shRNA-FAM-38A基因对宫颈癌CS1213细胞增殖和迁移的影响

目的探讨shRNA-FAM-38A基因在宫颈癌CS1213细胞增殖和迁移中的作用。方法宫颈癌CS1213细胞分为空白对照组、阴性对照组和实验组。空白对照组细胞不转染慢病毒载体,阴性对照组细胞转染无序序列慢病毒载体,实验组细胞转染沉默shRNA FAM-38A慢病毒载体。采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞FAM-38A、caspase-3和caspase-9 mRNA相对表达量,采用Transwell小室实验检测3组CS1213细胞迁移细胞数,采用CCK-8实验检测3组细胞增殖率。结果实验组细胞FAM-38A mRNA相对表达量(0.32±0.07)、迁移细胞数[(44.38±5.32)个]、细胞增殖率[(47.54±7.63)%]低于空白对照组[0.95±0.13、(99.72±19.63)个、(144.63±21.75)%]和阴性对照组[1.14±0.23、(119.63±21.87)个、(145.62±11.97)%](P0.05),caspase-3、caspase-9 mRNA相对表达量(5.11±1.21、12.64±2.87)高于空白对照组(0.84±0.09、0.22±0.03)和阴性对照组(0.89±0.12、0.21±0.04)(P0.05),空白对照组FAM-38A、caspase-3、caspase-9 mRNA相对表达量及迁移细胞数、细胞增殖率与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 shRNA-FAM-38A基因可抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力,可作为宫颈癌的潜在治疗靶点。     

DLC-3表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

目的探讨外源性过表达DLC-3对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移及凋亡活动的影响。方法对数生长期乳腺癌MCF-7细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组细胞转染DLC-3基因过表达质粒,阴性对照组细胞转染空白质粒,空白对照组细胞仅进行换液处理。3组采用实时PCR法检测细胞DLC-3 mRNA相对表达量;转染12、24 h后,采用细胞划痕实验检测细胞划痕愈合率;转染48 h后,采用CCK-8实验检测细胞增殖率,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果实验组DLC-3 mRNA相对表达量(17 563.57±2 880.85)高于空白对照组(0.56±0.43)和阴性对照组(1.00±0.00)(P0.05),空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染48 h后,实验组细胞增殖率[(31.47±5.57)%]低于阴性对照组[(36.27±3.71)%]和空白对照组[(37.90±5.70)%],但差异无统计学意义(P0.05);转染12、24 h后,实验组划痕愈合率[(32.769±4.349)%、(38.237±4.286)%]低于空白对照组[(37.506±1.836)%、(49.052±4.090)%](P0.05),阴性对照组[(35.659±3.970)%、(48.724±5.092)%]与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染48 h后,实验组细胞凋亡率[(15.893±1.597)%]高于阴性对照组[(10.277±1.947)%]和空白对照组[(11.973±1.564)%](P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论提高MCF-7细胞中DLC-3表达可降低细胞增殖水平,抑制其迁移能力,并促进细胞凋亡。     

沉默p21活化激酶1表达对人黑素瘤A375细胞凋亡及侵袭能力的影响

目的探讨shRNA沉默p21活化激酶1(p21-activated kinase 1, PAK1)基因表达对人黑素瘤A375细胞凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法对数生长期人黑素瘤A375细胞随机分为转染组(转染PAK1特异性shRNA)、阴性对照组(转染NC-shRNA)、空白对照组(不进行转染)。转染后培养72 h,采用实时荧光定量PCR法检测A375细胞PAK1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测A375细胞PAK1及p-PAK1蛋白相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果转染后培养72 h,转染组PAK1 mRNA相对表达量(0.45±0.07)、PAK1蛋白相对表达量(0.53±0.01)、p-PAK1蛋白相对表达量(0.21±0.03)均低于阴性对照组(0.98±0.04、0.65±0.02、0.38±0.04)、空白对照组(1.00±0.08、0.67±0.51、0.36±0.02)(P0.05),细胞凋亡率[(11.20±0.21)%]高于阴性对照组[(5.86±0.51)%]、空白对照组[(5.43±0.03)%](P0.05),迁移细胞数[(47.00±2.23)个]、侵袭细胞数[(30.00±4.44)个]较阴性对照组[(76.00±4.85)、(54.00±3.67)个]、空白对照组[(77.90±4.97)、(56.00±4.12)个]少(P0.05),阴性对照组上述各指标与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论沉默PAK1基因表达可促进人黑素瘤A375细胞凋亡,降低其迁移及侵袭能力。     

靶向干扰DNMT1基因慢病毒载体构建及其对结肠癌SW620细胞株生物学行为的影响

目的构建干扰DNMT1基因的慢病毒并感染结肠癌SW620细胞株,观察其对细胞生物学行为的影响。方法合成DNMT1 shRNA寡核苷酸链,与p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP连接构建重组慢病毒质粒,转染HEK293T细胞进行病毒包装。包装后的病毒感染SW620细胞,分为3组:Lentivirus-DNMT1组(LV-DNMT1)、Lentivirus-vector组(LV-vector)、空白对照组(Blank)。采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞DNMT1及T-cadherin表达,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡,Transwell和细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移。结果成功构建了靶向干扰DNMT1的慢病毒载体。与LV-vector组和Blank组比较,LV-DNMT1组DNMT1 mRNA(0.49±0.09)和蛋白(0.39±0.11)表达显著下调(P0.05),而T-cadherin mRNA(0.74±0.12)和蛋白(0.69±0.13)表达显著上调(P0.05)。与LV-vector组和Blank组比较,LV-DNMT1组第12 h、24 h、36 h、48 h、72 h时的OD(570)值降低(P0.05),细胞总凋亡率(26.06%)增加(P0.05),穿膜细胞数目[(21.33±8.02)个]和细胞迁移距离[(303.27±47.58)μm]减少(P0.05)。结论 DNMT1慢病毒载体可有效敲减DNMT1表达和上调T-cadherin表达,抑制SW620细胞增殖,促进其凋亡,降低其侵袭、迁移能力。     

非小细胞肺癌患者血浆miR-451表达及对HCC827细胞生物学性质和放疗敏感性的影响

目的探讨miR-451在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者血浆中的表达及其对NSCLC细胞生物学性质及放疗敏感性的影响。方法 NSCLC患者69例为观察组,同期体检健康者53例为对照组,采用实时荧光定量PCR法检测2组血浆miR-451 mRNA相对表达量。将人NSCLC细胞株HCC827随机分为空白对照组、miR-451组和慢病毒组,空白对照组不作处理,miR-451组和慢病毒组分别转染包含miR-451、无意义核苷酸序列慢病毒;转染24、48、72 h,采用MTT法检测细胞增殖;转染72 h,采用Transwell小室试验检测细胞侵袭,采用划痕试验检测细胞迁移距离。再将3组细胞分为0、3、6、9 Gy 4个亚组,分别接受相应剂量的X线照射,采用MTT法检测细胞增殖和细胞存活。结果观察组血浆miR-451相对表达量(1.72±0.39)低于对照组(2.16±0.31)(P0.05)。miR-451组细胞miR-451相对表达量(4.17±0.82)高于空白对照组(1.32±0.37)和慢病毒组(1.26±0.33)(P0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P0.05);转染24、48、72 h,miR-451组细胞增殖率均低于空白对照组和慢病毒组(P0.05);转染72 h,miR-451组侵袭细胞数[(123.7±26.4)个]较空白对照组[(247.6±39.7)个]和慢病毒组[(254.5±38.2)个]少,细胞迁移距离[(45.2±8.8)μm]较空白对照组[(73.2±11.7)μm]和慢病毒组[(68.9±10.4)μm]近(P0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P0.05);miR-451组细胞在0、3、6、9 Gy剂量X线照射后的细胞增殖率和细胞存活率均低于空白对照组和慢病毒组(P0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 miR-451在NSCLC患者血浆呈低表达;miR-451可抑制HCC827细胞增殖、侵袭与迁移,上调HCC927细胞对放疗的敏感性。     

miR-326靶向MAPK/MEK信号通路抑制食管鳞状细胞癌恶性生物学行为

目的探讨miR-326靶向MAPK/MEK信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 20例食管鳞状细胞癌患者,取手术切除食管癌组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测miR-326mRNA和MAPK mRNA相对表达量,采用免疫组织化学法检测MAPK蛋白表达。3种食管癌细胞系(KYSE150、EC9706、TE-9)和人正常食管上皮细胞系Het-1A,采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-326 mRNA和MAPK mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞MAPK蛋白相对表达量。将对数生长期EC9706细胞随机分为miR-326组、转染对照组和空白对照组,miR-326组和转染对照组分别转染miR-326 mimic和mimic NC,空白对照组细胞不作任何处理,采用Western blot法检测细胞MAPK、p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量,克隆形成试验检测细胞克隆形成率,划痕试验检测细胞划痕闭合率,Transwell小室试验检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。结果食管癌组织miR-326 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P0.05),MAPK mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P0.05)。KYSE150、EC9706和TE-9细胞miR-326 mRNA相对表达量均低于Het-1A细胞(P0.05),MAPK mRNA和MAPK蛋白相对表达量高于Het-1A细胞(P0.05),且EC9706细胞MAPK蛋白相对表达量最高。miR-326组细胞MAPK 3'UTR WT荧光素酶活性(0.53±0.05)明显低于转染对照组(1.22±0.14)(P0.05),MAPK 3'UTR MUT荧光素酶活性(0.86±0.06)与转染对照组(0.91±0.11)比较差异无统计学意义(P0.05)。miR-326组细胞MAPK蛋白相对表达量(0.32±0.15)低于转染对照组(0.88±0.07)和空白对照组(0.91±0.06)(P0.05),细胞克隆形成率[(21.30±0.55)%]、划痕闭合率[(29.47±4.12)%]和侵袭细胞数[(113.86±3.15)个]低于转染对照组[(75.43±0.81)%、(80.52±2.51)%、(427.27±4.25)个]和空白对照组[(79.13±0.65)%、(83.44±1.87)%、(468.10±3.38)个](P0.05),G_0/G_1期细胞比率[(63.15±1.20)%]和细胞凋亡率[(18.54±0.60)%]高于转染对照组[(41.18±0.60)%、(5.28±1.30)%]和空白对照组[(45.11±0.80)%、(4.13±0.90)%],S期和G_2/M期细胞比率及p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量低于转染对照组和空白对照组(P0.05),转染对照组与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 miR-326靶向抑制MAPK/MEK信号通路的激活,影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。     

小干扰RNA沉默DEK基因对肝癌HepG_2细胞凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默DEK基因表达对肝癌细胞株HepG_2凋亡的影响及其相关分子机制。方法常规培养人肝癌细胞株HepG_2,分为空白对照组、对照siRNA组和DEK siRNA组。对照siRNA组和DEK siRNA组在Lipofectamine~(TM) 2000脂质体介导下进行对照siRNA表达载体和DEK siRNA表达载体的转染;空白对照组正常培养,不做任何处理。采用实时PCR法检测3组细胞DEK mRNA表达情况,采用Western blot法检测3组细胞DEK蛋白、caspase-3、B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2protein,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)表达情况,采用流式细胞术观察3组细胞周期和细胞凋亡率。结果转染48h后,DEK siRNA组DEK mRNA(0.420±0.050)和蛋白表达水平(0.311±0.038)及S期细胞比率[(20.713±1.529)%]、G_2/M期细胞比率[(20.030±4.833)%]、Bcl-2蛋白表达水平(0.342±0.061)明显低于空白对照组[0.826±0.052、0.691±0.073、(25.553±2.109)%、(26.560±4.766)%、0.599±0.075]和对照siRNA组[0.776±0.051、0.726±0.061、(24.210±2.463)%、(29.365±4.891)%、0.686±0.079](P0.05),G0/G1期细胞比率[(59.257±4.767)%]、细胞凋亡率[(10.325±0.791)%]、Bax(0.610±0.038)和caspase-3蛋白表达水平(0.716±0.054)高于空白对照组[(47.887±3.753)%、(5.697±0.508)%、0.280±0.059、0.373±0.044]和对照siRNA组[(46.425±3.354)%、(6.547±0.674)%、0.340±0.045、0.321±0.049](P0.05);空白对照组与对照siRNA组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论特异性DEK siRNA可针对性下调HepG_2细胞中DEK基因表达,促进HepG_2细胞凋亡,可能与下调Bcl-2表达、上调caspase-3和Bax表达有关。     

以RNAi慢病毒为载体下调CD59对急性T系白血病Jurkat细胞株的表达影响

目的:分析以RNAi慢病毒为载体下调CD59基因表达对急性T系白血病Jurkat细胞株的表达影响。方法:通过RNAi慢病毒作为载体,诱导急性T系白血病Jurkat细胞株中的CD59表达降低;采用激光共聚焦技术分析RNAi慢病毒转染情况和CD59分子的定位情况;应用实时荧光定量PCR法检测空白对照组、阴性对照组和RNAi慢病毒转染组中CD59 mRNA的相对表达量;用酶联免疫吸附试验法测定3组细胞培养上清中肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和白介素-3(IL-3)的表达,用免疫印迹法(Western blot)测定3组细胞中凋亡相关分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、生存素(Survivin)、B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)及BCL-2相关X蛋白(BAX)蛋白表达水平。结果:Jurkat细胞转染效率高于90%,CD59主要定位于细胞膜中。相比空白对照组和阴性对照组,RNAi慢病毒转染组中CD59 mRNA表达明显下调(P 0. 05)。RNAi慢病毒转染组中CD59蛋白表达水平较空白对照组和阴性对照组明显降低(P 0. 05)。相比空白对照组和阴性对照组,RNAi慢病毒转染组中TNF-β表达水平明显升高,IL-3表达水平明显降低(P 0. 05)。RNAi慢病毒转染组Survivin和BCL-2表达水平较空白对照组和阴性对照组明显降低,Caspase-3和BAX蛋白表达较空白对照组和阴性对照组明显升高(P 0. 05)。结论:通过转染RNAi慢病毒载体促使CD59基因表达下调可降低急性T系白血病Jurkat细胞株中促增殖分化相关分子IL-3的表达,提高肿瘤坏死相关因子TNF-β的表达,同时可提高细胞中促凋亡相关蛋白Caspase-3和BAX的表达,降低抗凋亡蛋白Survivin和BCL-2的表达。     

RNA干扰沉默survivin基因对食管癌Eca-109细胞放射敏感性的影响

目的探讨RNA干扰沉默survivin基因对食管癌Eca-109细胞放射敏感性的影响。方法构建靶向survivin基因特定序列的小干扰RNA(small interfering,siRNA)真核表达干扰质粒pRNAT-siRNA-survivin转染食管癌Eca-109细胞为干扰组,构建阴性对照质粒pRNAT-siRNA-control转染Eca-109细胞为阴性对照组,未转染的Eca-109细胞为空白对照组,3组采用Western blot检测survivin蛋白表达水平。取对数生长期干扰组Eca-109/si-survivin细胞和空白对照组Eca-109细胞,在直线加速器下分别给予6Gy的X线照射,分别为干扰+X线照射组和单纯X线照射组(X线照射组),采用流式细胞术检测各组细胞凋亡指数,采用MTT法分析细胞存活分数。结果干扰组细胞survivin蛋白表达水平(18.75±3.12)较阴性对照组(44.17±3.15)和空白对照组(46.20±2.62)明显下调(P0.05);干扰+X线照射组细胞凋亡指数[(29.56±0.74)%]明显高于空白对照组[(4.35±0.15)%]、阴性对照组[(4.32±0.32)%]、干扰组[(9.24±0.35)%]和X线照射组[(22.17±0.75)%],差异均有统计学意义(P0.05),干扰组和X线照射组明显高于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰+X线照射组细胞存活分数[(19.54±1.12)%]明显低于空白对照组[(95.35±1.40)%]、阴性对照组[(93.45±1.38)%]、干扰组[(70.96±0.85)%]和X线照射组[(35.84±0.52)%](P0.05),干扰组和X线照射组明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05)。结论靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,进而增强人食管癌Eca-109细胞的放射敏感性。     

PTEN对苦参碱抑制LoVo细胞的影响

目的探讨人第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)在苦参碱诱导结肠癌LoVo细胞凋亡及抑制增殖、迁移、侵袭中的作用。方法结肠癌LoVo细胞,分为空白对照组(不转染不加药)、转染组(转染PTEN-siRNA)、转染加药组(转染PTEN-siRNA并加入苦参碱1mg/mL)、阴性对照组(转染NC-siRNA)、阴性转染加药组(转染NC-siRNA并加入苦参碱1mg/mL)、加药组(不转染但加入苦参碱1mg/mL)。空白对照组和转染组采用MTT法检测细胞残余活性,各组采用细胞划痕实验检测细胞迁移距离,采用Transwell法检测细胞穿膜数量,采用Western blot法检测细胞PTEN、Akt、p-Akt、bax和bcl-2蛋白表达情况。结果培养48h后,转染组不同苦参碱浓度作用下细胞残余活性均高于空白对照组(P0.05),且呈浓度和时间依赖性;24、48h时空白对照组细胞迁移距离[(21.60±0.14)、(11.65±0.39)mm]明显长于转染组[(11.45±0.11)、(3.40±0.28)mm]和转染加药组[(13.15±0.25)、(6.01±0.28)mm],短于阴性转染加药组[(23.10±0.81)、(14.85±0.32)mm]和加药组[(23.65±0.03)、(15.40±0.27)mm](P0.05);与空白对照组比较,转染组和转染加药组细胞穿膜数量均增加,阴性转染加药组和加药组细胞穿膜数量均减少;转染组PTEN(0.37±0.04)、bax(0.84±0.11)蛋白表达量明显低于空白对照组(0.57±0.06、1.03±0.02)、加药组(1.21±0.04、1.51±0.03)和阴性转染加药组(1.31±0.02、1.49±0.19)(P0.05),Bcl-2蛋白表达量(1.19±0.04)明显高于空白对照组(0.67±0.11)、加药组(0.44±0.03)和阴性转染加药组(0.48±0.03)(P0.05);空白对照组PTEN、Akt(0.98±0.02)及bax蛋白表达量低于加药组(Akt为1.22±0.14)和阴性转染加药组(Akt为1.12±0.07),高于转染组(Akt为0.97±0.05)和转染加药组(Akt为0.96±0.07)(P0.05)。结论苦参碱可上调PTEN基因表达,明显抑制LoVo细胞增殖、迁移、侵袭及诱导细胞凋亡与PI3K-Akt信号通路有关。     

小干扰RNA抑制成纤维细胞激活蛋白3的表达对肺癌干细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)抑制成纤维细胞激活蛋白3(fibroblast activation protein 3,FAP3)基因表达对肺癌干细胞增殖和侵袭的影响。方法:采用流式细胞术从肺癌细胞株A549中分选出CD44+/CD133+的肺癌的肿瘤干细胞(cancerstem cells,CSCs)。将肺癌CSCs分为3组:空白对照组(不转染任何质粒)、siRNA-FAP组(转染靶向沉默FAP3表达的siRNA质粒)、阴性对照组(转染包含随机序列的siRNA质粒)。采用MTT比色法检测靶向FAP3表达的siRNA(siRNA-FAP3)转染12、24、48和72h后对细胞增殖的影响;采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和蛋白质印迹法(Western blot)分别检测转染72h后细胞株中FAP3、Ki67的mRNA和蛋白质的表达情况;采用软琼脂克隆集落形成实验检测siRNA-FAP3对肺癌CSCs侵袭能力的影响。结果:转染48h和72h后,siRNA-FAP3组的细胞增殖抑制率[(24.67±1.08)%,(53.98±3.75)%]大于阴性对照组[(3.76±0.88)%,(4.53±1.01)%]及空白对照组[(2.34±0.41)%,(3.28±0.65)%],差异均有统计学意义(P分别<0.05和0.01)。转染72h后,siRNA-FAP组细胞中FAP3和Ki67基因的mRNA表达水平(0.32±0.06,0.18±0.02)显著低于阴性对照组(1.03±0.12,0.99±0.17)和空白对照组(1.02±0.09,0.97±0.11),差异有统计学意义(P<0.01)。转染72h后,siRNA-FAP组细胞中FAP3和Ki67蛋白表达水平(0.16±0.05,0.25±0.09)显著低于阴性对照组(0.49±0.26,0.47±0.13)和空白对照组(0.59±0.27,0.63±0.22),差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA-FAP组细胞克隆形成率[(13.09±5.21)%]显著低于阴性对照组[(77.59±8.29)%]和空白对照组[(83.86±10.11)%],差异有统计学意义(P<0.01)。结论:转染siRNA可有效抑制肺癌CSCs中FAP3蛋白的表达,并且还可抑制CSCs的体外增殖和侵袭能力。     

siRNA沉默TEAD4基因对人黑素瘤细胞系A375细胞生物学行为的影响

目的探讨siRNA沉默人黑素瘤A375细胞中TEAD4基因对细胞增殖、周期及凋亡的影响。方法人黑素瘤A375细胞分为TEAD4-1组、TEAD4-2组、TEAD4-3组和转染试剂对照组(MOCK组),TEAD4-1组、TEAD4-2组、TEAD4-3组细胞分别转染TEAD4-1 siRNA、TEAD4-2 siRNA、TEAD4-3 siRNA,MOCK组细胞转染RNAi-Mate转染试剂。4组细胞采用实时PCR检测TEAD4 mRNA相对表达量。TEAD4-2组和MOCK组采用流式细胞仪检测转染6 h时转染成功阳性细胞百分率、转染48 h时细胞周期变化情况,采用流式双染法检测转染48 h时细胞凋亡率。结果 TEAD4-2组TEAD4 mRNA相对表达量(0.208±0.036)低于MOCK组(1.000±0.000)、TEAD4-1组(0.361±0.047)和TEAD4-3组(0.417±0.059)(P0.05),TEAD4-1组和TEAD4-3组低于MOCK组(P0.05),TEAD4-1组与TEAD4-3组比较差异无统计学意义(P0.05);转染6 h时,TEAD4-2组转染成功阳性细胞百分率[(69.830±0.198)%]明显高于MOCK组(0)(P0.05);转染48 h时,TEAD4-2组G_0/G_1期细胞百分率[(91.327±0.251)%]和细胞凋亡率[(11.000±0.436)%]均明显高于MOCK组[(85.590±0.610)%、(0.620±0.100)%](P0.05),G_2/M期细胞百分率[(5.473±0.191)%]和增殖指数(0.086±0.003)低于MOCK组[(9.710±1.101)%,0.139±0.006](P0.05)。结论 TEAD4基因表达可促进人黑素瘤细胞系A375细胞增殖、影响细胞周期及抑制细胞凋亡,TEAD4基因可能参与人黑素瘤的发生和发展。     

siRNA沉默胰腺癌BXPC-3细胞中Her-2/neu基因对COX-2表达水平及细胞增殖、凋亡、侵袭力的影响

目的分析胰腺癌BXPC-3细胞中原癌基因人表皮生长因子受体-2(Her-2/neu)基因siRNA沉默对环氧合酶-2(COX-2)表达水平及其对细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法通过Western blot法与实时荧光定量PCR法对正常胰腺细胞株和胰腺癌BXPC-3细胞中的COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA表达进行检测。建立Her-2/neu基因siRNA慢病毒表达载体并对BXPC-3细胞进行转染,其中转染Her-2/neu siRNA慢病毒载体为观察组,转染NC-GFP-LV为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组。分别采用CCK-8法、流式细胞分析仪和细胞实验技术(Transwell实验)分析Her-2/neu基因siRNA沉默对细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。结果 COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA在胰腺癌BXPC-3细胞中的表达水平明显高于正常胰腺HPDE6C7细胞的表达(P0.01)。观察组COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA表达水平明显下调,较阴性对照组与空白对照组表达水平均明显降低(P0.01),而阴性对照组与空白对照组表达水平的比较,并无显著差异(P0.05)。Her-2/neu基因siRNA沉默可明显减弱细胞增殖和侵袭力,增加细胞凋亡率。结论 COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA在胰腺癌BXPC-3细胞中均呈现高表达,且Her-2/neu基因siRNA沉默可明显阻滞细胞增殖及侵袭,导致细胞凋亡。     

过氧化还原蛋白酶2对颈动脉粥样硬化血管内皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响

目的探讨过氧化还原蛋白酶2(peroxlredoxin 2, Prdx2)对颈动脉粥样硬化血管内皮细胞HCVSMCs增殖、凋亡与迁移的影响。方法对数生长期人颈动脉粥样硬化血管内皮细胞HCVSMCs随机分为空白组(不进行转染)、对照组(转染pcDNA3.0载体)和观察组(转染pcDNA3.0-Prdx2载体)。取转染24、48 h细胞,采用MTT法检测细胞增殖,双染法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot法检测Prdx2、Myc蛋白相对表达量,Transwell小室实验检测细胞迁移能力。结果转染24、48 h后培养24 h,观察组细胞增殖指数[(66.77±8.22)%、(78.40±9.48)%]高于对照组[(35.68±7.11)%、(46.83±10.03)%]、空白组[(35.28±8.14)%、(49.02±8.11)%](P0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P0.05)。转染24、48 h,观察组细胞凋亡指数[(5.66±0.20)%、(6.18±0.33)%]低于对照组[(15.76±0.55)%、(17.02±0.51)%]、空白组[(15.09±0.28)%、(17.03±0.77)%](P0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P0.05)。转染48 h,观察组G_0/G_1期细胞比率[(59.52±4.63)%]高于对照组[(41.15±6.61)%]、空白组[(41.02±5.62)%](P0.05),S期和G_2/M期细胞比率[(13.97±2.56)%、(26.19±2.66)%]低于对照组[(25.05±4.87)%、(35.92±4.52)%]、空白组[(25.75±3.11)%、(35.44±4.55)%](P0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P0.05)。转染24、48 h,观察组Prdx2蛋白相对表达量(7.92±0.40、8.45±0.08)、Myc蛋白相对表达量(4.55±0.09、4.58±0.16)高于对照组(Prdx2:1.82±0.67、1.91±0.02;Myc:1.14±0.08、1.51±0.09)和空白组(Prdx2:1.85±0.61、2.04±0.41;Myc:1.16±0.10、1.53±0.10)(P0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P0.05)。转染24、48 h,观察组细胞迁移距离[(91.22±5.11)、(98.04±6.34)μm]较对照组[(45.45±6.23)、(54.11±7.22)μm]、空白组[(45.61±4.09)、(55.72±5.11)μm]远(P0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 Prdx2高表达能促进颈动脉粥样硬化血管内皮细胞HCVSMCs增殖与迁移,抑制其凋亡,调节细胞周期,促进Myc蛋白表达,抑制动脉粥样硬化进展。     

调强放射治疗对鼠骨包虫生发细胞周期及caspase-9的影响

目的探讨三维适形调强放疗(intensity-modulated radiation therapy, IMRT)的放射线对鼠骨包虫生发细胞的细胞周期及凋亡因子caspase-9的影响。方法骨包虫病子午沙鼠20只,将鼠骨包虫内囊中的生发细胞分离并进行体外培养,将体外培养成功的骨包虫生发细胞分为IMRT组和对照组。IMRT组给予总剂量为40 Gy的IMRT放疗,对照组给予假照射。放疗结束24 h后,采用流式细胞仪检测2组骨包虫生发细胞的细胞周期,采用ELISA法检测骨包虫生发细胞中凋亡相关蛋白caspase-9蛋白水平,采用实时荧光定量PCR法检测骨包虫生发细胞caspase-9 mRNA相对表达量。结果放疗结束24 h后,IMRT组骨包虫生发细胞S期细胞比率[(65.65±7.46)%]明显高于对照组[(32.49±4.23)%],G_0/G_1期[(32.37±4.94)%]和G_2/M期[(1.98±0.19)%]细胞比率明显低于对照组[(53.95±4.55)%、(13.55±2.48)%](P0.05)。IMRT组生发细胞caspase-9蛋白水平[(0.071±0.012)pmol/L]和caspase-9 mRNA相对表达量(30.21±6.99)明显高于对照组[(0.011±0.004)pmol/L、12.17±3.01](P0.05)。结论 IMRT可改变鼠骨包虫生发细胞的细胞周期,抑制生发细胞的增殖,可能是通过调节凋亡相关蛋白caspase-9水平而实现。     

慢病毒介导的IGF-1R基因沉默对肝细胞癌的增殖和迁移的影响

目的探讨慢病毒介导的胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因沉默对肝细胞癌的增殖和迁移的影响。方法设计并筛选高效特异性胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因的小干扰RNA,构建稳定遗传的慢病毒载体质粒,观察其转染沉默IGF-1R基因的肝癌细胞株Huh7细胞增殖、迁移以及侵袭能力,进一步观察其对PI3K/Akt及Bax/Bcl-2通路的影响。结果采用倒置相差荧光显微镜观察转染效果,镜下可见较多细胞特异性表达GFP绿色荧光,转染率超过80%。scrambled阴性对照组以及空白对照组IGF-1R mRNA及蛋白的相对表达量显著高于LV-IGF-1R-RNAi转染组(P0.01)。成功转染后,培养细胞72 h、96 h,LV-IGF-1R-RNAi转染组增值率显著低于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05或P0.01)。侵袭实验和迁移实验均证实细胞明显受到抑制(P0.01)。蛋白免疫印迹法显示,LV-IGF-1R-RNAi转染组p-PI3K、p-Akt及Bcl-2相对表达量显著低于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05);而Bax显著高于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05)。结论RNAi技术沉默IGF-1R基因表达能显著抑制肝癌细胞株Huh7细胞的增殖、侵袭作用,而这一作用可能与抑制PI3K/Akt通路蛋白磷酸化及调节Bax/Bcl-2通路蛋白表达有关。     

人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞miR-146a-5p表达及对细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-146a-5p在人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞系中的表达及对SCC9细胞增殖、凋亡的影响。方法取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞和人正常口腔角质HOK细胞,采用实时荧光定量PCR法检测miR-146a-5p mRNA、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6, TRAF6)mRNA相对表达量。取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞,随机分为观察组(转染miR-146a-5p mimics)和空白对照组(转染等量ddH_2O),转染24、48 h,采用CCK-8法检测2组细胞增殖,FITC-PI荧光双染法检测细胞凋亡;转染24 h,采用实时荧光定量PCR法检测PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量,Western blot法检测PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量。结果 SCC9细胞miR-146a-5p mRNA相对表达量(8.33±0.58)高于HOK细胞(1.04±0.01),TRAF6 mRNA相对表达量(0.05±0.01)低于HOK细胞(1.05±0.01)(P0.05)。转染24、48 h,观察组SCC9细胞增殖吸光度值(1.65±0.02、1.96±0.04)高于空白对照组(1.33±0.01、1.57±0.02)(P0.05),SCC9细胞凋亡率[(0.89±0.01)%、(1.23±0.01)%]低于空白对照组[(2.77±0.01)%、(4.23±0.01)%](P0.05)。转染24 h,观察组Scc细胞PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量(2.98±0.05、8.20±0.06、5.34±0.03)高于空白对照组(1.05±0.01、1.03±0.01、1.07±0.01),PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量(2.32±0.01、10.23±0.02、5.25±0.01)高于空白对照组(0.62±0.01、4.58±0.01、0.09±0.01)(P0.05)。结论 SCC9细胞miR-146a-5p表达上调,TRAF6表达下调;miR-146a-5p可促进SCC9细胞增殖,抑制其凋亡,其机制可能是增强PI3K/Akt/mTOR信号通路表达。     

siRNA沉默细胞周期相关激酶基因对鼠结肠癌生长及其细胞凋亡的影响

目的探讨siRNA沉默细胞周期相关激酶(CCRK)基因对鼠结肠癌生长及其凋亡的影响。 方法将50只BALB/C(nu/nu)裸鼠皮下接种人类结肠癌SW480细胞,将其中建立移植瘤裸鼠模型成功的30只裸小鼠按照单纯随机抽样方法随机分为3组,分别接种siRNACCRK转染的人类结肠癌SW480细胞株(实验组)、正常培养的SW480细胞(空白对照组)和以转染携带无关序列片段sh RNA慢病毒的SW480细胞(阴性对照组)。第42天处死裸鼠后取下肿瘤组织,比较各组肿瘤重量、CCRKmRNA表达量、CCRK蛋白表达和细胞凋亡的变化。 结果转染siRNA组肿瘤重量、CCRK mRNA和CCRK蛋白表达[(0.54±0.15)g,1.14±0.24和0.18±0.05]表达显著低于空白对照组[(1.05 ± 0.14)g,2.41±0.42和0.49±0.07]和空siRNA载体组[(1.07 ±0 .12)g,2.39±0.47,0.47±0.09;F＝21.18,23.47,90.03;P<0.01];空白对照组与空siRNA载体组比较差异无统计学意义(q＝0.98,1.07,1.13;P>0.05)。实验组沉默CCRK基因后组织中细胞凋亡率为(21.23±1.12)%,明显高于空白对照组(6.78±0.37)%和阴性对照组(7.25±0.32)%,差异有统计学意义(F＝56.936,P<0.01);但空白对照组和空siRNA载体组之间差异无统计学意义(q＝1.78,P>0.05)。 结论CCRK靶向siRNA表达载体接种结肠癌裸鼠后能显著降低结肠癌瘤体的增长,抑制CCRK基因和蛋白表达;siRNA沉默CCRK基因能促进其凋亡,CCRK基因有望成为结直肠癌治疗的新靶点。     

同源盒A13在胃癌组织中表达对SGC-7901细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨胃癌组织及癌旁组织中同源盒A13(homeobox gene A13,HOXA13)表达差异,及下调胃癌SGC-7901细胞HOXA13基因表达对细胞增殖和侵袭能力的影响。方法取109例胃癌患者手术切除的胃癌组织和癌旁正常组织,采用免疫组织化学法检测HOXA13蛋白表达;取对数生长期SGC-7901细胞分为转染组(转染siRNA-HOXA13)、阴性对照组(转染siRNA-NC)和空白对照组(不作任何处理),采用MTT法检测转染12、24、48、72、96h时细胞增殖能力,Transwell法检测转染后培养48h时细胞侵袭能力,Western blot法检测转染后培养48h时细胞HOXA13、Twist、E-cadherin和Vimentin蛋白表达。结果胃癌组织HOXA13蛋白阳性表达率(75.23%)高于癌旁正常组织(33.94%)(P0.05);HOXA13蛋白阳性表达率在进展期胃癌(82.98%)、低分化程度(84.93%)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(86.27%)、有淋巴结转移者(84.38%)均高于早期胃癌(26.67%)、中高分化程度(55.56%)、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(65.52%)、无淋巴结转移者(62.22%)(P0.05),在性别、年龄、肿瘤直径上差异均无统计学意义(P0.05);转染组转染后培养24、48、72、96h时吸光度值低于阴性对照组和空白对照组(P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染组转染后培养48h时侵袭细胞数[(97.14±10.03)个]均较阴性对照组[(115.39±5.77)个]和空白对照组[(125.11±12.45)个]少(P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染组转染后培养48h时细胞HOXA13、Twist和Vimentin蛋白表达(0.24±0.05、0.34±0.07、0.36±0.04)均低于阴性对照组(0.87±0.11、0.75±0.02、0.75±0.07)和空白对照组(0.88±0.05、0.76±0.05、0.72±0.06)(P0.05),E-cadherin蛋白表达(0.67±0.08)高于阴性对照组(0.33±0.06)和空白对照组(0.35±0.04)(P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论胃癌组织中HOXA13蛋白呈高表达,其表达程度与肿瘤恶性程度有关;下调SGC-7901细胞HOXA13基因表达可抑制细胞增殖和侵袭能力。     

RNA干扰Caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用

目的:探讨RNA干扰caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用效果.方法:构建针对大鼠caspase-8基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-caspase-8 shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定表达caspase-8 shRNA的细胞系.实验分为3组,(1)正常对照组,未转染的RK3E细胞;(2)阴性对照组,转染空载体pRNAT-U 6.1的RK3E细胞系;(3)实验组,转染caspase-8 shRNA的RK3E细胞系.经脂多糖孵育12 h后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR和Real time PCR检测mRNA的表达,以及各组caspase-8蛋白的活性.结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P＜0.01),caspase-8的mRNA水平和蛋白活性显著降低(P＜0.01).结论:针对caspase-8的特异性shRNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制细胞凋亡的发生.