碳酸酐酶Ⅸ抑制剂对乳腺癌细胞在低氧环境下的生长抑制作用及其机制

目的探讨碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydraseⅨ, CAⅨ)抑制剂对人乳腺癌MCF-7细胞在低氧环境中的增殖抑制作用和机制。方法人乳腺癌MCF-7细胞培养24 h后,采用实时定量PCR法检测细胞在1%低氧和21%正常氧气环境下CAⅨmRNA相对表达量;将对数生长期人乳腺癌MCF-7细胞分为25、50、100μmol/L U-104组(分别加入含25、50、100μmol/L U-104的细胞培养液进行处理)和对照组(加入等量细胞培养液),低氧环境下培养48 h后,采用MTT法检测各组人乳腺癌MCF-7细胞的存活率,采用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测对照组和100μmol/L U-104组细胞凋亡率;培养24 h后,采用Western blot法检测对照组和50、100μmol/L U-104组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相对表达量。结果培养24 h后,MCF-7细胞1%低氧环境中CAⅨmRNA相对表达量(23.93±4.02)高于21%正常氧环境(1.00±0.00)(P0.05);培养48 h后,对照组及25、50、100μmol/L U-104组细胞存活率[100%、(57.30±5.06)%、(28.84±3.52)%、(9.63±2.58)%]依次降低(P0.05),100μmol/L U-104组细胞凋亡率[(89.46±3.05)%]高于对照组[(6.54±0.92)%](P0.05);培养24 h后,对照组及50、100μmol/L U-104组细胞Bcl-2蛋白相对表达量(0.576±0.040、0.253±0.030、0.103±0.020)依次降低(P0.05),Bax蛋白(0.103±0.020、0.216±0.020、0.413±0.030)和caspase-3蛋白(0.216±0.020、0.373±0.010、0.540±0.020)相对表达量依次增高(P0.05)。结论 CAⅨ抑制剂U-104在低氧条件下对乳腺癌MCF-7细胞有明显增殖抑制作用,其机制可能是U-104抑制了CAⅨ在低氧状态下的活性,激活Bax、caspase-3和抑制Bcl-2,从而诱导乳腺癌细胞的凋亡。     

Akt特异性抑制剂MK2206诱导U937及RS4;11细胞凋亡及其机制

目的:本研究探讨Akt激酶抑制剂MK2206对U937及RS4;11细胞增殖、凋亡的影响,并分析其可能的作用机制。方法:以不同浓度MK2206处理U937及RS4;11细胞24、48 h,用CCK-8法绘制细胞增殖曲线;Annexin V/7-氨基放线菌素D(7-AAD)双标记法分析细胞凋亡情况;流式细胞术检测细胞周期的变化;实时定量PCR检测Bax、Bcl-2、XIAP、CDK1、caspase-3基因mRNA表达的变化。结果:MK2206对U937及RS4;11细胞增殖具有抑制作用,且抑制效应呈一定的时间和剂量依赖性,U937细胞24、48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为(0.48±0.15)和(0.09±0.01)μmol/L,RS4;11细胞24、48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为(0.91±0.02)和(0.68±0.11)μmol/L。0.5μmol/L MK2206作用于U937细胞及1.0μmol/L MK2206作用于RS4;11细胞24 h、48 h,Annexin V/7-AAD标记的阳性细胞升高,U937细胞组24 h细胞凋亡率为(4.18±0.70)%,48 h细胞凋亡率为(22.53±4.67)%,均高于对照组的(1.35±0.34)%(P0.05),且48 h细胞凋亡率较24 h更为明显(P0.05);RS4;11细胞组24 h和48 h细胞凋亡率分别为(5.74±0.58)%和(10.07±1.24)%,均高于对照组的(1.32±0.31)%(P0.05),且48 h细胞凋亡率较24 h更为明显(P0.05)。流式细胞术检测细胞周期结果显示,U937细胞组G2/M期细胞比例为(96.78±9.11)%,高于对照组的(9.64±0.91)%(P0.05);RS4;11细胞组G2/M期细胞比例为(14.19±3.82)%,高于对照组的(5.75±1.28)%(P0.05)。荧光定量PCR检测结果示,两种细胞中Bax、caspase-3 mRNA相对表达水平升高,而Bcl-2、XIAP表达水平降低,同时伴CDK1 mRNA水平的减少,与各自对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。结论:MK2206能有效抑制U937及RS4;11细胞增殖及促进细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G2/M期,其促凋亡机制与上调Bax与caspase-3基因表达、下调Bcl-2与XIAP基因表达有关,细胞周期G2/M期阻滞与CDK1基因表达水平下降有关。     

别欧前胡素诱导急性髓系HL-60细胞凋亡机制研究

目的探讨别欧前胡素诱导急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的机制。方法对数生长期HL-60细胞随机分为对照组(普通培养液)、10mg/L别欧前胡素组(10mg/L别欧前胡素+培养液)、30mg/L别欧前胡素组(30mg/L别欧前胡素+培养液)、50mg/L别欧前胡素组(50mg/L别欧前胡素+培养液),培养48h时行锥虫蓝染色检测4组HL-60细胞增殖抑制率,应用流式细胞仪检测细胞周期,采用实时荧光定量PCR法检测B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)mRNA相对表达量,采用Western blot法检测Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-8蛋白相对表达量。结果培养48h,对照组及10、30、50mg/L别欧前胡素组细胞增殖抑制率[(1.53±0.18)%、(15.20±0.10)%、(32.80±0.10)%、(72.20±0.06)%]逐渐增加(P0.05);对照组及10、30、50mg/L别欧前胡素组G1期细胞比率[(40.26±3.80)%、(41.91±5.60)%、(48.79±9.70)%、(60.42±6.30)%]逐渐增加(P0.05),S期细胞比率[(34.38±7.20)%、(33.89±8.60)%、(27.86±5.30)%、(23.42±6.70)%]、G2/M期细胞比率[(21.36±7.80)%、(20.23±5.80)%、(19.35±6.90)%、(16.16±9.80)%]逐渐降低(P0.05);对照组及10、30、50mg/L别欧前胡素组Bcl-2mRNA相对表达量(1.00±0.06、0.82±0.03、0.53±0.02、0.24±0.01)、Bcl-2蛋白相对表达量(1.13±0.04、1.09±0.10、0.85±0.04、0.55±0.10)逐渐降低(P0.05),Bax mRNA相对表达量(1.00±0.08、1.20±0.07、1.45±0.03、1.64±0.04)、Bax蛋白相对表达量(0.88±0.11、1.07±0.06、1.11±0.02、1.29±0.04)、cleaved-caspase-8蛋白相对表达量(1.23±0.05、1.32±0.04、1.56±0.06、1.93±0.06)逐渐增加(P0.05)。结论别欧前胡素可抑制急性髓系白血病HL-60细胞增殖,阻滞细胞于G1期,通过外源性和内源性途径诱导HL-60细胞凋亡,且呈剂量依赖性。     

橄榄苦苷对HepG2细胞脂肪变性的作用

目的探讨橄榄苦苷对HepG2细胞脂肪变性的影响。方法人肝癌HepG2细胞株分别用浓度0、0.5、1、1.5、2mmol/L游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)培养24h,MTS法测定细胞生存率,尼罗红染色观察细胞内脂滴颗粒堆积情况,ELISA法检测细胞三酰甘油(triacylglycerol,TG)水平,选择1mmol/L FFA进行后续实验。取人肝癌HepG2细胞株随机分为空白组(培养液),FFA组(培养液+1 mmol/L FFA),1μmol/L橄榄苦苷组(培养液+1 mmol/L FFA+1μmol/L橄榄苦苷)、10μmol/L橄榄苦苷组(培养液+1mmol/L FFA+10μmol/L橄榄苦苷)、100μmol/L橄榄苦苷组(培养液+1mmol/L FFA+100μmol/L橄榄苦苷)、1 000μmol/L橄榄苦苷组(培养液+1mmol/L FFA+1 000μmol/L橄榄苦苷),培养24h采用MTS法测定细胞生存率,尼罗红染色观察细胞内脂滴颗粒堆积情况,ELISA法检测细胞TG水平。结果 MTS结果显示,FFA浓度为1.5、2mmol/L时细胞生存率[(66.50±5.83)%、(57.63±11.63)%]低于0mmol/L时(100%)(P0.05),0.5、1mmol/L时细胞生存率[(95.96±3.50)%、(95.49±7.75)%]与0mmol/L比较差异无统计学意义(P0.05);FFA浓度为0.5、1mmol/L时细胞中TG水平[(0.91±0.02)、(0.96±0.04)mmol/L]均高于0 mmol/L[(0.37±0.05)mmol/L](P0.05);1、10、100μmol/L橄榄苦苷组细胞生存率[(96.22±8.05)%、(94.94±4.51)%、(97.10±2.53)%]与空白组(100%)、FFA组[(95.42±9.42)%]比较差异无统计学意义(P0.05);1 000μmol/L橄榄苦苷组细胞生存率[(41.35±4.84)%]明显低于空白组、FFA组(P0.05);10、100μmol/L橄榄苦苷组细胞中TG水平[(0.64±0.07)、(0.57±0.02)mmol/L]低于FFA组[(0.96±0.02)mmol/L](P0.05),1μmol/L橄榄苦苷组细胞中TG水平[(0.92±0.05)mmol/L]与FFA组比较差异无统计学意义(P0.05);显微镜下10、100μmol/L橄榄苦苷组脂肪颗粒较FFA组明显减少。结论 10、100μmol/L橄榄苦苷可减少HepG2细胞内TG生成,防止肝细胞脂肪变性。     

人脐带间充质干细胞对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响及可能机制

目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响及可能作用机制。方法取传代培养至第5代的hUC-MSCs细胞,应用显微镜下观察细胞形态,采用流式细胞术检测细胞表面标志物。取细胞数分别为0个/mL(对照组)、1×10~6个/mL(低剂量组)、2×10~6个/mL(中剂量组)、4×10~6个/mL(高剂量组)第5代hUC-MSCs细胞悬液0.5 mL,接种于Transwell小室膜上,应用Transwell小室与对数生长期SKOV3细胞共培养60 h,采用CCK-8法检测SKOV3细胞增殖相对抑制率,采用流式细胞术检测SKOV3细胞凋亡率,采用实时荧光定量PCR法检测SKOV3细胞PI3K mRNA、Akt mRNA、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2) mRNA、caspase-3 mRNA相对表达量。结果显微镜下第5代hUC-MSCs呈贴壁长梭状细胞,单核,大小较均一,呈漩涡状、放射状或平行排列,仍可保持原代hUC-MSCs细胞典型形态;流式细胞仪检测结果显示,第5代hUC-MSCs细胞表面CD44、CD29表达率分别为(98.406 7±0.133 2)%、(98.393 3±0.366 9)%,CD34、CD45表达率分别为(0.013 3±0.005 8)%、(0.006 7±0.005 8)%。第5代hUC-MSCs细胞与SKOV3细胞共培养60 h,低剂量组、中剂量组、高剂量组SKOV3细胞凋亡率[(40.63±0.74)%、(45.53±0.67)%、(56.53±0.57)%]、细胞增殖相对抑制率[(23.96±1.55)%、(40.35±1.34)%、(46.25±2.41)%]和caspase-3 mRNA相对表达量(1.46±0.02、1.91±0.04、2.37±0.01)依次增高(P均0.05),且均高于对照组[(31.60±0.53)%、0、1](P0.05)。低剂量组、中剂量组、高剂量组PI3K mRNA(0.60±0.02、0.46±0.02、0.34±0.04)、Akt mRNA(0.85±0.04、0.66±0.03、0.46±0.05)、Bcl-2 mRNA(0.85±0.04、0.69±0.04、0.39±0.03)相对表达量依次降低(P均0.05),且均低于对照组(1、1、1)(P0.05)。结论 hUC-MSCs细胞与SKOV3细胞共培养可促进SKOV3细胞凋亡,且hUC-MSCs细胞数越多促凋亡作用越强,其机制可能与下调Bcl-2、上调caspase-3表达,抑制PI3K/Akt信号通路有关。     

吉西他滨对乳腺癌细胞凋亡作用及其对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的探讨吉西他滨对乳腺癌细胞凋亡作用及其对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法应用MTT比色检测法测定不同浓度(0、5、10、100、250)μmol/L不同作用时间(24 h、48 h、72 h)下吉西他滨对MCF-7人乳腺癌不同时期细胞生长抑制作用,倒置显微镜观察吉西他滨对MCF-7细胞形态学的影响,流式细胞仪测定MCF-7细胞凋亡情况,应用Western blot法及免疫荧光法对Bcl-2、Bax蛋白进行定性及定量分析。结果 MTT结果显示,吉西他滨能有效抑制MCF-7细胞增殖,且呈剂量及时间依赖性。在倒置显微镜下观察吉西他滨作用MCF-7细胞后,细胞呈通透性增加,形态不规则,细胞脱落破碎等改变。MCF-7乳腺细胞培养24 h后应用流式细胞仪可观察到5μmol/L、10μmol/L吉西他滨组细胞凋亡率分别为(34.25±3.89)%、(45.89±4.32)%显著高于对照组(4.02±0.39)%,差异有统计学意义(t=5.269,7.452,P0.05)。Western blot法显示MCF-7细胞中Bax蛋白表达增多,而Bcl-2蛋白表达减少。免疫荧光法显示在细胞培养24 h后随着吉西他滨浓度增加,Bax蛋白表达强度增加,而Bcl-2蛋白表达强度减弱。结论吉西他滨能有效抑制乳腺癌细胞增殖,诱导其凋亡,其诱导凋亡机制可能与上调Bax蛋白及下调Bcl-2蛋白有关。     

神经生长因子和依达拉奉对缺血/再灌注损伤脑保护作用的比较研究

目的 比较神经生长因子(NGF)和自由基清除剂依达拉奉预处理对脑缺血/再灌注(I/R)损伤神经细胞的保护作用.方法 取出生24 h内的SD乳鼠脑皮质细胞,体外培养7 d后分为对照组,药物损伤组,NGF 10、50、100 μg/L预处理组及依达拉奉100 μmol/L预处理组.各预处理组分别预处理24 h后,给予200μmol/L谷氨酸(Glu)损伤0.5 h,换正常培养液继续培养24 h;培养9 d时检测神经细胞存活率[四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法]、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率(分光光度法)、细胞凋亡率(流式细胞术);用苏木素-伊红(HE)染色后在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,在透射电镜下观察细胞超微结构改变.结果 与药物损伤组比较,NGF 10、50、100μg/L预处理组和依达拉奉预处理组细胞存活率明显升高C(0.21±0.04)%、(0.23±0.04)%、(0.21±0.04)%、(0.24±0.04)%比(0.19±0.04)%],LDH漏出率[(0.50±0.06)%、(0.46±0.07)%、(0.50±0.02)%,(0.43±0.06)%比(0.56±0.03)%]和细胞凋亡率[(10.77±1.07)%、(10.38±0.70)%、(13.34±0.57)%、(9.99±0.77)%比(14.52±0.77)%]均不同程度降低(P<0.05或P<0.01);细胞形态受损程度和神经元超微结构病变均减轻.NGF 3个浓度组中以50μg/L组效果最佳,且与依达拉奉组各指标差异无统计学意义.结论 NGF和依达拉奉预处理脑皮质细胞24 h对脑I/R损伤均有保护作用;50 μg/L NGF和100 μmol/L依达拉奉预处理效果最佳,且二者最佳浓度时疗效相当.     

凉膈散抑制创伤失血性休克大鼠肝脏实质细胞凋亡的机制研究

目的 观察凉膈散对创伤失血性休克大鼠肝脏细胞凋亡的影响,并探讨其机制.方法 健康雄性Wistar大鼠90只,随机分为正常组,模型1、3、6、24 h组和凉膈散1、3、6、24 h组,每组10只.采用骨折后经颈动脉放血制备创伤失血性休克大鼠模型.凉膈散组于制模前连续3 d灌胃凉膈散10 ml/kg;模型组给予等量生理盐水;正常组不予任何处理.取血,采用速率法测定血浆天冬氨酸转氨酶(AST)浓度;取肝组织,用原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测凋亡细胞,用免疫组化法检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Bax、Bcl-2、Fas、FasL的基因表达.结果 模型组1、3、6、24 h血AST(U/L)呈上升趋势,24 h达峰值(647.36±60.02),与正常组(66.69±19.95)比较差异有统计学意义(均P<0.05);凉膈散组各时间点血AST(194.24±29.53、 306.01±83.85、 388.36±92.71、 451.48±99.70)均较模型组显著降低(均P<0.05).正常组未见凋亡细胞;模型组1、6、24 h时有散在凋亡细胞,3 h时中央静脉周围肝脏实质细胞出现大量凋亡(个:20.60±0.47);凉膈散组3 h时只发现肝窦内淋巴细胞凋亡(个:14.70±1.02),较模型组显著降低(P<0.05).模型组1、3、6和24 h caspase-3 蛋白表达(×103,A值)均较正常组(8.96±1.22)显著升高,3 h达峰值(49.71±0.89);凉膈散组各时间点caspase-3表达(17.81±0.48、 34.48±1.09、 28.52±1.14、 31.76±1.39)较模型组显著下降(均P<0.05).模型组各时间点凋亡相关基因表达均较正常组升高,且Bax、Bcl-2、Fas均于3 h达峰值(1.98±0.07、0.87±0.07、0.25±0.02),FasL于6 h达峰值(0.57±0.02);凉膈散组在3 h(0.40±0.03)和6 h(0.18±0.03)能显著降低Bax基因表达(均P<0.05),对Bcl-2基因表达无明显影响(均P>0.05),且未检测到Fas和FasL基因表达.结论 凉膈散能够抑制创伤失血性休克大鼠肝脏caspase-3蛋白表达及Bax、Fas、FasL基因表达,但对肝脏Bcl-2表达无明显影响;能显著抑制肝脏实质细胞凋亡,促进肝窦内出现淋巴细胞凋亡,从而避免炎性细胞过度活化造成对组织的损伤.     

白藜芦醇通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制体外胃癌细胞生长的研究

目的探讨白藜芦醇(Res)对胃腺癌细胞(AGS)生长的影响及其与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法体外培养胃癌细胞株AGS,并以不同浓度Res(25、50、100μmol/L)干预24、48、72 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞抑制率;不同浓度Res干预24 h流式细胞仪检测细胞周期,细胞免疫组化检测Wnt1、β-catenin、Lgr5的表达情况。实验数据以x±s表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果不同浓度Res(25、50、100μmol/L)干预24、48、72 h后,AGS细胞的状态变差,细胞形态变圆密度及数量减少,贴壁较差,细胞增殖抑制率分别为:25μmol/L Res作用24 h组(0.2033±0.0207)、48 h组(0.3949±0.0199)、72 h组(0.5102±0.0155);50μmol/L Res作用24 h组(0.3554±0.0207)、48 h组(0.5157±0.0321)、72 h组(0.6167±0.0248);100μmol/L Res作用24 h组(0.5005±0.0199)、48 h组(0.6251±0.0299)、72 h组(0.7271±0.0147),细胞增殖抑制率呈时间依赖性与剂量依赖性(P<0.05);不同浓度Res作用24 h后,检测G1期细胞所占比分别为空白组(48.33±0.21)%、25μmol/L Res作用组(52.61±0.41)%、50μmol/L Res作用组(58.53±0.48)%、100μmol/L Res作用组(71.16±0.20)%,细胞周期阻滞在G0/G1期(P<0.05);不同浓度Res干预24 h后100μmol/L组(207.36±0.52)、50μmol/L组(202.65±0.53)、25μmol/L组(197.13±1.07)Wnt1灰度值均高于对照组(191.40±0.28)(P<0.05);100μmol/L组(206.51±0.68)、50μmol/L组(200.49±0.30)、25μmol/L组(196.53±0.59)β-catenin灰度值均高于对照组(191.98±0.30)(P<0.05),100μmol/L组(209.22±0.51)、50μmol/L组(204.53±0.92)、25μmol/L组(195.7±60.90)Lgr5灰度值均高于对照组(188.16±0.86)(P<0.05)。结论 Res可抑制胃癌细胞AGS的生长作用,其机制可能通过减少Wnt/β-catenin信号通路的活化而产生的。     

姜黄素对人类绒毛膜癌细胞增殖、凋亡的影响及机制

目的探讨姜黄素对人类绒毛膜癌细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法将人类绒毛膜癌细胞JEG-3细胞株随机分为对照组和姜黄素干预组。姜黄素干预组加入100μl不同浓度的姜黄素与细胞孵育24 h;对照组只加入PRMI 1640培养液与等体积的二甲基亚砜(DMSO),MTT检测检测细胞抑制率。姜黄素干预组加入100μl姜黄素(终浓度为40μmol/L)与细胞孵育24 h后,TUNEL法检测细胞凋亡情况,Western blot检测增殖相关蛋白Ki-67和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达,以及凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl2)和Bcl2相关X蛋白(Bax)的表达。结果与对照组相比,姜黄素干预组JEG-3细胞培养24 h后吸光度显著下降(P 0. 05);姜黄素对JEG-3细胞抑制作用呈药物浓度依赖性,半抑制浓度(IC50)为(39. 33±1. 02)μmol/L;与对照组相比,JEG-3细胞的凋亡率明显升高,增殖相关蛋白Ki-67和Cyclin D1的表达显著降低(P 0. 05),凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的蛋白表达量显著升高(P 0. 05),Bcl-2的表达量显著降低(P 0. 05)。结论姜黄素可以下调人类绒毛膜癌细胞增殖相关蛋白的表达,上调凋亡相关蛋白的表达,调控其增殖和凋亡。     

环氧化酶2抑制剂塞来昔布诱导 NB4细胞凋亡的研究

目的：研究环氧化酶2（COX-2）选择性抑制剂塞来昔布对髓性白血病细胞株 NB4凋亡的影响,探讨塞来昔布诱导细胞凋亡的机制。方法RT-PCR 检测不同细胞系中 COX-2 mRNA 表达,MTT 法检测 NB4细胞增殖抑制,DNA Ladder 试验分析NB4细胞 DNA 片段化,流式细胞术检测 NB4细胞 Bcl-2蛋白的表达。结果与未加药处理组相比,不同浓度塞来昔布作用后DNA Ladder 片段随浓度的增加而更为明显。不同用药组25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L 塞来昔布组 Bcl-2蛋白表达率分别为（71．69±1．65）％、（34．51±2．53）％和（29．28±2．38）％,与空白对照组 Bcl-2蛋白表达率为85．34±2．89％相比,50μmol/L、100μmol/L 塞来昔布组 Bcl-2蛋白明显下降（P ＜0．05）。结论COX-2选择性抑制剂塞来昔布通过下调 NB4细胞 Bcl-2蛋白表达致诱导其凋亡。     

冬凌草甲素对急性单核细胞白血病细胞株THP-1的作用研究

目的探讨冬凌草甲素对急性单核细胞白血病细胞株THP-1的抗白血病效应及其作用机制。方法以急性单核细胞白血病细胞株THP-1为研究对象,应用改良四甲基偶氮唑盐法测定4、6、8μmol/L浓度冬凌草甲素处理72 h后THP-1细胞的增殖抑制率,以及计算2、4、6、8、10μmol/L冬凌草甲素处理24、72、120 h后的细胞生存率并绘制生长曲线;显微镜下观察4、6、8μmol/L冬凌草甲素处理24 h后THP-1细胞的形态学变化;采用流式细胞术检测0、4、6、8μmol/L冬凌草甲素处理24 h后THP-1细胞凋亡率;采用Western blot法检测6μmol/L冬凌草甲素处理THP-1细胞0、12、24 h后Akt/m TOR、Raf/MEK/ERK细胞信号转导通路的变化,以及凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的变化。结果 14、6、8μmol/L冬凌草甲素处理72 h后细胞增殖抑制率分别为(20.02±11.15)%、(45.99±12.76)%、(86.39±9.18)%,与4μmol/L冬凌草甲素比较,6、8μmol/L冬凌草甲素处理后细胞增殖抑制率均升高,差异均有统计学意义(P0.05或P0.01);冬凌草甲素处理72 h后细胞半抑制浓度为(6.12±1.48)μmol/L;细胞生长曲线显示,冬凌草甲素对THP-1细胞的生长抑制作用呈时间和浓度依赖性。2冬凌草甲素处理24 h后,THP-1细胞出现凋亡,形成凋亡小体,浓度越高细胞凋亡小体形成越多。30、4、6、8μmol/L冬凌草甲素(分别设为对照组及4、6、8μmol/L组)处理24 h后,THP-1细胞凋亡率分别为(3.7±1.1)%、(16.2±3.3)%、(30.1±4.3)%、(49.5±6.7)%,对照组与各浓度组凋亡率比较差异均有统计学意义(P0.05或P0.01);与4μmol/L组比较,6、8μmol/L组凋亡率均升高,差异均有统计学意义(P0.05)。4经Western blot法检测6μmol/L冬凌草甲素处理THP-1细胞24 h后可抑制细胞内Akt/m TOR、Raf/MEK/ERK信号转导通路的活化,并下调Bcl-2、上调Bax的表达。结论冬凌草甲素通过抑制Akt/m TOR、Raf/MEK/ERK信号转导通路的活化,以及调节凋亡调节蛋白Bax和Bcl-2的表达而发挥抗白血病效应。     

26S蛋白酶抑制剂b-AP15对Jurkat及RS4;11细胞增殖、凋亡的影响及凋亡机制的研究

目的 探讨26S蛋白酶抑制剂b-AP15对Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖及细胞凋亡的影响,并分析其作用机制.方法 无菌条件下对Jurkat细胞与RS4;11细胞进行培养,根据有无b-AP15处理,将其分为4组:①Jurkat细胞实验组;②Jurkat细胞对照组;③RS4;11细胞实验组;④RS4;11细胞对照组.其中,Jurkat细胞实验组与RS4;11细胞实验组采用浓度分别为0.05,0.10,0.50,1.00,5.00 μmol/L b-AP15处理24,48 h;Jurkat细胞对照组与RS4;11细胞对照组采用RPMI 1640培养基进行同步培养.采用CCK-8法绘制4组细胞增殖曲线;采用Annexin Ⅴ-别藻蓝蛋白(APC)/7-氨基放线菌素D(7-AAD)双标记流式细胞术检查4组细胞凋亡情况;采用流式细胞术检测细胞4组细胞周期分布情况;采用实时定量PCR检测4组细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2相关Ⅹ蛋白(Bax)基因、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2基因、Ⅹ连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、周期素依赖性激酶(CDK)1基因及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3基因mRNA表达水平.结果 ①b-AP15对Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖均具有抑制作用,且该抑制效应呈时间与剂量依赖性;Jurkat细胞经b-AP15处理24,48 h后,半数抑制浓度(IC50)分别为(1.52±0.35)μmol/L与(0.54±0.01) μmol/L,RS4;11细胞经b-AP15处理24,48 h后IC50分别为(0.97±0.02)μmol/L与(0.08±0.03)μmol/L.②使用浓度为1.5 μmol/L b-AP15处理Jurkat细胞实验组后,其与Jurkat细胞对照组相比细胞凋亡率显著增高,且差异有统计学意义(P＜0.001);使用浓度为1.0 μmol/Lb AP15处理RS4;11细胞实验组后,其与RS4;11细胞对照组相比细胞凋亡率亦显著增加,且差异亦有统计学意义(P＜0.001);且Jurkat细胞与RS4;11细胞经b-AP15处理48 h后,与处理24 h后者相比细胞凋亡率增高,且差异均有统计学意义(t=11.887,7.449;P＜0.001).③与Jurkat细胞对照组相比,使用浓度为1.5 μmol/L b-AP15处理Jurkat细胞实验组24 h后,Jurkat细胞周期明显被阻滞于G2/M期,且差异有统计学意义(t=10.672,P＜0.05);同时伴S期细胞比例减低,且差异亦有统计学意义(t=19.053,P＜0.05).与RS4;11细胞对照组相比,使用浓度为1.0 μmol/L b-AP15处理RS4;11细胞实验组24 h后,RS4;11细胞周期亦明显被阻滞于G2/M期,且差异有统计学意义(t=13.643,P＜0.05);同时伴S期细胞比例减低,且差异亦有统计学意义(t=6.992,P＜0.05).④使用b-AP15处理Jurkat细胞与RS4;11细胞24 h后,荧光定量PCR检测结果显示,凋亡相关基因Bax、caspase-3 mRNA相对表达水平增高,Bcl-2、XIAP mRNA相对表达水平减低,同时伴细胞周期相关基因CDK1 mRNA相对表达水平减低,与各自细胞对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05);且RS4;11细胞实验组caspase-3 mRNA相对表达水平较Jurkat细胞实验组相比,增高程度更为显著,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 b-AP15能有效抑制Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖,并促进其细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G2/M期,其促凋亡机制与上调Bax与caspase-3基因表达水平、下调Bcl-2与XIAP基因表达水平相关,细胞周期G2/M期阻滞与CDK1基因表达水平减低相关.     

白藜芦醇抑制甲状旁腺激素诱导的人主动脉平滑肌细胞凋亡

目的探讨甲状旁腺激素(PTH)对人主动脉平滑肌细胞凋亡的作用,及白藜芦醇(Resveratrol,RES)在其中的作用。方法实验一:体外培养人主动脉平滑肌细胞,用不同浓度甲状旁腺激素(阴性对照组、10~(-6)mol/L、10~(-8)mol/L、10~(-10)mol/L)刺激72 h,用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,寻找可引起细胞凋亡的最适PTH浓度。实验二:用该浓度PTH及不同浓度白藜芦醇(阴性对照组、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)共刺激人主动脉平滑肌细胞72h,用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果实验一:相较于对照组,不同浓度PTH刺激下,各组均产生了明显的细胞凋亡,差异具有统计学意义(P 0. 05)。确定10~(-10)mol/L PTH为可诱导细胞凋亡的较低浓度PTH。实验二:用10~(-10)mol/L PTH及不同浓度白藜芦醇(阴性对照组、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)共刺激人主动脉平滑肌细胞72h,发现相较于对照组,各浓度白藜芦醇(10、50、100μmol/L)均可以减少细胞凋亡,差异具有统计学意义(P 0. 05)。结论一定浓度的甲状旁腺激素可以诱导人主动脉平滑肌细胞凋亡,白藜芦醇对其有抑制作用。     

鸦胆子油乳对戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌PC3细胞株化疗敏感性的影响

目的探讨质量分数10%鸦胆子油乳(Brucea javanica oil emulsion, BJOE)对戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌PC3细胞株化疗敏感性的影响及机制。方法对数生长期戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌PC3细胞株分为空白组、BJOE组、多西他赛组、多西他赛+BJOE组,细胞培养液中分别加入磷酸盐缓冲液、质量分数10%BJOE、0.6μg/L多西他赛、质量分数10%BJOE+0.6μg/L多西他赛进行干预。培养24、48、72 h时,采用MTT法检测4组细胞增殖抑制率;培养48 h时,采用流式细胞术检测4组细胞凋亡率,采用Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化,采用实时荧光定量PCR法检测4组细胞B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、caspase-3 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测4组细胞Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白相对表达量。结果培养24、48、72 h时,多西他赛+BJOE组、多西他赛组、BJOE组细胞增殖抑制率依次降低(P0.05),3组细胞增殖抑制率均随时间延长而增高(P0.05);培养48 h时,空白组细胞核圆形或椭圆形,细胞质分布均匀;BJOE组、多西他赛组、多西他赛+BJOE组部分细胞呈不规则状态,染色质固缩、体积缩小,部分出现蓝色凋亡小体,其中多西他赛+BJOE组凋亡现象最明显;培养48 h时,多西他赛+BJOE组、多西他赛组、BJOE组、空白组细胞凋亡率[(28.71±3.15)%、(18.85±2.03)%、(14.62±1.57)%、(9.10±1.02)%]依次降低(P0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量依次增高(P0.05),Bax、caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量依次降低(P0.05)。结论质量分数10%BJOE与多西他赛联用可抑制戈舍瑞林去势抵抗性前列腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,增强细胞对多西他赛化疗敏感性,可能与下调Bcl-2 mRNA和蛋白表达,上调Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达有关。     

绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯对酒精诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用研究

目的:体外观察绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对酒精诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用,初步探讨EGCG治疗酒精性痴呆(alcohol-associated dementia,AAD)的可行性。方法:以SH-SY5Y神经元细胞为实验对象,酒精组给予100 mol/L酒精37℃培养24 h,EG CG+酒精组在其培养液中同时加入不同浓度的EG CG(1~100μmol/L)及100 mol/L酒精,37℃培养24 h;另设相同浓度的EGCG对照组(EGCG组)及空白对照组(对照组)。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,以Annex in-V APC/7-A AD双染法检测细胞凋亡及光镜下观察细胞形态。结果:MTT结果证实EGCG(25~100μmol/L)作用24 h后可明显促进SH-SY5Y细胞存活,并呈浓度依赖关系(P0.001)。流式检测及细胞形态观察结果证实酒精组细胞凋亡率(21.82%±1.27%),明显高于对照组(4.90%±0.80%)(P0.001)及EGCG组(7.82%±0.68%)(P0.001);EGCG(100μmol/L)+酒精组细胞凋亡率(10.81%±0.31%),明显低于酒精组(P0.001)。结论:EGCG可抑制酒精诱导SHSY5Y细胞凋亡发生并促进细胞存活,提示EGCG对于A AD治疗具有潜在价值。     

navitoclax联合阿糖胞苷在HEL细胞凋亡中的作用

目的探讨navitoclax(NTX)联合阿糖胞苷(cytarabine, Ara-C)对HEL细胞凋亡的影响及可能机制。方法取对数生长期HEL细胞,随机分为NTX组、Ara-C组和联合组,分别应用不同浓度NTX、Ara-C、NTX+Ara-C处理72 h,采用CCK-8法测定细胞活率,计算50%细胞抑制时的药物浓度(half maximal inhibitory concentration, IC_(50)),依据IC_(50)进行后续试验。分别取NTX组、Ara-C组和联合组处理24、48 h时细胞,采用流式细胞术检测早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率;采用实时荧光定量PCR法检测Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, BAX)mRNA、Bcl-2同源拮抗剂(Bcl-2 homologous antagonist/killer, BAK)mRNA、Bcl-2细胞凋亡相互作用介质(Bcl-2 interacting mediator of cell death, BIM)mRNA相对表达量,并进行比较。结果联合组应用NTX 10 nmol/L+Ara-C 20 nmol/L、NTX 100 nmol/L+Ara-C 200 nmol/L处理72 h细胞活率[(35.27±4.04)%、(13.58±1.33)%]低于NTX组应用NTX 10 nmol/L、100 nmol/L[(103.44±9.26)%、(65.56±3.37)%]、Ara-C组应用Ara-C 20 nmol/L、200 nmol/L处理72 h[(53.46±5.42)%、(20.92±1.74)%](P0.05);联合组应用NTX 1 000 nmol/L+Ara-C 2 000 nmol/L、NTX 10 000 nmol/L+Ara-C 20 000 nmol/L处理72 h细胞活率[(11.92±0.94)%、(8.86±1.26)%]低于Ara-C组应用Ara-C 2 000 nmol/L、20 000 nmol/L处理72 h[(19.43±0.43)%、(13.46±0.70)%](P0.05);处理24 h,联合组、NTX组、Ara-C组细胞早期凋亡率[(39.40±0.80)%、(19.50±1.13)%、(7.23±0.73)%]、总凋亡率[(50.01±0.65)%、(28.01±0.56)%、(10.20±0.71)%]依次降低(P0.05),联合组、NTX组晚期凋亡率[(10.61±1.45)%、(8.51±0.85)%]高于Ara-C组[(2.97±0.09)%](P0.05),联合组与NTX组比较差异无统计学意义(P0.05);处理48 h,联合组、NTX组、Ara-C组细胞早期凋亡率[(67.13±9.11)%、(15.03±0.87)%、(4.50±0.07)%]、晚期凋亡率[(15.70±1.33)%、(3.66±0.49)%、(2.22±0.31)%]、总凋亡率[(82.83±10.31)%、(18.70±1.28)%、(6.72±0.37)%]依次降低(P0.05);联合组处理24 h BAK mRNA相对表达量(1.27±0.45)高于NTX组(0.68±0.14)(P0.05),处理48 h BAK mRNA相对表达量(3.66±0.27)高于NTX组(0.90±0.04)、Ara-C组(1.06±0.41)(P0.05);处理24、48 h,联合组、NTX组、Ara-C组BAX mRNA相对表达量(24 h:1.34±0.41、1.14±0.18、0.96±0.28;48 h:1.09±0.48、0.93±0.14、1.04±0.26)、BIM mRNA相对表达量(24 h:0.89±0.07、1.06±0.20、1.04±0.22;48 h:1.19±0.30、0.87±0.08、1.14±0.15)比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 NTX联合Ara-C能明显诱导HEL细胞凋亡,其机制与上调前凋亡蛋白BAK表达有关。     

Cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖凋亡及Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响

目的研究cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的作用及对Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法体外培养的PC-3细胞应用cyclopamine处理后,通过MTT测定细胞增殖抑制情况;电镜下观察肿瘤组织形态学变化;流式细胞仪检测凋亡率;Western印迹技术检测Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白的表达变化。结果MTT法结果显示4μmol/L,8μmol/L及12μmol/L浓度的cyclopamine对PC-3细胞增殖有显著抑制作用,与对照组相比差异有显著性(P0.05或P0.01),抑制效果都随着浓度的增大及时间的增加而增强。电镜下可观察到典型的凋亡细胞;流式细胞仪检测结果表明cyclopamine诱导PC-3细胞发生凋亡;Western印迹技术的结果:经培养72h后,随着药物浓度增大,Bcl-2蛋白表达呈逐渐减少,而Bax,有活性的caspase-9蛋白表达逐渐增多。结论Cyclopamine抑制PC-3细胞增殖,在一定剂量和时间范围内呈时间、浓度依赖关系,并可诱导其凋亡。Cyclopamine诱导PC-3细胞凋亡可能通过Bcl-2,Bax,caspase-9介导。     

吲哚美辛诱导的胃癌细胞凋亡与Wnt/β-连接蛋白信号通路及其下游凋亡调控蛋白的关系

目的:探讨Wnt/β-连接蛋白(Catenin)信号通路及其下游凋亡调控蛋白Bcl-2和Caspase-3的表达与吲哚美辛引起的胃癌细胞凋亡的关系.方法:用终浓度为50、100、200 μmol/L的吲哚美辛干预SGC7901细胞24 h,并设不加吲哚美辛的对照组.用CCK8法检测细胞增殖活性,用TUNEL法检测涂片中胃癌细胞的凋亡率,用Western blot法检测细胞内β-Catenin、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达.结果:SGC7901细胞在50 μmol/L的吲哚美辛作用24 h后细胞存活率为(92.71±4.81)％,100和200 μmol/L浓度组的细胞存活率则明显降低.对照组细胞的凋亡率为0,吲哚美辛干预后的细胞的凋亡率明显升高.对照组β-Catenin和Bcl-2蛋白表达最高而Caspase-3表达最低.吲哚美辛干预后β-Catenin和Bcl-2的表达明显降低,Caspase-3表达明显增高,且表现出明显的浓度依赖性.结论:Wnt/β-Catenin信号通路在吲哚美辛引导的SGC7901细胞凋亡过程中发挥重要的作用,其下游调控蛋白Bcl-2、Caspase-3共同参与了这一过程的调控.     

冬凌草甲素诱导多发性骨髓瘤U266细胞、RPMI8226细胞增殖和凋亡实验研究

目的 探究冬凌草甲素对多发性骨髓瘤(MM)U266细胞、RPMI8226细胞增殖和凋亡的影响。方法 通过细胞培养和处理方法,采用0、10、20、30、40、50μmol/L的冬凌草甲素处理MM相关U266细胞、RPMI8226细胞48 h。采用MTT法测定U266细胞、RPMI8226细胞的增殖情况,采用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒检测U266细胞、RPMI8226细胞凋亡情况,并采用蛋白质印迹法测定Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 处理48 h后,随着冬凌草甲素浓度(10～50μmol/L)的增加,U266细胞、RPMI8226细胞的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。处理48 h后,随着冬凌草甲素浓度(10～50μmol/L)的升高,促凋亡蛋白Bax表达量逐渐升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 冬凌草甲素具有抑制MM细胞增殖和诱导细胞凋亡的潜力,其作用机制可能与促进Bax表达,抑制Bcl-2表达,改变细胞Bcl-2/Bax比例,调节细胞凋亡有关。