琼玉膏对衰老大鼠作用的差异蛋白分析

目的研究琼玉膏对衰老大鼠产生调节作用的相关蛋白质,在分子水平上探索琼玉膏的作用机制。方法将42只6月龄SD雄性大鼠随机平均分为3组,分别标记为琼玉膏组、空白组和模型组。给药结束后,取三组大鼠下丘脑全蛋白,运用同位素相对标记与绝对定量(i TRAQ)技术,分离、分析、鉴定大鼠下丘脑差异蛋白质。结果成功建立衰老大鼠模型,分析比较三组大鼠下丘脑蛋白质,发现14种显著差异蛋白质。结论 14种显著差异蛋白分别为,细胞色素C氧化酶多肽VIc-2、中性神经酰胺酶、植烷酸-辅酶A羟化酶相互作用类蛋白、尼克酰胺磷酸核糖转移酶、尾锚定蛋白插入受体WRB、O-甘露糖β-1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶、信号转导子和转录激活子5b、脂酰Co A合成酶、特定微管伴侣蛋白E、3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶1、双特异性作用蛋白激酶7、RAS脒基释放蛋白2、SHC转运蛋白和泛酸酯激酶4,琼玉膏对这些蛋白均起到下调的作用,该研究为琼玉膏延缓衰老作用的靶蛋白研究奠定基础。     

琼玉膏延缓衰老作用的候选靶蛋白分析

采用iTRAQ技术研究琼玉膏干预衰老大鼠模型的下丘脑蛋白,寻找候选靶蛋白,探索琼玉膏延缓衰老的作用机制。结果表明,琼玉膏可以提高大鼠血清GSH-Px及肝脏SOD活力。iTRAQ技术鉴定到的总蛋白为3 522个,FDR1%。通过数据分析,鉴定出琼玉膏组与模型组比较,具有295种差异蛋白;模型组与空白组比较,具有20种差异蛋白;其中与空白组相比,模型组中下调而琼玉膏组中上调的蛋白有14种。在琼玉膏组和模型组的295种差异蛋白中,差异倍数≥1.30的差异蛋白有40种,最高为1.47。查阅文献及基因功能检索,筛选出琼玉膏延缓衰老的候选靶蛋白12种:ST18,Ptprc,PSMB8,INPP4B,Shc3,Pik3r1,PIP5K1C,Nampt,Rasgrp2,Asah2,Pdpk1,Map2k7。Western blot法检测下丘脑炎症通路NF-κB蛋白,模型组(0.96)相对空白组(0.85)表达量升高;而琼玉膏组(0.89)相对模型组则下降。Q-PCR检测PIP5K1C,Ptprc等与炎症相关的候选靶蛋白,与空白组相比,模型组中mRNA相对表达量显著下降(P0.01),而琼玉膏组中则显著升高(P0.01),与蛋白质组学数据分析一致。琼玉膏可能通过调节下丘脑炎性反应而延缓衰老的发生。     

琼玉膏抗衰老与下丘脑nf-kb炎症通路及GnRH1关系的相关性研究

目的探索琼玉膏抗衰老以及下丘脑nf-kb炎症通路的激活与GnRH1基因甲基化相关性的可能分子机制。方法(1)观察比较6只24月龄自然衰老SD大鼠和6只2月龄青年SD大鼠下丘脑衰老相关蛋白及其基因mRNA的表达水平:Western Blot检测GnRH1、Sirt1、DNMT1、DNMT3a的蛋白表达水平;Real-Time PCR检测GnRH1、Sirt1、DNMT1、DNMT3a基因mRNA的表达水平;使用SPSS19.0统计软件做统计学分析。MSP法检测老年鼠和青年鼠GnRH1基因甲基化情况。(2)通过分离新生SD大鼠下丘脑神经元干细胞,建立D-半乳糖诱导的下丘脑神经元干细胞衰老模型,比较正常神经元干细胞组、D-半乳糖衰老组以及不同浓度琼玉膏干预组之间炎性因子及NF-κB表达的差异。结果 (1)GnRH1、Sirt1、DNMT1的蛋白及其基因mRNA表达水平在老年鼠中明显降低,与青年鼠比较有显著性差异(P0.05);DNMT3a的蛋白及基因mRNA表达水平在老年鼠中无明显变化,与青年鼠比较无显著性差异(P0.05);老年鼠中GnRH1基因出现部分甲基化,青年鼠中GnRH1基因未发生甲基化。(2)D-半乳糖诱导建立的神经元干细胞衰老模型呈现炎性指标高表达以及NF-κB信号通路激活;琼玉膏可抑制炎性因子、nuclear P65的表达水平以及NF-κB的转录活性;并且,随着琼玉膏浓度从45μg/ml增加到90μg/ml,其提前干预D-半乳糖诱导的神经元干细胞衰老的作用也相应增强。结论琼玉膏抗衰老的可能分子机制在于降低下丘脑神经元干细胞炎性因子表达和NF-κB转录活性,进而能够逆转衰老进程中GnRH1基因甲基化及其表达水平下降。     

甲状腺功能亢进肝阳上亢证大鼠下丘脑组织蛋白质差异表达的观察

目的利用蛋白质组学方法,观察甲状腺功能亢进(简称"甲亢")肝阳上亢证大鼠与正常大鼠下丘脑组织的双向凝胶蛋白图谱,寻找差异表达的蛋白质。方法左甲状腺素钠(L-T4)和附子汤灌胃造成甲亢肝阳上亢证模型,应用蛋白质组学技术比较模型组与正常组中下丘脑的差异蛋白质,结合生物信息学对其进行分析鉴定。结果两组蛋白斑点总体分布相似,主要分布在等电点pI 3～8,分子量Mr 14.4～75kD;分析发现,模型组与正常组相比有18个蛋白质上调和24个蛋白质下调,进一步质谱鉴定,其中7个蛋白质分别为NSFL1辅助因子、硫氧还蛋白、泛素羧基末端水解酶同工酶L1、血小板活化因子乙酰基水解酶IB—γ亚单位、谷氨酸脱氢酶前体、二氢嘧啶酶相关蛋白2和微管蛋白。结论模型组与正常组相比,有18个蛋白质点上调,有24个蛋白质点下调,经质谱鉴定了其中部分蛋白质.蛋白质的变化可能与甲亢肝阳上亢证的形成密切相关。     

基于蛋白质组学方法研究左归丸治疗去卵巢所致骨质疏松症大鼠的作用机制

目的基于蛋白质组学方法研究左归丸治疗去卵巢所致骨质疏松症大鼠的作用机制,进而为阐明"肾主骨"理论的科学内涵寻找实验依据。方法将60只雌性Wistar大鼠随机分为2组,正常对照组20只和造模组40只。造模组大鼠通过摘除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松症(PMOP)模型,正常对照组大鼠只摘取卵巢周围的少许脂肪组织。手术2周后,再将40只造模组大鼠随机分为模型组及左归丸组,各20只。左归丸组予左归丸水煎剂灌胃,正常对照组及模型组予等容积蒸馏水灌胃。给药3个月后,比较3组大鼠胫骨骨小梁体积百分比(TBV%)水平,取大鼠双侧股骨骨髓进行蛋白质双向电泳并对电泳图谱进行分析,筛选出左归丸干预的相关蛋白,并进行质谱分析鉴定。结果模型组、左归丸组大鼠胫骨TBV%水平低于正常对照组(P0.05),左归丸组大鼠胫骨TBV%水平高于模型组(P0.05)。3组大鼠共筛选出23个差异蛋白质点,其中12个蛋白质点由于蛋白质分数不具有统计学意义而未得到鉴定,11个蛋白质点得到鉴定。检索数据库显示10号差异蛋白质点alpha-enolase为α-烯醇化酶,其免疫组化法检测显示模型组α-烯醇化酶阳性表达密度高于正常对照组(P0.05),而左归丸组α-烯醇化酶阳性表达密度低于模型组(P0.05),这与双向凝胶电泳图谱分析和质谱鉴定结果相一致。结论左归丸可能通过调节骨髓内与细胞增殖、分化、代谢、凋亡及氧化反应等相关蛋白质来实现对PMOP的防治作用,这些差异蛋白质可能与PMOP的发生发展具有一定的相关性。     

蛋白质组学技术分析缺血性脑卒中火毒证大鼠脑能量代谢相关蛋白

目的采用蛋白质组学技术鉴定缺血性脑卒中火毒证大鼠脑缺血半暗带皮层组织能量代谢相关蛋白,探讨其与缺血性脑卒中的关系。方法提取模型大鼠脑缺血半暗带皮层组织蛋白质及假手术大鼠脑组织相应部位蛋白,分别采用双向凝胶电泳分离,切取差异蛋白点进行ABI 5800串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF)鉴定。结果双向凝胶电泳技术结合MALDI-TOF/TOF成功鉴定出21种能量代谢相关蛋白。结论建立了缺血性脑卒中火毒证大鼠脑缺血半暗带皮层组织蛋白质的鉴定方法,发现了21种可能与缺血性脑卒中火毒证相关的能量代谢相关蛋白,为脑卒中药物开发提供可能的靶点。     

益胃汤对初老雌性大鼠下丘脑作用的差异蛋白分析

[目的]研究益胃汤对初老雌性大鼠下丘脑产生调节作用的相关蛋白质,在分子水平上探索益胃汤的作用机制。[方法]将20只4～6月龄雌性大鼠随机分成正常组、去势组,每组10只,10只10～12月龄雌性大鼠作为初老组。给药结束后,取3组大鼠下丘脑组织,运用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)分离、分析、鉴定大鼠下丘脑差异蛋白。[结果]分析比较初老组、去势组、正常组3组大鼠下丘脑蛋白质,通过多组数据韦恩图分析发现初老组与去势组有17种共同表达的差异蛋白。通过火山图(Volcano Plot)过滤,确定显著差异蛋白[差异倍数(FC)1.5或2/3,P0.05];筛选出了7种与衰老相关的显著差异蛋白及其相关KEGG通路,它们分别为:plasminogen、α-crystallin B chain、Hsp70 binding protein 1、serum transferrin、unconventional myosin-Id、myelin oligodendrocyte glycoprotein、protein Fbxo44。[结论]益胃汤对这7种显著差异蛋白起到上调或下调的作用,为研究益胃汤延缓衰老作用的靶蛋白奠定了基础。     

正常及脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠脾组织蛋白组学差异分析

目的 通过比较正常及脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠脾组织蛋白质谱,筛选和鉴定与单纯性肥胖大鼠脾虚湿阻证有关的疾病特异性蛋白,探寻单纯性肥胖大鼠脾虚湿阻证生物标志物。方法 选取SD大鼠40只随机分为对照组10只、单纯性肥胖大鼠组30只。造模采用高脂饲料喂养,造模成功后无菌摘除脾脏,取出脾组织10 mg/只,进行酶切、双向凝胶电泳分析,质谱鉴定蛋白质,分析差异蛋白质意义。结果 通过比较正常及脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠脾组织差异蛋白质,发现3个有意义的差异蛋白质:巨噬细胞中穹窿主体蛋白(Major Vault Protein,MVP)、蛋白质二硫化物异构酶A3前体(PDIA3)、60-kDa热休克蛋白(HSP60,也称为HSPD1)。结论 正常及脾虚湿阻型单纯性肥胖大鼠脾组织蛋白质存在差异表达。这些差异蛋白质可能是与脾虚湿阻证相关的疾病特异性蛋白,并有可能成为诊断脾虚湿阻证的分子标志物。     

四君子汤对慢性心衰大鼠心肌组织蛋白质组学影响的研究

目的:探讨四君子汤对慢性心衰大鼠心肌组织蛋白质表达变化的影响。方法:SD雄性大鼠42只,随机取6只作为正常组,其余36只复制慢性心力衰竭大鼠模型,造模成功后,分为四君子汤高、低剂量组(11.88,2.97 g·kg~(-1)·d~(-1)),卡托普利组(100 mg·kg~(-1)·d~(-1)),正常组和模型组分别给予相同体积生理盐水,连续灌胃给药1月。分别留取各组左心室组织,双向凝胶电泳分离心肌蛋白,分析差异显示的蛋白,并对有显著差异的蛋白点进行胶内酶切和质谱鉴定。结果:与模型组比较,四君子汤组有31种蛋白质表达上调,28种蛋白质表达下调,各选取8个差异显著(Volume值相差≥1.5倍)的蛋白进行质谱鉴定,通过整合去重,鉴定出4个蛋白:与能量代谢相关的Suclg2蛋白、丙酮酸脱氢酶复合体;与心肌细胞收缩功能相关的肌球蛋白轻链2;与心肌细胞重构相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N。结论:四君子汤可调节慢性心衰大鼠心肌组织多种蛋白表达,可能通过调节能量代谢、减少心肌重构、提高收缩功能而改善心功能。     

应用蛋白质组学技术研究琼玉膏抗衰老的作用机制

琼玉膏为古代养生名方,抗衰老作用已应用于临床近千年,但其作用机制未明,困扰其开发利用.笔者根据中医肾藏精主骨生髓的理论,以下丘脑为研究对象,应用现代蛋白质组和生物信息学等技术,获得候选靶蛋白,通过基因沉默等分子生物学技术确定靶蛋白,以期阐明琼玉膏延缓衰老的关键机制,为将来更好地开发利用提供科研思路和方法.