AML1-ETO阳性急性髓系白血病患者c-kit突变及其临床意义

本研究探讨AML1-ETO融合基因阳性急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者c-kit突变的发生情况及其临床意义。采用PCR和直接测序法检测31例AML1-ETO阳性AML患者c-kit基因17外显子突变的发生情况,并分析c-kit基因突变与患者的临床、实验室特征以及疗效的关系。结果表明:31例患者中14例检测到c-kit突变,突变率为45.16%,突变组男性患者的比例为71.43%、初诊时白细胞计数>10×109/L患者的比例为78.57%和伴有髓外浸润患者的比例为21.43%,均明显高于无突变组(29.41%、41.18%、0%,P=0.020,0.036,0.045),两组患者的年龄和骨髓原始细胞比例无明显差异(P=0.437和0.510)。c-kit突变和无突变组化疗完全缓解(CR)率(64.29%∶80%)和复发率(58.33%∶21.43%)的差异无统计学意义(P=0.344和0.054),而死亡率(57.14%)在c-kit突变组明显高于无突变组(20%,P=0.039)。结论:AML1-ETO阳性AML患者c-kit突变常见,突变患者预后差,常规检测c-kit突变对患者的危险度分层、预后评估和选择有效治疗方案有重要意义。     

实时荧光定量PCR快速检测BCR-ABL融合基因激酶区M244V突变方法的建立

本研究建立一种敏感性好、特异性高的BCR-ABL融合基因M244V突变的检测方法。设计突变点特异性引物,优化实时荧光定量PCR反应体系和条件,建立检测BCR-ABL融合基因M244V点突变的定量PCR方法。结果表明,成功构建了M244V突变及野生的重组质粒标准品和M244V点突变的实时荧光定量PCR方法;验证结果表明该法具有较好敏感性、特异性和准确性。结论：BCR-ABL融合基因M244V突变的实时荧光定量PCR检测方法可用于临床CML患者M244V突变的检查。     

内参基因β-actin质粒标准品的构建

为构建检测内参基因β-actin mRNA表达水平差异的标准品,以成人外周血细胞的总RNA为模板、Random 6 mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人β-actin基因相应的cDNA片段,构建PMD-18-β-actin重组质粒,鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线。结果外周血提取的总RNA完整性良好,构建的β-actin质粒经PCR扩增后得到一186bp的清晰条带,测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为2.39×1013 copies/mL,倍比稀释至2.0×104copies/mL均能得到良好的标准曲线(R2=1),提示构建β-actin基因荧光定量PCR标准质粒成功。     

采用荧光定量PCR检测JAK2基因V617F突变

目的 建立荧光定量PCR检测JAK2基因V617F突变的方法,评估JAK2 V617F突变在诊断骨髓增殖性疾病和白血病中的临床意义.方法 选取71例慢性粒细胞性白血病(CML)、22例原发性血小板增多症(ET)、11例原发性骨髓纤维化(PMF)、9例真性红细胞增多症(PV)、7例嗜酸粒细胞增多症患者,分别采用荧光定量PCR、突变特异性扩增系统(ARMS)对JAK2 V617F突变进行检测,并采用基因测序对结果进行验证.将具有JAK2 V617F纯合子突变的人类红白血病细胞株(HEL)DNA作为阳性对照,比较荧光定量PCR和ARMS对JAK2基因V617F突变的检测敏感度.结果 采用荧光定量PCR检测,野生型的熔解温度(Tm)峰出现于(75.0±0.2)℃处,突变型的Tm峰出现于(76.6±0.2)℃处.JAK2基因V617F突变在PV、ET、PMF等骨髓增殖性疾病中的检出率分别为8例(88.9%)、12例(54.5%)、7例(63.6%),但在71例CML中只检出1例(1.4%).荧光定量PCR与ARMS的结果符合率为100%,结果经过测序证实.使用荧光定量PER法可在每106个正常自细胞中检出低至102个HEL细胞,而使用ARMS方法时要在每106个正常白细胞中HEL细胞达到104个时,方可检测出,前者比后者方法灵敏100倍.结论 成功地建立了荧光定量PCR检测JAK2基因V617F突变的方法,比ARMS更灵敏、简便,适合临床使用.JAK2基因V617F突变在骨髓增殖性疾病中有较高的检出率,可作为骨髓增殖性疾病特异性诊断指标.     

凝血因子V基因Leiden突变和早产儿脑室内出血的关系研究

目的研究凝血因子V基因Leiden突变和早产儿脑室内出血的关系。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态分析的方法，对54例脑室内出血的早产儿及57例无脑室内出血的早产儿进行等位基因检测，并进行对比分析。结果54例脑室内出血组中有6例为基因Leiden突变杂合子（11％）．而无脑室内出血的早产儿中的57例中只有1例为基因laden突变杂合子（1．8％），两组之间差异显著．χ^2=4．11，P〈0．05。结论凝血因子V基因Leiden突变携带者患脑室内出血的早产儿风险高于无脑室内出血的早产儿组。     

C1009del突变质粒载体的构建及MYOC基因的有效干扰

目的 在前续课题基础上构建针对MYOC基因的RNAi慢病毒载体及C1009del突变质粒载体,并筛选出小梁网细胞作为后续转染阳性质粒合适的药物G418浓度,为下一步将突变质粒载体导入小梁网细胞使其表达突变蛋白,研究突变蛋白的功能、分泌特点等,进而研究原发性开角型青光眼的致病机制提供技术支持.方法 采用基因定向克隆方法 ...     

TCRγV1/pcDNA3重组质粒的构建

目的：构建含TCRγV1重排基因的真核表达质粒.方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA,用RT-PCR法扩增含BamHⅠ与HindⅢ酶切位点TCRγV1基因序列,对pcDNA3载体及TCRγV1基因PCR产物经双酶切,用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌DH5a,对重组质粒经序列测定,称pcDNA3/TCRγV1.结果：电泳获得333bp的TCRγV1预期条带.结论：该条带测序证实为TCRγV1基因序列.     

实时荧光定量PCR测定TRAIL mRNA质粒标准品的构建

目的 构建pGEM-T-TRAIL重组质粒标准品为临床检测TRAIL mRNA水平奠定基础.方法 在TRAIL基因第二和第三外显子区设计特异性引物和荧光探针,提取血清HBV DNA阳性乙肝患者的外周血单个核细胞总RNA,逆转录合成cDNA,扩增目的 片断,纯化PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,转化感受态菌DH - 5α,经蓝白斑筛选,PCR鉴定阳性克隆,并进一步测序分析.提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立TRAIL质粒标准品.结果 扩增目的 片段长度为110 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库TRAIL序列性一致.结论 成功构建了实时荧光定量PCR 测定TRAIL mRNA质粒标准品.     

清道夫受体SR-AII基因定点突变的研究

目的　利用聚合酶链反应( PCR)技术对清道夫受体SR-AII基因进行定点突变的研究。方法　利用PCR定点突变技术, 首先设计两对包含预定突变位点的引物, 通过3轮PCR法扩增出含有所需突变位点的片段, 通过酶切连接方法将突变点引入到pEGFP-C1-SR-AII中, 随后用TRANSfection转染试剂介导转染293T细胞。结果　在真核表达载体pEGFP-SR-AII基础上获得了SR-AII cDNA A1201G和A1202C的突变体, 测序结果表明在序列中发生了预期的突变。结论　SR-AII定点突变体的构建为进一步的功能研究奠定了基础。     

白血病c-kit基因突变及其检测方法的研究进展

C-KIT是酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一,其作为干细胞因子的受体,可以通过一系列信号通路参与造血干细胞增殖分化的调控。近年来研究发现,c-kit基因存在突变,特别是激活性突变与急性白血病中的发病、治疗和预后等密切相关。本文就c-kit基因结构和功能,在白血病中热点突变方式,以及其突变的检测方法做一综述。     

高分辨率熔解曲线法检测JAK2基因V617F突变及其应用

摘要:目的：探讨实时定量PCR方法和高分辨率熔解曲线法（HRM）在检测JAK2基因V617F突变中的应用。 方法：以JAK2基因V617F发生纯合突变的人红白血病细胞株（HEL）及不含JAK2基因V617F突变的人白血病细胞株（HL60）为阳性对照和阴性对照,优化HRM法检测条件,分别以优化的HRM法和直接测序法对63例临床疑似骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者DNA标本进行JAK2基因V617F突变检测,评价2种检测方法结果的一致性。 结果：HRM法可检出系列混合样本中5%的突变型等位基因突变,且重复性较高。以测序法为金标准,HRM法的敏感性和特异性均为100％,两种方法结果一致。 结论：HRM法能够在单一闭管体系中实现对JAK2基因V617F突变的检测,具有较高的敏感性和特异性,可用于JAK2基因V617F突变的临床检测。     

Evaluation of a highly specific functional test for the detection of factor V Leiden

In the present study, a new functional test for the detection of increased resistance of coagulation factor V to degradation by activated protein C (factor V Leiden mutation) was evaluated. The STA-STACLOT APC-R Test (Diagnostica Stago, Asnieres, France) is based on the specific activation of factor X by Crotalus viridis helleri snake venom. The results are given as clotting time in seconds of the patient's plasma in the presence of venom and activated protein C. The intra-assay coefficient of variation was 2.17% (n=20) for samples within the normal range, and 1.70% and 1.42% (n=20) for the plasma of a heterozygous or a homozygous carrier of the factor V Leiden mutation, respectively. The inter-assay coefficient of variation (n=10) was 7.75% for the plasma of a healthy donor, 5.05% for the plasma of a heterozygous carrier and 3.38% for the plasma of a homozygous individual. The normal range (5th-95th percentile) of 136.4 s-174.7 s was derived from the clotting time of the plasma of 38 healthy controls. Values below 136 s were found in every sample from patients carrying the factor V Leiden mutation (n=52), whereas no patient with protein C (n=11) or protein S deficiency (n=10) had reduced clotting times. Homozygous carriers of the factor V Leiden mutation had clotting times shorter than 66.0 s and heterozygous carriers had clotting times longer than 80.0 s. Thus, based upon the individual clotting time, patients homozygous for factor V Leiden mutation could easily be distinguished from normals or heterozygous individuals. The influence of coagulation factor X, V, or II deficiency on the STACLOT APC-R Test was evaluated and revealed prolonged clotting times at factor V activities below 50%. In the presence of lupus anticoagulant the specificity of the STA-STACLOT APC-R Test was clearly decreased. In the present study, we clearly show that the STA-STACLOT APC-R Test is able to discriminate carriers of the factor V Leiden mutation from healthy controls or patients with protein C or protein S deficiency.     

Evolving methods for single nucleotide polymorphism detection: Factor V Leiden mutation detection

Background: The many techniques used to diagnose the Factor V Leiden (FVL) mutation, the most common hereditary hypercoagulation disorder in Eurasians, and the most frequently requested genetic test reflect the evolving strategies in protein and DNA diagnosis. Methods: Here, molecular methods to diagnose the FVL mutation are discussed. Results: Protein‐based detection assays include the conventional functional activated protein C resistance coagulation test and the recently reported antibody‐mediated sensor detection; and DNA‐based assays include approaches that use electrophoretic fractionation e.g., restriction fragment length polymorphism, denaturing gradient gel electrophoresis, and single‐stranded conformational PCR analysis, DNA hybridization (e.g., microarrays), DNA polymerase‐based assays, e.g., extension reactions, fluorescence polarization template‐directed dye‐terminator incorporation, PCR assays (e.g., amplification‐refractory mutation system, melting curve analysis using real‐time quantitative PCR, and helicase‐dependent amplification), DNA sequencing (e.g., direct sequencing, pyrosequencing), cleavase‐based Invader assay and ligase‐based assays (e.g., oligonucleotide ligation assay and ligase‐mediated rolling circle amplification). Conclusion: The method chosen by a laboratory to diagnose FVL not only depends on the available technical expertise and equipment, but also the type, variety, and extent of other genetic disorders being diagnosed. J. Clin. Lab. Anal. 25:259–288, 2011. © 2011 Wiley‐Liss, Inc.     

AS-PCR检测慢性骨髓增殖性疾病JAK2 V617点突变及临床意义

目的等位基因特异性聚合酶链反应(alleles specific polymerase chain reaction,AS-PCR)检测慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)中JAK2基因V617F点突变情况并应用于临床诊治。方法AS-PCR检测74例CMPD的患者骨髓或外周血白细胞JAK2V617F点突变。其中真性红细胞增多症(PV)20例、原发性血小板增多症(ET)52例、原发性骨髓纤维化(CIMF)2例。随机抽取其中20例基因测序验证。结果JAK2 V617F阳性率分别为:PV中19/20(95.0%),ET25/52(48.1%),CIMF为2/2(100%)。结论AS-PCR法检测JAK2 V617F敏感性和准确性较高,检测阳性率与国外报道相似;该方法简单易行,适合临床应用于CMPD的诊断分类治疗。     

毛细管电泳联合激光诱导荧光技术检测结直肠癌hMLH1基因突变

目的　建立毛细管电泳 (CE)联合激光诱导荧光检测 (LIF)技术 ,分析单链构象多态性 (SSCP) ,检测人结直肠癌hMLH1基因点突变的方法。方法　PCR扩增 4 2例散发性结直肠癌患者与 2 0例健康志愿者外周血基因组DNAhMLH1基因 12外显子 ,采用CE LIF进行SSCP分析 ,对异常片段进行测序鉴定 ;研究不同筛分介质 (线性聚丙烯酰胺LPA)浓度、分离温度与分离电压对CE行为的影响。结果　 4 2例患者中有 4例 (9.5 2 % )突变 ,CE测序证实为T115 1A的杂合子点突变 ;2 0例健康志愿者未发现突变。较高浓度的LPA(4 %～ 6 % ) ,2 0℃分离温度与 9kV分离电压有助于单链DNA峰分离。结论　调整适宜的LPA浓度、分离温度与分离电压可提高CE分析SSCP的效率 ,应用CE LIF技术SSCP分析检测hMLH1基因点突变快速、高效、重复性好 ,适合临床大样本筛查     

荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因重排标准品质粒及标准曲线的构建

目的：构建荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因标准品重组质粒和标准曲线，为建立实时荧光定量PCR准确检测淋巴系肿瘤微小残留病奠定基础。方法：对TCR VγI-Jγ基因进行序列分析，利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针。提取急性淋巴细胞白血病患者的DNA，经PCR扩增，产物纯化后与pMD 18-T Vector连接，转化到大肠杆菌DH5α，筛选得到标准品的质粒。结果：重组质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长，表明TCR VγI-Jγ基因已成功克隆。以10^0～10^-5不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增，Ct值分别为21．08、24．34、27．53、30．58和33．25。统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系，回归系数为0．998。结论：所构建的TCR VγI-Jγ基因荧光定量PCR检测标准品特异性和线性关系好，准确可靠，利于统一标准。