应用差异显示技术克隆胶质瘤细胞诱导分化相关基因

目的 克隆胶质瘤细胞诱导分化相关新基因。方法 应用RNA随机引物差异显示，SSCP纯化，PCR产物快速克隆，反Northern杂交及生物信息学分析等方法，观察人脑胶质瘤细胞株SHG－44－9分化过程中的基因表达变化。结果 克隆了诱导分化前后表达差异显著的15个基因，其中诱导后下调基因4个，上调基因11个。同源性分析表明，5个是已知基因，10个是未知基因。诱导后上调的DIG－1基因与c-myc内含子结合蛋白1（MIBP1）基因高度同源，此基因具有转录因子活性，表达的蛋白可抑制c-myc基因的表达。结论 克隆了15个人脑胶质瘤细胞诱导分化相关基因，其中控制c-myc基因表达的MIBP1基因诱导分化后上调提示，它可能是调控胶质瘤细胞分化基因，值得进一步研究。     

神经节细胞胶质瘤恶变及其差异表达基因分析

目的探讨神经节细胞胶质瘤恶性进展的分子变化,为进一步研究分子病因奠定基础。方法取同一患者不断恶化的3次手术标本,行cDNA微阵列检测,分析在不同阶段持续存在的差异表达基因。结果初发(WHO II级)、复发(WHO III级)和再发(WHO IV级)的标本与正常脑组织相比,差异表达基因共19条,其中下调者16条,上调者3条。在下调的基因中,功能明确者有抑制RAF1/MEK/ERKs激酶通路激活的磷酸酰乙醇胺结合蛋白,抑制肿瘤血管增生、侵袭,调控细胞凋亡的碳酰还原酶;抑制c-myc基因表达的肺库否样因子;参与人DNA切除修复的多聚酶ε。结论神经节细胞胶质瘤恶变过程中持续存在的分子变化,以抑制肿瘤增殖基因表达下调为主,其中RAF激酶抑制蛋白、DNA多聚酶ε和碳酰还原酶是参与细胞信号传导和DNA损伤修复等具重要功能的基因,值得进一步研究。     

诺帝诱导人胶质瘤细胞系CHG-5分化的蛋白质表达图谱的建立及差异蛋白质组分析

目的建立诺帝诱导人胶质瘤细胞系CHG-5分化的蛋白质表达图谱并比较其表达差异。方法分别用100μmol/L、200μmol/L诺帝诱导CHG-5细胞分化,观察处理后24h、48h、72h细胞的形态改变;分别提取200μmol/L诺帝处理后的CHG-5细胞和对照组细胞总蛋白,进行双向电泳,所获蛋白表达图谱用PDquest 7.1软件比较其蛋白质表达差异,选取部分高表达的差异蛋白进行质谱分析。结果100pμmol/L和200μmol/L诺帝处理后均可明显诱导CHG-5细胞分化,以72h时细胞分化最为明显。双向电泳发现诱导分化后细胞出现了18个差异蛋白点,其中9个蛋白点表达上调,9个蛋白点表达下调,并获得差异蛋白的分子量、等电点等信息。对其中部分高表达的差异蛋白点成功地进行了质谱鉴定。结论诺帝诱导人胶质瘤细胞系CHG-5分化时蛋白质组改变涉及到细胞增殖、凋亡、基因转录、蛋白表达调控等各个方面。     

体外定向诱导人骨髓基质细胞分化为神经元样细胞三种方法的比较

目的观察比较不同的体外定向诱导培养方法对人骨髓基质细胞(骨髓间充质干细胞)分化为神经元样细胞的影响。方法分离、扩增培养人骨髓基质细胞,分别采用人重组纤维母细胞生长因子(FGF-2)和人重组脑源性神经营养因子(BDNF)、2-巯基乙醇(2-ME)以及硫代甘油(TG)等3种不同的诱导剂,诱导骨髓基质细胞分化为神经元样细胞。用神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学方法对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。结果经3种诱导剂诱导的人骨髓基质细胞均出现神经元样细胞的分化,胞体呈神经元状,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支。免疫组化鉴定显示,诱导分化后的神经元样细胞NSE染色呈阳性,GFAP免疫组化染色均呈阴性,其中FGF-2+BDNF诱导组神经元样细胞分化率为(68.220±5.743)%;2-ME诱导组为(50.700±3.374)%;TG诱导组为(32.240±3.800)%,3组之间差异具有显著性意义(P<0.05)。结论人骨髓基质细胞能够在诱导剂的诱导下发挥横向分化能力,3种体外诱导培养方法均可诱导人骨髓基质细胞分化为神经元样细胞。     

LRIG1、EGFR、E-Cadherin及N-Cadherin在胶质瘤中表达及其临床意义

目的研究富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)、表皮生长因子受体(EGFR)、ECadherin及N-Cadherin在不同病理级别胶质瘤中表达差异,探讨LRIG1在胶质瘤恶性进展中可能的作用机制。方法收集74例胶质瘤患者手术标本,包含12对原发及复发配对胶质瘤标本,采用qRT-PCR检测LRIG1、EGFR、E-Cadherin、N-Cadherin基因的表达,并采用免疫印迹检测LRIG1、EGFR、E-Cadherin、NCadherin、Vimentin蛋白表达情况。结果随着胶质瘤病理级别的升高,LRIG1、E-Cadherin基因及蛋白表达水平降低,EGFR、N-Cadherin基因及蛋白表达水平升高,差异均具有统计学意义(均P0.05)。WHOⅢ-Ⅳ组胶质瘤EGFR/LRIG1及N-Cadherin/E-Cadherin比值显著高于WHOⅠ-Ⅱ组(均P0.05)。EGFR/LRIG1与NCadherin/E-Cadherin变化之间存在正相关(r=0.56,P0.05)。对原发及复发配对胶质瘤标本的研究结果与上述一致。结论胶质瘤中EGFR/LRIG1表达失衡,可能通过诱导上皮间质转化(EMT)促进胶质瘤细胞的恶性进展。LRIG1可能成为胶质瘤治疗的新靶点。     

circRNA ZNF609靶向miR-512-5p调控胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子机制研究

目的 探讨circRNA ZNF609影响胶质瘤细胞恶性生物学行为的可能机制。方法 (1)收集35例胶质瘤患者手术切除的肿瘤标本(胶质瘤组)及7例颅脑外伤患者的脑组织标本(对照组)，RT-qPCR法检测组织中环状RNA(circRNA)ZNF609与微小RNA(miR)-512-5p表达量；(2)正常胶质细胞(HEB)为对照，RT-qPCR法检测胶质瘤细胞系(LN18、SW1088和Hs683)中circRNA ZNF609与miR-512-5p表达量；(3)胶质瘤LN18细胞，分别转染circRNA ZNF609小干扰RNA(siRNA)、miR-512-5p模拟物、或共转染circRNA ZNF609小干扰siRNA与anti-miRNA-512-5p后，用MTT法、流式细胞术、Transwell法分别检测LN18细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭；Western blot法检测细胞中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和cleaved-caspase-3蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证circRNA ZNF609与miR-512-5p的调控关系。结果 与对照组比较，胶质瘤组circ...     

槐定碱抑制人胶质瘤U87MG细胞株增殖及其作用机制研究

目的探讨槐定碱抑制人胶质瘤U87恶性胶质瘤(U87MG)细胞株增殖作用及其相关机制。方法将各个浓度的槐定碱加入到人胶质瘤U87MG细胞株中,应用四唑氮盐比色法测定槐定碱对肿瘤细胞生长的抑制作用,流式细胞仪测定槐定碱对U87MG细胞凋亡和细胞周期的变化,生化检验测定肿瘤细胞内活性氧簇(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法分别检测肿瘤相关基因mRNA表达和蛋白表达的变化,荧光素酶报告基因法检测肿瘤细胞中泛素-蛋白酶体、叉头盒蛋白M1(FoxM1)、核转录因子kappa B(NF-kb)、激活子蛋白-1(AP-1)的活性的变化。结果槐定碱能够显著抑制细胞增殖,阻滞细胞周期在G2/M期;诱导细胞凋亡,引起ROS产生和GSH含量减少;促使p27、周期蛋白依赖性激酶2、Survivin、Livin、B淋巴细胞瘤-2、E2启动子结合细胞因子1等基因表达下调,同时上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/8、p53、线粒体来源的第2个半胱氨酸蛋白酶激活剂、c-Jun氨基末端激酶和p38-丝裂原活化蛋白激酶等基因的表达;显著抑制泛素-蛋白酶体活性和FoxM1、NF-kb、AP-1的转录活性。结论槐定碱可能通过诱导细胞凋亡和ROS积聚,激活线粒体信号通路来发挥抗肿瘤活性。槐定碱能够作为一种新的药物来治疗胶质瘤。     

脑胶质瘤中pRb表达与CDK_4、MTS基因异常的相关性研究

目的　探讨脑胶质瘤中CDK4 、MTS基因异常及pRb表达改变与脑胶质瘤发生发展的相关性。方法　应用PCR SSCP、分子杂交及免疫组化技术检测 6 8例不同病理分级脑胶质瘤。结果　p16基因表达阴性或pRb无表达或CDK4 扩增多为单独发生 ,其中III IV级肿瘤中pRb、p16蛋白失表达或p15基因缺失或CDK4 基因扩增的综合发生率为 89% (4 2 / 47)。结论　脑胶质瘤中细胞生长周期“关卡”蛋白p16、pRb、或CDK4 单因素的异常比交错并发的改变更为常见 ,p16、pRb失活或CDK4 扩增的任一改变 ,即可能破坏细胞增殖的正常调控 ,促发脑胶质瘤细胞的癌性增殖或恶性演变     

IDH1/2突变诱导脑胶质瘤基因组高甲基化及肿瘤细胞分化阻滞

目前异柠檬酸脱氢酶1/2(isocitrate dehydrogenase1/2,IDH1/2)基因突变在脑胶质瘤的致瘤机制还未彻底阐明,但一系列研究提示突变IDH1/2能诱导脑胶质瘤基因组和组蛋白高甲基化,这些表观遗传改变会影响分化相关基因的表达,导致肿瘤细胞分化程度降低,出现恶性表型。同时以突变IDH1/2为抑制靶点的小分子药物能促进肿瘤细胞分化,表现出一定的治疗作用。本文对该方向上的研究进展作一系统综述,期望能为脑胶质瘤的治疗提供一条新思路。     

胶质瘤中EGFR扩增、过表达及其与肿瘤增殖关系的研究

目的探讨表皮生长因子受体（EGFR）在胶质瘤中扩增、过表达及其在肿瘤增殖中的作用机制。方法应用SP免疫组化法、RT—PCR、Southern印迹法检测6例正常脑组织、50例不同级别胶质瘤及2个体外胶质瘤细胞系中在EGFR蛋白水平、mRNA水平、DNA水平的表达及扩增情况，以及与肿瘤增殖活性的相关性。结果不同级别的胶质瘤中，表达与扩增程度不同，Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级肿瘤之间比较具有显著性差异：EGFR过表达与Ki-67在胶质瘤中的表达呈正相关．而EGFR过表达与扩增并不一致。结论EGFR过表达与胶质瘤的增殖活性增高有密切相关性，推测EGFR过表达是肿瘤进展中的早期事件而非进展期事件。     

促肾上腺皮质激素释放因子受体1在人脑胶质瘤中表达及其临床意义

目的探讨促肾上腺皮质激素释放因子受体1(CRFR1)在人脑胶质瘤中表达及其临床意义。方法随机收集35例临床手术切除胶质瘤组织标本及培养人类胶质母细胞瘤株U87,进行CRFR1免疫组化染色,以5例泌乳素垂体腺瘤组织标本作为阳性对照。检测胶质瘤组织中增殖细胞核抗原(PCNA)表达。同时,分析CRFR1表达与临床病理因素之间的相关性。结果 CRFR1着色于肿瘤细胞膜,在不同类型、级别的脑胶质瘤中均有着色,且随肿瘤病理级别增高而表达增高,差异有统计学意义(P<0.05);胶质母细胞瘤中存在U87、CRFR1和PCNA高表达;CRFR1表达与患者KPS评分及PCNA表达有关。结论 CRFR1在胶质瘤细胞发生、增殖及侵袭性生长过程中可能扮演了重要角色,对胶质瘤恶性生物学特性的作用机制需要进一步探讨。     

Ezrin expression in tissue microarray of primary and recurrent gliomas

Malignant progression, infiltrative growth pattern and recurrencies after surgery are characteristic features of diffuse gliomas. Ezrin is a membrane-cytoskeleton linker protein expressed in several types of neoplasms. In experimental models, increased ezrin expression correlates with invasion of malignant glioma cells. We studied ezrin expression and its correlation with patient survival in 229 primary and recurrent astrocytomas (WHO grades II–IV), oligodendrogliomas (II–III) and oligoastrocytomas (II–III) of 113 patients. Ezrin expression as evaluated by immunohistochemistry and immunoblotting was detected in all studied glioma types. Staining intensity and number of immunoreactive cells correlated with increasing malignancy of astrocytomas and oligoastrocytomas ( P =  0.001). Ezrin expression was strongest in astrocytomas ( P =  0.006). Also oligodendrogliomas were positive for ezrin. High ezrin expression in primary gliomas correlated with shorter time to recurrence ( P <  0.05) and poor overall survival ( P <  0.05) of the patients. Ezrin expression increased during progression of the tumours ( P <  0.05). However, ezrin was not an independent prognostic factor. The results of this study show that ezrin expression is associated with progression of gliomas and correlates with histological cell type and WHO tumour grade.     

人脑胶质瘤中CCND1基因的转录与表达

目的检测和分析人脑胶质瘤中CCND1基因的转录与表达,及其对肿瘤发生、发展的生物学意义.方法采用免疫组化、原位杂交法检测52例人脑胶质瘤及8例正常人脑组织中Cyclin D1 mRNA蛋白以及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平.结果脑胶质瘤中CD1蛋白及mRNA呈过度表达,其标记指数和阳性率随肿瘤的恶性程度增高而增加.两者的标记指数之间、以及与PCNA标记指数之间均为显著正性相关.结论人脑胶质瘤中CCND1过度转录和表达,随胶质瘤临床病理分级增加而增高,同时与肿瘤细胞增殖状态密切相关,提示CCND1基因的异常转录和表达在胶质瘤的发生与发展中起着重要的促进作用.     

Notch1 expression is upregulated in glioma and is associated with tumor progression

Notch signaling plays a complex role in human malignancies. It can affect cell proliferation, differentiation and apoptosis either positively or negatively, depending on cell type. In the present study we measured the expression of Notch1 in clinical glioma specimens and investigated a possible association between Notch1 expression and World Health Organization grade. Ninety-eight gliomas plus adjacent normal tissue and 26 specimens of normal control tissue were collected, and expression of Notch1 mRNA and protein were assessed using quantitative real-time polymerase chain reaction, western blot and immunohistochemical analysis. We found that Notch1 mRNA and protein were expressed at higher levels in gliomas than in the adjacent tissue or in control brain tissue (p < 0.05). Moreover, expression of Notch1 was closely associated with glioma progression, since expression levels increased from grade I to grade IV disease (p < 0.05). Notch1 expression was also significantly associated with Karnofsky performance scale (KPS) score: Notch1 expression was significantly higher in patients with a lower KPS score (p < 0.05). These findings confirm that Notch1 expression is upregulated in glioma and suggest it is related to tumor progression. If Notch1 plays an important oncogenic role in glioma progression, it may be a potential diagnostic and therapeutic target.     

非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶12基因在脑胶质瘤中的表达及意义

目的基于中国脑胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)和癌症基因组图谱计划(TCGA)数据库分析非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶12基因(PTPN12)在脑胶质瘤中的表达和意义。方法回顾性分析CGGA数据库(325例)和TCGA数据库(636例)中脑胶质瘤患者的临床资料和RNA测序数据。分析不同世界卫生组织(WHO)肿瘤级别、四分型亚型、异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变状态、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子甲基化状态的患者PTPN12表达量的差异。根据PTPN12的表达量将患者分为PTPN12高表达组和PTPN12低表达组,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,比较两组患者的生存差异。采用单因素和多因素Cox回归分析法判断PTPN12对脑胶质瘤患者的预后作用。进一步通过基因本体(GO)功能富集分析及京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析获得基因相关的功能以及有关的通路。结果两数据库中,PTPN12的表达量均随脑胶质瘤病理级别的升高而升高(均P<0.01);与IDH突变型比较,IDH野生型中PTPN12表达量升高(均P<0.01);MGMT启动子非甲基化者PTPN12表达量高于MGMT启动子甲基化者(均P<0.01);PTPN12在经典型、间质型、神经元型以及前神经元型中表达量的差异均具有统计学意义,间质型中表达量最高(均P<0.01)。两数据库中,PTPN12高表达者均比低表达者的生存期短(均P<0.01)。两个数据库中,多因素Cox回归分析结果均显示,PTPN12表达量为脑胶质瘤患者生存期的独立影响因素(CGGA数据库中,HR=1.433,95%CI:1.094~1.876,P=0.009;TCGA数据库中,HR=1.588,95%CI:1.018~2.477,P=0.042)。GO分析结果显示,PTPN12表达量正相关的基因更多地富集在增殖、凋亡、黏附、蛋白水解、免疫反应、血管生成、药物反应、缺氧反应、肿瘤细胞G2/M期的转化、肿瘤细胞G1/S期的转化等多个与脑胶质瘤恶性进展相关的功能上。KEGG分析结果显示,与PTPN12表达量呈正相关的基因更多地富集在肿瘤相关通路、PI3K-Akt通路、丝裂原活化蛋白激酶通路、肿瘤坏死因子通路、缺氧诱导因子1通路、p53通路、凋亡通路以及细胞周期通路上。结论不同WHO肿瘤级别的脑胶质瘤患者PTPN12表达量不同,PTPN12表达量可独立用于脑胶质瘤患者的预后判断,且与多个脑胶质瘤恶性进展相关的功能和通路有关。     

人脑胶质瘤中ATM、ATR、Chk1和Chk2基因表达研究

目的 研究ATM、ATR、Chk1和Chk2在人脑胶质瘤中的表达及其与肿瘤发生的关系. 方法 采用SYBRTM Green实时定量PCR技术检测35例人原发脑胶质瘤组织和10例正常脑组织中的ATM、ATR、Chk1和Chk2的表达水平. 结果 ATR、Chk1和Chk2基因在各级脑胶质瘤中表达较正常脑组织升高,差异均有统计学意义(P<0.05).其中,ATR和Chk2基因表达在Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤组织之间差异均无统计学意义(P0.05),而Chk1,在Ⅳ级胶质瘤中的表达较Ⅱ级、Ⅲ级胶质瘤明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05).ATM基因表达量在正常脑组织和各级脑胶质瘤中差异无统计学意义(P0.05). 结论 ATR、Chk1和Chk2在人脑胶质瘤中表达上调,说明这些基因可能与人脑胶质瘤的发生有关.其中,Chk1表达与肿瘤恶性程度有关.可作为判别胶质瘤病理级别的辅助指标.     

LAT1表达与人脑胶质瘤病理级别、增殖和血管形成的关系

目的探讨大型氨基酸转运载体1(LAT1)在人脑胶质瘤组织中的表达水平及其与胶质瘤病理学特征、细胞增殖以及血管形成的关系。方法采用免疫组化方法检测LAT1、Ki-67和CD34在62例人脑胶质瘤组织中的表达,计算Ki-67标记指数(Ki-67 LI)和微血管密度(MVD)。结果LAT1在胶质瘤中高表达,其免疫阳性染色既定位于瘤细胞也定位于血管内皮;LAT1表达随胶质瘤病理级别升高而明显增强(P=0.000),在高恶性度胶质瘤中LAT1表达明显强于低恶性度胶质瘤(P=0.002);LAT1表达与胶质瘤Ki-67标记指数(P=0.003)和微血管密度(P=0.000)都存在明显正相关。结论 LAT1与胶质瘤的发生和发展关系密切,可能在胶质瘤的恶性增殖和血管形成中发挥重要作用。