转入SKOV3和3AO细胞,蛋白质印迹法分析结果证实,细胞内有LPA2和LPA3蛋白高表达。明胶酶谱分析结果显示,稳定表达LPA2和LPA3的基因可诱导SKOV3和3AO细胞MMP-2和MMP-9活性增加,与对照组及空载体组相比较,差异有统计学意义,P<0.05。结论:稳定表达LPA2和LPA3可诱导卵巢癌细胞MMPs活化,提示LPA2和LPA3在LPA诱导卵巢上皮性癌细胞MMPs侵袭和转移中可能发挥主要作用。     

Increased AP-1 activity in drug resistant human breast cancer MCF-7 cells

The expression, DNA binding, and transactivating activity of activator protein 1 (AP-1) was examined in a series of multidrug resistant (MDR) MCF-7 human breast cancer cells that have increasing levels of MDR1 gene expression. We observed an increase in the amount of both c-jun and c-fos mRNA in cells with 12-, 65-, or 200-fold higher resistance to adriamycin when compared to drug-sensitive MCF-7 wild type (WT) cells. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) demonstrated an increase in the DNA binding activity of an AP-1 complex in nuclear extracts from MDR MCF-7 cells when compared to extracts from WT cells. We observed a proportional increase in luciferase expression from a reporter vector containing consensus AP-1 binding sites in transiently transfected MDR cells when compared to WT cells, indicating that AP-1 mediated gene expression is increased in drug-resistant MCF-7 cells. Since the MDR1 promoter contains a putative AP-1 binding site, we used EMSA to examine AP-1 binding activity to an oligonucleotide probe that contained the relevant MDR1 promoter sequences (–123 to –108). Nuclear extracts from resistant MCF-7 cells displayed an increased level of DNA binding of Jun/Jun dimers to the probe, indicating that AP-1 was capable of binding to this promoter site. A luciferase reporter construct containing triplicate copies of the MDR1 promoter sequence was expressed at higher levels in transiently transfected MDR cells when compared to expression in WT cells. Co-transfection of WT cells with a c-jun expression vector and either of the AP-1 luciferase constructs demonstrated that c-jun could activate gene expression from both the consensus and the MDR1 AP-1 sites in a dose dependent manner. In addition, RT-PCR and western blot analysis showed that levels of MDR1 mRNA and Pgp were increased in c-jun transfected WT cells. Taken together, these data indicate that increased AP-1 activity may be an important mediator of MDR by regulating the expression of MDR1.