应用siRNA抑制神经胶质瘤C6细胞受体表达的探讨

目的构建编码大鼠血管紧张素Ⅱ受体基因mRNA的短发夹RNA真核表达载体质粒,研究体外培养的哺乳细胞中siRNA抑制靶基因表达的有效性,为利用基因沉默技术从转录后水平进行高血压治疗的研究做准备。方法根据大鼠AT1受体mRNA序列设计并合成siRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1。用构建完成的pGenesil-1-siRNA质粒和重新洗牌的对照质粒转染大鼠胶质瘤细胞,并在不同时相收集转染的细胞,进行RT-PCR和Westernblot检测。结果AT1R基因短发夹RNA抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似。与对照组比较(100%),在转染后48h血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到35.5%±3.0%,72h后达到最低点(20.7%±4.0%)。而与对照组相比,血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24h和48h分别减少至46.9%±4.2%和37.0%±3.7%,最大减少在转染后72h(28.1%±4.0%)。结论成功地构建了编码大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA的短发夹RNA真核表达载体后,在体外转染哺乳细胞中表达siRNA可有效地抑制靶基因的表达,并导致其蛋白的翻译受到抑制,达到基因干扰的目的。为利用RNAi从转录后水平对心血管疾病进行治疗做有益的探索,为进一步研究基因沉默在自发性高血压大鼠的降压治疗研究奠定了基础。     

血管紧张素Ⅱ—Ⅰ型受体基因A1166／C多态性与原发性高血压及血脂水平关系

目的：探讨血管紧张素Ⅱ－Ⅰ型受体（ＡＴ１Ｒ）基因Ａ１１６６／Ｃ多态性与国人原发性高血压的关系,并探讨原发性高血压的发病机制。方法;应用限制性内切酶酶解聚合酶链式反应（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）的方法检测７０例健康人和１１２例高血压患者的ＡＴ１Ｒ基因型,生化技术测定血脂水平。结果：原发必因压组的ＡＣ基因型频率２５．７％,Ｃ等位基因频率１２．９％,分别显著高于下沉对照组的７１％和３．６％（Ｐ〈０．０５）,原发     

血管紧张Ⅱ2型受体转染表达对血管平滑肌细胞殖及迁移的影响

目的 探讨血管平滑肌细胞（VSMC）转染表达血和这紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）对其增殖和迁移影响。方法 构建带AT2R基因的重组复制缺隐型腺病毒载体（AdCMV-AT2R）,体外转染大鼠主动脉VSMC,用RT－PCR方法检测AT2RmRNA表达,流式细胞仪检测AT2R表达率,用细胞周期、分裂指数、MTT比色法和5－溴尿苷（BrdU）掺入法检测VSMC增殖。VSMC迁移用改良Boyden‘s趋化小室法检测,用激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白F－actin的表达。结果 构建的AdCMV－AT2R体外转染培养VSMC表达率为89．51％。AT2R峰值地,其S期和G2－M期细胞比率从31．7％降低到13．9％（P＜0．05）,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低61．14％和51．6％（P＜0．01）。VSMC的跨膜迁移数降低62．2％,F-actin表明明显减少。结论 AT2R转染表达可显著抑制体外培养VSMC的增殖和迁移,这一作用对再狭窄防治是有益的。     

腺病毒介导血管平滑肌细胞转染表达血管紧张素Ⅱ2型受体的研究

目的：体外培养大鼠血平滑肌细胞（VSMC）并以腺病毒介导转染表达血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）。方法：取大鼠主动脉血管,以常规组织块贴壁法培养VSMC;用同源重组方法构建带AT2R基因的复制缺陷型腺病毒载体（AdCMV-AT2R),并加以鉴定,扩增,以制取高滴度AdCMV-AT2R转染液,体外转染,VSMC,;用RT－PCR方法检测AT2RmRNA表达,免疫组织化学法及蛋白免疫印迹法检测AT2R蛋白表达,流式细胞仪检测AT2R表达率,同时检测AT1R的表达变化。结果：构建的AdCMV-AT2R体外转染培养VSMC表达率为89．51％,以免疫组化、免疫印迹和RT－PCR检测AT2R表明,转染后AT2R表达明显增强,并随表达时间延长而增加,48小时达峰值,AT2R转染表达不影响AT1R表达。结论：腺病毒载体可较高效率介导AT2R在体外培养的VSMC转染表达,AT1R表达不受其影响,转表达AT2R的SMC可作研究AngⅡ对其增殖、迁移以及凋亡等生物学行为影响的良好细胞模型。     

血管紧张素Ⅱ-1型受体基因A1166C多态性与原发性高血压的相关性研究

目的:研究血管紧张素Ⅱ-I型受体(AT1R)基因A1166c多态性与国人原发性高血压(EH)的关系,以期从分子学水平上阐明其发病机制,为EH的诊断、治疗及易患性研究提供依据。方法:应用聚合酶链反应,限制性内切酶酶解的方法检测83例EH患者(EH组)和64例健康人(对照组)的AT1R基因型,比较各组间的基因分布差异.分析AT1R基因A1166多态性与高血压的关系。结果:EH患者AT1R基因型AA、AC、CC的频率分别为57.8％,38.6％,3.6％与对照组的67.2％,29.7％,2.7％相比较,差异无显著性意义(P>0.05)。结论:AT1R的C等位基因频率在EH患者的分布较健康者高,但无统计学意义,尚不能确定AT1R基因A1166C多态性与EH有相关性。     

血管紧张素Ⅱ受体及其受体拮抗剂研究进展

血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素系统（RAS）中最为重要的活性激素，它在高血压的病理生理中起着重要的作用。AngⅡ的作用通过细胞表面的AngⅡ受体介导，根据与不同受体拮抗剂的选择性可将其受体分为两个亚型：AT1受体和AT2受体。已知的AngⅡ的生理作用是由AT1受体介导的AT2受体的功能尚不清楚，在临床上主要有两种抑制RAS活性的药物；一是血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI），它抑制AngⅡ的生成；二是AT1受体拮抗剂，它阻断AngⅡ相应受体的生理学作用。AT1受体拮抗剂的潜在临床实用性正在得到深入研究。     

腺病毒介导血管平滑肌细胞转染表达血管紧张素Ⅱ2型受体的研究

目的体外培养大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）并以腺病毒介导转染表达血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT     

胰腺癌细胞系血管紧张素Ⅱ1型受体蛋白表达的研究

目的：探讨血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1）在胰腺癌细胞中的表达。方法：用免疫细胞化学染色检测胰腺癌细胞系SW1990、PaTu8988s和PANC－1中AT1蛋白的表达。结果：胰腺癌细胞系SW1990、PaTu8988s和PANC－1中均有AT1蛋白的表达，结论：AT1在胰腺癌细胞生长中可能发挥重要作用，应用AT1拮抗剂对防治胰腺癌似乎有一定意义。     

原发性高血压病患者血管紧张素转换酶和血管紧张素受体基因多态性的研究

肾素 血管紧张素系统在维持体内电解质内环境稳定和调节血压中起着重要的作用。血管紧张素转换酶 (angiotensinconvertingenzyme ,ACE)是该系统的关键酶。而血管紧张素Ⅱ则主要是通过 1型受体 (angiotensinⅡtype 1receptor ,ATlR)发挥作用。我们对中国深圳地区汉族人群高血压病患者的ACE基因及ATlR基因多态性进行检测 ,以探讨该基因多态性与高血压病的关系。1　资料与方法各组受检者均为无血缘关系的深圳地区汉族人群。原发性高血压病组共 15 2例 ,为本院的门诊与住院患者 ,均符合WHO的高血压病诊断标准 ,经临床及实验室检查确诊为原…     

PepGMV Rep-Protein Expression in Mammalian Cells

The Geminiviruses genome is a small, single strand DNA that replicates in the plant cell nucleus. Analogous to animal DNA viruses, Geminiviruses depend on the host replication machinery to amplify their genomes and only supply the factors required to initiate their replication. Consequently, Geminiviruses remove the cell-cycle arrest and induce the host replication machinery using an endocycle process. They encode proteins, such as the conserved replication-associated proteins (Rep) that interact with retinoblastoma-like proteins in plants and alter the cell division cycle in yeasts. Therefore, the aim of this work is to analyze the impact of Pepper Golden Mosaic Virus (PepGMV) Rep protein in mammalian cells. Results indicate that the pTracer-SV40:Rep construction obtained in this work can be used to analyze the Rep protein effect in mammalian cells in order to compare the cell cycle regulation mechanisms in plants and animals.     

Expression of Rat Renin in Mammalian Cells and Its Purification

Rat renin cDNA was transfected into COS-7 and Chinese hamster ovary (CHO) cells and expressed under the control of the Simian Virus 40 early promoter. Conditioned media of the transfected cells showed renin activity only after trypsin treatment, suggesting prorenin was secreted into the medium. From the trypsinized serum-free culture of the transfected CHO cells active renin was purified to homogeneity by a simple three-step procedure. The active renin had similar specific activity, molecular weight, Km, pH optimum, and isoelectric point compared to native renin. The aminoterminal sequence was the same as that deduced from the renin cDNA. This suggests that the recombinant rat renin is similar to kidney renin in many respects, and is easily obtained by the present procedures.     

肾上腺髓质素及其受体系统抑制溶血磷脂酸诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖

目的观察溶血磷脂酸对肾上腺髓质素及其受体系统生成的影响和肾上腺髓质素在溶血磷脂酸促进血管平滑肌细胞增殖中的作用。方法贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,H3-TdR掺入测定血管平滑肌细胞DNA合成,γ-32P-ATP标记的同位素法测定丝裂原活化蛋白激酶活性,放射免疫法测定血管平滑肌细胞中肾上腺髓质素的含量。结果溶血磷脂酸促进大鼠血管平滑肌细胞肾上腺髓质素生成,上调血管平滑肌细胞肾上腺髓质素及其受体CRLR、RAMP2和RAMP3mRNA表达;肾上腺髓质素可抑制溶血磷脂酸刺激大鼠血管平滑肌细胞3H-TdR掺入,抑制溶血磷脂酸诱导的丝裂原活化蛋白激酶激活。结论溶血磷脂酸上调血管平滑肌细胞肾上腺髓质素及其受体系统,肾上腺髓质素及其受体抑制血管平滑肌细胞增殖的作用与其抑制丝裂原活化蛋白激酶激活有关。     

黄芩苷对脂多糖诱导的巨噬细胞Toll样受体4表达的影响

目的 研究黄芩苷对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞Toll样受体4和其下游信号分子抑制蛋白kB以及效应分子肿瘤坏死因子α表达的影响.方法 分别用脂多糖(终浓度1 mg/L)或脂多糖+黄芩苷(终浓度10、50和100 μmol/L)处理生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7,逆转录聚合酶链反应和Western Blot检测细胞Toll样受体4表达情况和抑制蛋白kB含量变化,酶联免疫吸附法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α的浓度.结果 脂多糖刺激RAW264.7细胞可导致Toll样受体4表达增高,促进抑制蛋白kB降解,上调肿瘤坏死因子α表达;黄芩苷预处理能降低脂多糖诱导的Toll样受体4表达增高,降低抑制蛋白kB降解,下调肿瘤坏死因子α分泌.结论 黄芩苷可通过抑制Toll样受体4表达和降低抑制蛋白kB降解,影响Toll样受体4/抑制蛋白kB-核因子kB炎症信号途径,阻碍炎症因子肿瘤坏死因子α的生成,发挥抗炎作用,这可能是其抗动脉粥样硬化的作用机制之一.     

钙敏感受体在动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞中的表达

目的探讨钙敏感受体在动脉粥样硬化大鼠胸主动脉血管内皮细胞中的表达及其与细胞凋亡的关系。方法 Wistar大鼠144只,随机分为对照组和动脉粥样硬化组,每组72只。动脉粥样硬化早期模型复制首先每千克体重注射维生素D360万单位,然后喂养高脂饲料6周。自动生化仪检测血清甘油三酯、总胆固醇;光镜观察胸主动脉形态学变化;TUNEL染色观察胸主动脉内皮细胞凋亡情况;采用RT-PCR和免疫印迹法分别检测胸主动脉血管内皮细胞中钙敏感受体、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,动脉粥样硬化组细胞凋亡指数以及钙敏感受体、Bax和Caspase-3的表达升高,Bcl-2的表达降低;光镜下可见胸主动脉部分内皮脱落,表面不光滑,中膜平滑肌细胞数目明显增多,排列紊乱。结论钙敏感受体可能参与了主动脉血管内皮细胞的凋亡,进而启动动脉粥样硬化的形成。     

视黄醇类X受体激动剂通过抑制Rac-1蛋白的激活对抗高糖诱导内皮细胞产生的氧化应激反应

目的 探讨视黄醇类X受体激动剂能否对抗高糖环境诱导人血管内皮细胞产生的氧化应激反应及Rac-1蛋白在黄醇类X受体激动荆抗氧化应激过程中的作用.方法 体外培养人脐静脉血管内皮细胞,以葡萄糖(33 mmol/L)干预模拟糖尿病患者体内环境,通过流式细胞学和激光共聚焦显微镜的方法 检测细胞内的活性氧离子水平,化学发光法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性.用GST pull-down和免疫杂交的方法 检测Rac-1蛋白的激活.结果 (1)高糖干预显著增加内皮细胞内活性氧离子水平及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性;(2)Rac-l蛋白抑制剂NSC23766显著降低高糖诱导下内皮细胞活性氧离子的生成及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性;(3)视黄醇类X受体激动剂9顺维甲酸和SR11237显著下调高糖环境下内皮细胞内活性氧离子水平及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性;(4)视黄醇类X受体激动剂9顺维甲酸和SR11237抑制高糖干预对内皮细胞Rac-1蛋白的激活.结论 视黄醇类X受体激动剂通过抑制Rac-1蛋白的激活对抗高糖诱导内皮细胞产生的氧化应激反应.     

Alcohol-Induced Expression of the CD14 Endotoxin Receptor Protein in Rat Kupffer Cells

Gut-derived endotoxins (lipopolysaccharide, LPS) are believed to contribute to alcohol-induced liver disease (ALD) by stimulating Kupffer cells, the resident liver macrophages, to release proinflammatory cytokines. This activation is largely mediated by CD14, a high-affinity membrane-anchored receptor for LPS. We observed, by chemiluminescence-enhanced detection, an increase in immunoreactive CD14 protein in Kupffer cells isolated from rats treated with ethanol for 2 weeks. Immunocytofluorescence experiments confirmed that this increase was confined to the membranes of Kupffer cells from the alcohol-treated rats. The increase was regulated pretranslationally: a 3-fold elevation ( p < 0.01) in the hepatic level of CD14 mRNA was observed. The marked increase in CD14 expression suggests a new mechanism by which alcohol increases the LPS-mediated cytokine signaling by the liver macrophages, thus promoting the interaction between alcohol and endotoxins in the development of liver damage.