病毒性肝炎核酸疫苗研究的现状与问题

核酸疫苗又称ＤＮＡ疫苗 ,是指将含有编码某种目的抗原蛋白基因序列的真核细胞表达质粒作为疫苗 ,直接接种机体 ,在体内合成抗原蛋白 ,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答 ,达到免疫的目的。乙肝ＤＮＡ疫苗的抗原基因片段 ,主要是编码表面抗原的Ｓ区 ,也可包括ｐｒｅＳ1 、ｐｒｅＳ2 区。此外 ,Ｇｅｉｓｓｌｅｒ等〔1〕将包含ｐｒｅＳ1 、ｐｒｅＳ2 的Ｓ区基因以及ＨＢｃＡｇ编码基因的重组质粒接种小鼠 ,诱导产生了高滴度抗 -ＨＢｓ及抗 -ＨＢｃ。93 %的小鼠产生了强烈的对病毒蛋白的ＣＤ4+ Ｔ细胞介导的体液免疫的ＣＤ8+ Ｔ细胞介导的Ｃ…     

细胞因子作为DNA疫苗基因佐剂的研究进展和探索

20世纪90年代以来,伴随着基因治疗技术的发展,产生了一种新型疫苗———DNA疫苗,又称核酸疫苗。DNA疫苗就是运用克隆技术把编码某种特异抗原的外源基因连接到真核表达载体上,利用重组的质粒DNA免疫机体,使外源基因在活体内表达。抗原基因刺激机体的免疫系统后,能够诱导特异性的免疫反应,促进中和抗体的产生,并且活化杀伤细胞活性,促进巨     

增强核酸疫苗免疫应答的策略及方法

核酸疫苗又称DNA疫苗,是指将编码某种目的抗原蛋白的外源基因插入真核细胞表达质粒,直接导入动物体细胞内,并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,从而达到预防和治疗疾病的目的.核酸疫苗不仅能刺激机体产生特异性的体液免疫,还能诱导产生特异性的具有细胞毒杀伤性功能的CTL效应（细胞免疫）,并可直接清除带有目的抗原的靶细胞,因此对病毒、细胞内寄生的细菌和寄生虫所引起的传染病具有广阔的治疗前景[1-6].     

肿瘤基因疫苗的研究进展

基因疫苗（genetic vaccine）又称核酸疫苗或DNA疫苗,是将编码某种抗原的基因片段克隆到真核表达质粒,再用该质粒免疫动物,抗原编码基因在宿主体内表达,刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答。首次发现基因疫苗是在1990年,Wolf等偶然发现在小鼠肌肉组织内注射质粒DNA后，质粒及其携带的基因被小鼠肌细胞摄取,并在肌细胞内进行表达,小鼠可对此外源蛋白产生专一的免疫反应，他们提出这一发现可用于疫苗研究。之后基因疫苗受到了广泛的关注，并且发展迅速。基因疫苗在肿瘤方面的应用取得了很大进展,它具有安全、有效、制备容易、保存运输方便等优点，因而受到广泛重视,发展前景良好。     

TCR独特型DNA疫苗诱导抗淋巴系统肿瘤免疫反应的实验研究

本研究观察ＴＣＲ独特型ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠抗肿瘤免疫反应的情况。用ＣＥＭ淋巴瘤细胞系和ＢＡＬＢ／ｃ小鼠作模型,ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＣＥＭ系特异性重排的ＴＣＲ Ｖβ基因,克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中作为ＤＮＡ疫苗。用肌内注射法免疫小鼠,间接免疫荧光法检测小鼠抗体生成和用ＭＴＴ法测定ＣＴＬ活性以检测抗独特型的细胞免疫。结果发现,接种ＤＮＡ疫苗后第４周开始小鼠血清中即可检测到特异性抗独特型抗体     

表达新疆出血热病毒S基因片段的重组腺病毒特异性CTL功能测定

目的通过表达新疆出血热病毒(XHFV)S基因片段的重组腺病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能测定,探求由XHFVS基因片段编码的核衣壳蛋白作为抗原诱导的特异性CTL细胞对重组腺病毒致敏的靶细胞杀伤能力大小。方法PCR扩增XHFVS基因的cDNA片段,将扩增后的cDNA片段克隆入腺病毒自主载体,使其成为重组腺病毒,用重组腺病毒感染Balb/c小鼠后,利用非放射性乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定重组腺病毒的特异性CTL功能。结果在一定比例范围内,效应细胞与靶细胞的比例越高,特异性CTL%越高。结论由XHFVS基因片段编码的核衣壳蛋白抗原诱导的特异性CTL细胞,能特异性地杀伤重组腺病毒致敏的靶细胞;证实由腺病毒自主载体本身所表达的一些蛋白质也可诱导细胞免疫,由该载体所引发的细胞免疫对疫苗接种不利。     

肿瘤治疗性疫苗研究进展

肿瘤治疗性疫苗与其它治疗肿瘤的方法不同,它通过激活机体自身的免疫系统来达到治疗肿瘤的目的,从而具有高度特异性。近年来,肿瘤的治疗性疫苗,尤其是肿瘤细胞疫苗、基因工程疫苗、多肽疫苗和基因疫苗的研究,都取得了可喜的进展。其激活机体的特异性ＣＴＬｓ、产生抗肿瘤的保护性免疫应答的作用在动物实验中已得到肯定;多种疫苗已进入临床试验阶段,是一种有着广阔应用前景的肿瘤免疫治疗方法。     

风疹病毒E1基因的克隆及原核表达

目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a（＋）,并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达。结果成功扩增出399bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。     

表达新疆出血热病毒S基因片段的重组腺病毒特异性CTL功能测定

目的 通过表达新疆出血热病毒（XHFV）S基因片段的重组腺病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）功能测定，探求由XHFVS基闪片段编码的核衣壳蛋白作为抗原诱导的特异性CTL细胞对蓖组腺病毒致敏的靶细胞杀伤能力大小。方法 PCR扩增XHFVS基因的cDNA片段，将扩增后的cDNA片段克隆入腺病毒自主载体，使其成为重组腺病毒，用重组腺病毒感染Balb／C小鼠后，利用非放射性乳酸脱氰酶（LDH）释放法测定重组腺病毒的特异性CTL功能。结果 在一定比例范围内，效应细胞与靶细胞的比例越高，持异性CTL％越高。结论 由XHFVS基因片段编码的核衣壳蛋白抗原诱导的特异性CTL细胞，能特异性地杀伤重组腺病毒致敏的靶细胞；证实由腺病毒自主载体本身所表达的一些蛋白质也可诱导细胞免疫，由该载体所引发的细胞免疫对疫苗接种不利。     

脂质体介导HBcAg基因转染人树突状细胞的实验研究

目的通过脂质体介导乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因转染人体内专职抗原提呈的树突状细胞(DC)的方法,使HBcAg基因在树突状细胞中表达,构建树突状细胞疫苗。方法分离健康人外周血单个核细胞,在粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)的诱导下培养DC。在培养的第5天,应用脂质体PEI介导将含有编码HBcAg 基因的质粒(pJW4303／HBc)转染入DC,再以免疫印迹技术(Western-Blotting)验证其表达产物。结果经以质粒pJW4303 为真核表达载体的HBcAg目的基因转染后的树突状细胞有效表达了HBcAg抗原。结论经该方法转染后的DC目的基因可有效表达HBcAg,为以DC为基础的免疫治疗奠定了新的基础。     

SARS-CoV S蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的:克隆表达SARS-CoVS蛋白,构建SARS全长基因疫苗。方法:从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoVS1和S2蛋白的编码序列,再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western检测S蛋白的表达。结果:PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段,两片段插入pVAX1构建重组表达载体后,经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞,收集细胞总蛋白,Western检测获得特异蛋白带。结论:成功克隆并表达了SARS-CoVS蛋白,为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

人SART 3基因疫苗对荷瘤小鼠的免疫杀伤作用

目的研究表达人T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3（SART3）基因的DNA疫苗在小鼠体内对表达该基因肿瘤细胞的免疫杀伤作用。方法构建表达人SART3基因的C3H小鼠骨肉瘤细胞LM8-SART3，将其接种到C3H小鼠成瘤，比较疫苗治疗组和空载体对照组中肿瘤的生长情况，取小鼠淋巴细胞检测免疫反应活性并行病理切片镜下比较。结果荷瘤小鼠经疫苗注射后肿瘤生长延缓，免疫反应活性与淋巴细胞数量有关，镜下可见肿瘤细胞坏死并淋巴细胞浸润。结论表达人SART3基因的DNA疫苗能诱导小鼠免疫杀伤肿瘤细胞，抑制表达该基因的肿瘤细胞在小鼠体内生长。     

SARS-CoVS蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的：克隆表达SARS-CoVS蛋白，构建SARS全长基因疫苗。方法：从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1和S2蛋白的编码序列，再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western检测S蛋白的表达。结果：PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段，两片段插入pVAX1构建重组表达载体后，经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoVs蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

DNA疫苗的研究进展

自英国乡村医生Jenner用牛痘疫苗预防天花取得成功以来，疫苗作为一种有效的免疫预防剂在临床应用已有200多年历史。20世纪九十年代，Wolff等偶然发现给小鼠肌注编码基因的重组质粒(细菌染色体以外的环状双链DNA)后，可在体内检测到编码蛋白，同时诱导机体产生了特异性免疫     

日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj26GST)疫苗的构建及鉴定

目的 构建日本血吸虫重组两歧双歧杆菌（pGEX-Sj26GST）疫苗,并对其进行鉴定.方法 采用RNeasy Mini试剂盒提取日本血吸虫成虫总RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得Sj26GST抗原编码基因;将该编码基因与pGEX-1λT载体进行连接,得到重组质粒pGEX-Sj26GST,并对其进行双酶切鉴定;将重组质粒电转化入两歧双歧杆菌中,构建重组两歧双歧杆菌（pGEX-Sj26GST）疫苗,PCR鉴定疫苗.结果 RT-PCR扩增出的日本血吸虫成虫Sj26GST基因片段长度为676 bp;双酶切证实Sj26GST抗原编码基因成功插入pGEX-1λT载体中;PCR证实从重组两歧双歧杆菌疫苗中扩增出长度为676 bp 的Sj26GST基因片段.结论 成功构建了日本血吸虫重组两歧双歧杆菌（pGEX-Sj26GST）疫苗.     

日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号蛋白的真核表达

目的从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出信号蛋白Sj14-3-3编码基因，并亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1( )，旨在制备重组诊断抗原和分子疫苗。方法提取日本血吸虫成虫总RNA，分离mRNA，RT-PCR法制备cDNA．并扩增出Sj-4-3-3编码基因，通过线性TA克隆载体pGEM-T连接，亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1( )，经转染至COS-7细胞中表达，Western blotting鉴定。结果RT-PCR产物、pGEM-T-Sj14-3-3及pcDNA3．1( )-Sj14-3-3分别经双酶切后均获得一特异性基因片段，经SDS-PAGE及Western blotting鉴定后的分子量为29kD。结论真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-Sj14-3-3在COS-7细胞中的表达产物是一分子量为29kD的蛋白，并能被抗Sj14-3-3单克隆抗体识别。     

人ICA69基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达与应用初探

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达国人胰岛细胞自身抗原69kd蛋白（hICA69)，获得足量的、可供实验研究的ICA69抗原，用于I型糖尿病的早期诊断和联合筛查。方法：用PCR法扩增出编码hICA69的cDNA片段，直接克降到pSPORT1质粒上，经DNA序列测定后，再插入到GST融合蛋白表达载体pGEX-2T的EcoRI和SmaI位点之间，构成重组质粒p25-hICA69,将此质粒导入大肠杆菌，经IPIG诱导后获得GST-hICA69融合蛋白的表达产物，用间接ELISA法检测100例正常人和30例I型糖尿病人血清中抗ICA69抗体。结果：所获PCR产物经序列分析确证为1449bp，编码483个氨基酸，并正确地重组到pGEX-2T表达型质粒中，其在原核细胞中表达的融合蛋白具有免疫原性，并能应用于I型糖尿病病人血清中抗ICA69抗体的检测。结论：运用基因工程技术获得的表达产物的重组ICA69抗原。这一抗原的获得，将有助于提高I型糖尿病的预报率和确诊率。     

HA-1树突状细胞核酸疫苗的构建及其特异性CTL的诱导

本研究以次要组织相容性抗原HA-1为靶点，构建HA-1树突状细胞核酸疫苗用于造血干细胞移植后抗白血病治疗。体外培养移植供者树突状细胞，用流式细胞术、混合淋巴细胞反应检测其免疫活性，通过电转法将HA-1基因转染树突状细胞，构建树突状细胞核酸疫苗。48小时后检测HA-1蛋白表达情况。将转染后的树突状细胞与同基因淋巴细胞共孵育诱导特异性CTL，应用LDH释放实验检测其体外杀伤活性。结果表明：经外周血单核细胞诱导的树突状细胞表达树突状细胞表型，能刺激同种淋巴细胞增殖。电转48小时后，Western blot可检测到HA-1蛋白表达。诱导的CTL体外杀伤活性高于对照组。结论：次要组织相容性抗原HA-1可作为造血干细胞移植后抗白血病治疗的靶点。     

T细胞受体β独特型抗原决定簇DNA疫苗诱导抗淋巴瘤抗体的研究

目的 观察T细胞受体（TCR）β不同独特型抗原决定簇DNA疫苗诱导BALB/c小鼠抗人类CEM淋巴瘤细胞免疫反应的情况。方法 RT-PCR扩增CEM细胞特异性重排的TCRβ基因片段，克隆至真核表达载体pcDNA3中，然后以此为模板，扩增编码不同抗原决定簇的基因片段到pcDNA3中作为DNA疫苗。肌肉注射法免疫小鼠，间接免疫荧光法检测小鼠血清中抗体生成情况。结果 CEM细胞TCRβ共包含5个抗原决定簇，其DNA疫苗免疫的6只小鼠全部产生了特异性抗独特型抗体（最高滴度1：480）；含4个抗原决定簇的DNA疫苗免疫的6只小鼠中有4只产生了特异性抗独特型抗体，但滴度均较低（最高滴度1：80）；仅含2个抗原决定簇的DNA疫苗未能使小鼠产生特异性抗独特型抗体。结论 包含TCRβV区全长，共有5个抗原决定簇的独特型DNA疫苗可以诱导小鼠产生抗淋巴瘤细胞的独特型特异性抗体；含有4个抗原决定簇的DNA疫苗仍可诱导特异性抗体的生成，但这种反应较弱，而仅含有2个抗原决定簇的DNA疫苗则不能诱导小鼠产生抗淋巴瘤的特异性抗体。