PCR介导的ret基因体外定点突变

目的:利用PCR技术介导ret基因cDNA上第2 753位碱基的体外定点突变.方法:利用PCR技术进行定点突变,采用Dpn Ⅰ进行原始模板消化.经Amp抗性、PCR技术初步筛选,通过序列分析进行确证.结果:Amp抗性及PCR筛选结果均为阳性;序列分析提示,2 753处碱基由T→C.结论:成功完成了ret基因的体外定点突变.     

利用定点突变技术构建血型糖蛋白Ac末端突变体

目的 构建血型糖蛋白A(Glycophorin A)c末端突变体,为GPAc末端与阴离子交换蛋白1(Anion Exchangerl,AE1)酸性c端域相互作用位点研究奠定基础。方法 以pM-GPA-Ct为基础质粒,利用TransformerTM定点突变技术,构建GPAc末端突变体pM-GPA-L118F、pM-GPA-S119R。结果 经过测序证实突变成功。结论 本实验成功构建了GPAc末端的突变体,并证实TransformerTM定点突变方法具有简便、突变效率高等优点,是体外构建突变体的有效方法。     

重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

目的：基于重叠延伸PCR (SOE PCR)技术构建转录因子EB (TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法：根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物Fn和Rn进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的 DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用Bam HⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E. coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果：第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段...     

重组PCR快速基因定点突变的技术方法

聚合酶链式反应(PCR)是由Mullis等联合研制的一种在体外快速对特定DNA序列扩增的技术[1]。本研究通过重组PCR技术对growth associated protein-43(GAP-43)基因Ser41(丝氨酸)AGC定点突变为Ala41(甘氨酸)GCC,此方法比传统的体外基因突变技术更简单、快速而且经济。1材料和方法1.1     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

寡聚脱氧核苷酸介导的体外定点突变校正VEGFcDNA

目的：对由ＰＣＲ扩增的血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ１６５）ｃＤＮＡ编码Ｎ－２４位氨基酸错误配对的密码子ＡＣＧ（应为ＡＧＣ丝氨酸）进行校正。方法：用一个化学合成的寡聚脱氧核苷酸片断作为诱变引物对ＶＥＧＦ１６５）ｃＤＮＡ编码Ｎ－２４位氨基酸错误配对的密码子进行体外定点突变。转化子经打点杂交及温度梯度洗膜，筛选出突变子，再ＤＮＡ序列分析。结果：ＶＥＧＦ１６５ｃＤＮＡ编码Ｎ－２４位氨基酸错误配对的密码子变为ＡＧＣ（丝氨酸）。结论：该突变方法可靠，省时，实用。     

PCR介导的定点突变与随机突变的应用

蛋白质的结构与其功能之间的关系是蛋白质组学研究的重点内容之一。体外突变技术是研究这种复杂关系的有力工具．也是实验室中改造／优化基因常用的手段。定点突变技术可对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入;随机突变则可在特定编码序列的多个位点上产生随机的突变体。我们现介绍两种在实验中总结出来的用PCR方法对克隆化DNA进行定点突变和随机突变的技术。     

应用改良PCR法构建高GC含量启动子多位点定点突变载体

目的利用StrataGene公司的QuickChangeTM定点突变试剂盒对高GC含量的人肝刺激因子启动子进行多位点定点突变。方法采用含有多位点突变的引物扩增启动子片段,通过加入不同浓度的DMSO,降低高GC含量模板及引物的解链温度,利用乙醇沉淀提高酶切产物的浓度。结果经测序鉴定成功构建5个含有不同突变位点的hHSS启动子突变载体。结论这种改良的PCR方法提高了对高GC含量启动子进行扩增的效率,具有快速、简便、经济、成功率高的特点,是值得推广的多位点定点突变载体构建方法。     

PDIP1基因定点突变的研究

目的将DNA聚合酶δ相互作用蛋白1(PDIP1)编码序列562位碱基T突变为G。方法利用定点突变PCR对PDIP1编码序列进行定点突变,然后将PCR定点突变产物和pGEX-4T-2载体经EcoRⅠ与SalⅠ酶切,再利用连接酶将它们定向连接起来形成pGEX-4T-2-PDIP1重组质粒,转化E.coli DH5α感受态,对所得重组质粒进行酶切和测序。结果第1轮和第2轮PCR都得到了预期大小的扩增片段,重组质粒经酶切也得到预期大小的片段,测序结果表明已成功将PDIP1编码序列第562位碱基T突变为G。结论利用PCR定点突变是基因点突变的一种简单实用的好方法。     

用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原基因中的突变

目的：利用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）基因中的突变碱基。方法：针对构建的重组质粒PGEM-7Z／HBcAg中的两处突变设计三对引物,PCR定点突变后对重新构建的PGEM-7Z／HBcAg进行菌落PCR和酶切鉴定,初步筛选的阳性克隆进一步通过序列分析进行确证。结果：经PCR定点突变后,测序证明HBcAg基因序列与设计完全一致。结论：用该方法成功纠正了人工合成的乙肝病毒核心抗原基因中两个碱基的缺失,获得了预期的目的基因。     

人脑源性神经营养因子基因的定点突变

应用寡核苷酸诱导的定点突变和ＰＣＲ技术对人脑源性神经营养因子基因进行突变，并完成了测序鉴定。为今后对脑源性神经营养因子结构与功能的研究奠定了基础     

人胰岛素原基因突变体的构建

目的　完成人胰岛素原基因的定点突变 ,使之能在普通细胞中被Furin蛋白酶识别去除C肽分泌成熟胰岛素。方法　采用PCR体外定点突变技术 (PCRsite directedmutagenesis ,PCR SDM) ,设计 4对引物 ,引入 5个Furin识别的突变位点 ,通过重叠延伸法PCR扩增 ,使人胰岛素原编码基因B10密码子由CAC突变为GAC ;C3密码子由GAA突变为AAA ;C4密码子由GCT突变为CGT ;C3 2密码子由CTT突变为CGT ,将扩增片段克隆入T载体并测序。结果　DNA测序结果表明在预期位点突变符合要求。结论　应用PCR诱导突变技术 ,在体外能准确、简便有效的诱导胰岛素原基因突变 ,使体外应用非内分泌细胞构建高效分泌成熟胰岛素的细胞克隆成为可能。     

可溶性Ⅰ型补体受体活性区基因的突变修正

目的：修正可溶性Ⅰ型补体受体（ｓＣＲ１）过程中造成的碱基突变,保证基因序列氨基酸编码的准确性,为蛋白表达和基因转染打下基础。方法：采用掺尿苷寡聚核苷酸介导的定点突变法,对ｓＣＲ１活性区基因中错配的碱基加以修正,用点杂交方法筛选突变子阳性克隆,测序鉴定。结果：４０℃洗膜,放射自显影示除阴性对照和１个样品外,阳性对照和其余１９个克隆均显阳性黑斑;５６℃洗膜,放射自显影示５个样品为阳性。阳改天我隆测序结     

PCR方法检测生殖道人乳头瘤病毒

目的：探讨生殖道人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）对宫颈糜烂的影响及摸索最佳的ＰＣＲ反应条件。方法：应用通用引物介导聚合酶链反应法（ＧＰ－ＰＣＲ）检测宫颈脱落细胞中ＨＰＶ。结果：健康人５０例,宫颈糜烂患者３４例,ＨＰＶ阳性检出率分别为２２．０％和４７．２％,两者差异显著（Ｐ＜０．０５）。结论：ＧＰ－ＰＣＲ方法检测ＨＰＶ具有敏感、特异、便捷、快速、可靠、经济的特点,为病毒感染早期快速诊断及流行病学研究提供了科学的方法。     

沙门菌PCR检测技术应用进展

沙门菌是引起食物中毒的主要致病菌之一,其传统检测方法包括选择性培养、生化鉴定等步骤,耗时长、灵敏性差,很难满足快速检测要求。聚合酶链反应（PCR）技术是近年来广泛应用于食品中沙门菌快速检测的方法之一,其检测目的基因多种多样,主要包括属特异性引物基因、血清群特异性引物基因与血清型特异性引物基因。本文主要概述PCR技术应用于沙门菌检测的各种目的基因,并简要介绍常规PCR、多重PCR及实时定量PCR等技术的应用。     

多重聚合酶链反应检测麻疹和风疹病毒感染的研究

用多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测２１份临床疑似麻疹患者的血清和咽拭子标本中麻疹病毒和风疹病毒,其中麻疹阳性９份,风疹阳性６份,ＩｇＭ－ＥＬＩＳＡ检测麻疹ＩｇＭ抗体阳性３份,麻疹ＰＣＲ检测阴性,而风疹ＰＣＲ检测证实为风疹病毒,该法不仅简便,敏感,特异的区别麻疹和风疹病毒感染,而且为消灭麻疹野病毒监测提供了检测手段。     

选择性聚合酶链反应检测 2.2.15 细胞内HBV cccDNA

0 引言1986年美国Sells等(The Mount Sinal Medical Center)将HB V基因转染到人肝癌细胞(HepG2)中,获得了能表达HBV标志的细胞株2.2.15细胞,并以此作为模型筛选抗HBV的药物,进行基因结构及功能的研究. 然而HBV在2.2.15细胞中复制方式与自然感染的肝细胞有何不同,有无HBV 的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)存在, 各学者说法不一[1.2],我们应用选择性PCR技术,检测了2.2.15细胞内的HBV cccD NA,现简报如下.     

人肝细胞生长因子mRNA实时荧光PCR定量标准的构建

目的:构建实时荧光定量PCR(FQ-PCR)标准以定量检测人肝细胞生长因子mRNA的表达.方法:采用RT-PCR法利用肝组织提取的总RNA制备肝细胞生长因子cDNA目的片段.与pGEM-TEasy Vector连接成重组质粒并转化E.coli DH5α.联合用直接PCR、α互补和氨苄青霉素筛选法、EcoRI限制性酶切和序列分析法鉴定其特异性.测定纯化的重组质粒A260,确定浓度并以此制备FQ-PCR梯度浓度参考标准.结果:HGF cDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性.结论:成功构建了实时FQ-PCR定量参考标准.     

应用聚合酶链反应对病毒性心肌炎病毒学诊断的意义

为探讨聚合酶链反应在柯萨基Ｂ组病毒对病毒性心肌炎病原学的诊断意义。对４１例诊断为急性病毒性心肌炎的住院病，用ＰＣＲ方法检测基血中的柯萨基Ｂ组病毒，并对 中２９例病人进行了潘生丁＾９９ｍＴ２ＭＩＢＩ心肌灌注显像。