剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达

目的:本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法:用PCR法扩增SRp55基因,将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。在大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠,亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果:SRp55基因以正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达,随诱导时间的增加蛋白表达量增高,4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白,经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并获得GST-SRp55融合蛋白,为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。     

桥粒芯胶蛋白3前导肽基因的克隆和原核表达

目的：克隆人桥粒芯胶蛋白3前导肽(Dc3p)基因，并进行表达、纯化和鉴定。方法：用PCR法从桥粒芯胶蛋白(Dc)cDNA文库中扩增出Dc3p基因，与pGEX-4T-2载体连接成重组表达质粒pGEX-4T-2／Dc3p；重组质粒转入B121大肠杆菌：经诱导表达谷胱甘肽S-转移酶-Dc3p(GST-De3p)融合蛋白，该蛋白经Glutathione Sepharose4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和免疫印迹法检测鉴定。结果：经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-4T-2／De3p成功构建，诱导后高表达GST-De3p融合蛋白并得到纯化，免疫印迹法证实表达蛋白为Gsr-Dc3p。结论：获得高表达、高纯度的GST-Dc3p融合蛋白，为De3p的功能及免疫学分析打下基础。     

受精抗原-1基因的克隆和GST融合表达

目的：克隆和原核表达小鼠受精抗原-1(FA-1)基因。方法：自行设计引物，用RT-PCR从小鼠睾丸组织总RNA扩增FA-1基因的编码序列。将扩增产物克隆至GST融合表达载体pGEX-2T。以IPTG诱导GST融合FA-1的表达。结果：凝胶电泳显示PCR扩增产物的分子量与预期的508bp-致。重组质粒经BamHI／EcoR I双酶切后产生一个约500bp的片段。对重组质粒的序列测定表明，插入片段的序列与发表的FA-1基因编码序列相符。在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达出一个分子量与43kDa相近的产物(预期44.2kDa)。该产物可通过GST融合蛋白纯化试剂盒得到纯化。结论：小鼠FA-1编码序列已被成功地克隆至GST融合表达载体pGEX-2T。     

弓形虫表面抗原P35重组蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 构建弓形虫R0H株表面抗原P35基因重组表达质粒P35／pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中进行表达、纯化及鉴定。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从弓形虫CDNA库中扩增出编码P35抗原的基因片段，克隆入表达载体pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中融合表达，经GSTmp^TM亲和层析柱纯化出P35重组融合蛋白，以SDS-PAGE电泳鉴定纯度、Western-blot鉴定抗原性。结果成功构建了重组表达质粒P35／pGEX-2T，融合表达产物的分子质量约为70kDa；该蛋白抗原能为谷胱甘肽S转移酶(GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。结论弓形虫表面抗原P35在大肠杆菌中有效表达，纯化蛋白有良好的免疫活性。     

GST融合的人血浆蛋白S成熟肽的原核表达

目的：构建人蛋白S(protein S，PS)的原核表达载体并诱导其表达。方法：自行设计引物，通过PCR技术，以人PS真核表达载体为模板扩增PS成熟肽编码序列，PCR产物经EcoR1／BamHI双酶切后，将其克隆至GST融合表达载体pGEX—2T中，在E．coli BL21中诱导GST—PS融合蛋白的表达。结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％SDS—PAEG)显示。在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达出一个分子量约为96kD产物，与预期大小相符，该产物可通过GST亲和层析柱纯化。对重组质粒的序列分析表明，插入片段的序列与Genebank登录的人PS基因编码序列完全一致。结论：人PS编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T，并在E．coli BL21中获得表达，为进一步研究奠定了基础。     

迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

人乳头瘤病毒16型E7基因原核表达载体的构建及表达

目的: 构建人乳头瘤病毒16型 (HPV-16) E7基因原核表达载体,观察目的基因的蛋白表达。方法:人工合成HPV16 E7基因核苷酸序列,利用特异性引物通过聚合酶链反应扩增HPV16 E7基因,并克隆至pGEX-4T1原核表达载体,构建重组表达载体pGEX-4T1-HPV16-E7。 将其转化到工程菌Rosetta后,经IPTG诱导表达,进行E7-GST融合蛋白的SDS-PAGE分析和Ni2+-NTA亲和层析纯化。结果: E7基因PCR扩增产物和重组表达质粒的双酶切产物经琼脂糖
凝胶电泳,均可见300 bp的目的基因条带。表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳和纯化后,在相对分子质量约36 000处有特异性表达带,与预期相符。结论: 在原核系统中含E7基因的重组质粒可有效表达E7-GST融合蛋白。     

谷胱甘肽-S-转移酶人趋化因子CCL3L1的表达

目的克隆人趋化因子CCL3L1基因,表达并初步纯化谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-CCL3L1融合蛋白。方法从乳腺癌细胞MCF7中提取总RNA,采用RT-PCR扩增CCL3L1cDNA基因,克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,重组载体经酶切和测序鉴定后,在BL21大肠杆菌中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得GST-CCL3L1融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting分析表达产物。结果经测序、酶切鉴定证明CCL3L1基因已正确插入到pGEX-4T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量为34000的新生GST-CCL3L1融合蛋白。结论GST-CCL3L1融合蛋白可被成功表达。     

沙眼衣原体质粒蛋白pORF5原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建沙眼衣原体(CT)pORF5蛋白基因重组质粒pGEX-6p/pORF5,表达并纯化质粒蛋白pORF5,并鉴定其免疫原性.方法 用PCR法扩增pORF5基因,定向插入pGEX-6p原核表达载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达pORF5融合蛋白.融合蛋白纯化后免疫BALB/c鼠,ELISA及Western-blot分析pORF5质粒蛋白免疫原性及免疫反应性.结果 PCR扩增出795 bp基因片段,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的D型Ct一致;pORF5融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1:25 600.结论 pORF5蛋白在原核细胞中可有效表达并具有较好的免疫原性,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件.     

人睾丸前列腺素D合成酶的原核表达

目的：将获得纯化的重组人睾丸前列腺素D合成酶（L－PGDS）用于基础和临床研究,方法：在原核表达系统中,用异丙基-β-D－硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组质粒pGEX-2T／htL-PGDS的表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠亲和并纯化重组融合蛋白GST／htL-PGDS,再用凝血酶裂解融合蛋白,从而获得纯化的重组L－PGDS。对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序,并对重组蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析,鉴定其是否为所需目的蛋白。结果：用IPTG诱导重组质粒pGEX-2T／htL-PGDS表达的最佳浓度为1mmol/L最佳时间为4h。在此基础上获得的融合蛋白用凝血酶裂解后获得单一纯化的重组蛋白L-PGDS,最佳裂解时间为2h。SDS－PAGE和DNA测序证实,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白,结论：用上述方法可获得纯化的人睾丸L－PGDS。     

人bit1 cDNA基因的克隆、测序及表达

目的: 克隆并在大肠杆菌中表达人bit1 cDNA基因. 方法: 从新鲜的胎盘组织中提取总RNA,经反转录成单链cDNA, 以此为模板扩增出人bit1 cDNA基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后亚克隆入表达载体pGEX-4T3中进行表达. 结果: 利用所设计的引物扩增出完整的人bit1 cDNA基因.以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的40.6%. 结论: 获得了人bit1 cDNA基因及其原核表达产物,对研究人Bit1蛋白的功能具有重要的意义.     

人Survivin蛋白的表达?纯化及初步应用

目的:克隆、表达肿瘤特异性凋亡抑制因子(Survivin),并对其在人肝癌诊断中的意义进行研究。方法:从人白血病细胞系HL60提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出Survivin基因片段。将Survivin基因片段插入载体pMD-18T中,测序正确后亚克隆到原核表达载体pGEX-2TK中。IPTG诱导重组质粒pGEX-2TK-Survivin在大肠杆菌BL21中表达N端融合GST的目的蛋白,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,经SDS-PAGE分析后,将所得产物用Thrombin裂解后进行Westernblot鉴定。将获得的目的蛋白包板,用ELISA法初步检测了肝癌患者血清中抗Survivin蛋白的表达。结果:克隆了人Survivin基因、表达出相对分子质量约为16.2ku的蛋白并进行了肝癌患者血清的检测应用。结论:成功克隆、表达和纯化了Survivin基因和融合蛋白,为进一步探讨以Survivin为基础的肿瘤诊断和治疗奠定了实验基础。     

蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定

 【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2（PTP4A2）基因并高效表达纯化,对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术,从肝癌细胞系HepG2的总RNA中,获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达载体,并导入大肠杆菌E.coliBL21中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化,western印记进行鉴定,质谱检测蛋白分子量。通过其对底物磷酸多肽的去磷酸化反应,鉴定其活性。【结果】获得编码肝癌细胞PTP4A2（全长氨基酸）的基因序列,测序结果与已发表的基因序列相一致。重组GST融合蛋白经western分析,在相对分子质量Mr=45000处,有特异的蛋白条带。重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,质谱检测其分子量为45470.6。底物多肽去磷酸化反应表明纯化产物具有较强活性。【结论】成功克隆人PTP4A2基因,并在E.coliBL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白,质谱检测分子量与预期结果一致,纯化产物具有蛋白磷酸酯酶活性。     

人黑色素瘤特异性抗原基因的克隆及其在原核系统中的表达

目的：克隆及表达人黑色素瘤特异性抗原(PRAME)基因的cDNA片段。方法：从人急性髓细胞白血病细胞系HL-60提取总RNA，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出PRAME基因cDNA片段。将PRAME基因cDNA片段插入载体pGEM-T-easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建高效表达克隆，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmoL／L异丙基-β—D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，PRAME蛋白表达即达高峰。结论：PRAME基因在极少数正常组织中低表达，而在白血病患者高表达，并编码被自体细胞毒T淋巴细胞识别的抗原，所以该基因有望成为肿瘤免疫治疗的新成员。     

人嗜铬粒蛋白A N-端片段Vasostatin-1(CGA1-76)的原核表达

目的制备编码人Vasostatin-1基因片段,利用大肠杆菌表达重组Vasostatin-1蛋白。方法根据人Vasostatin-1基因序列,设计、合成3对PCR引物,利用PCR合成法制备编码Vasostatin-1的DNA。将Vasostatin-1基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,行酶切和DNA测序鉴定,并将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导BL21(DE3)中导入的Vasostatin-1基因的表达,行SDS-PAGE分析。用GSTrap亲合柱纯化重组Vasostatin-1蛋白。结果用PCR合成法制备了228bp的Vasostatin-1基因片段,并成功构建了重组质粒pGEX-4T-Vasostatin-1,DNA测序显示Vasostatin-1DNA序列和插入位点正确。经IPTG诱导,特异表达出以包涵体形式存在36kDa的重组Vasostatin-1蛋白。结论制备、克隆了人Vasostatin-1基因片段,并在大肠杆菌中表达出重组Vasostatin-1蛋白。     

Expression of the human era cDNA in E.coli

Objective: To amplify human era (Hera) gene, then express it in E.coli. Methods: Human era gene, after amplified by PCR and identified by sequencing, was inserted into the expression vector pGEX-4T3 in which exogenous gene was controlled by Ptac promoter. The recombinant plasmid pGEX-Hera was transformed into DH5 ( and induced with IPTG chemically. Results: The human era gene was amplified and the sequence was correct. When the bacteria with pGEX-Hera was induced, an anticipated 65 000 protein band appeared on SDS-PAGE gel and amounted to 23% of total bacterial protein. Conclusion: The human era gene has been successfully amplified and efficiently expressed in E.coli.     

弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白(GRA7)。方法　将弓形虫GRA7基因克隆入原核表达载体p GEX- 4 T- 1,构建重组质粒p GEX- 4 T- 1/GRA7并转化大肠埃希菌BL2 1。IPTG体外诱导重组质粒菌的表达,对表达的GRA7融合蛋白进行SDS- PAGE和Western- blotting分析。结果　成功构建了p GEX- 4 T- 1/GRA7重组质粒,该重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,该蛋白能与抗GST抗体结合。结论　GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达。     

人胰高血糖素样肽-1突变体基因原核表达质粒的构建

目的:对人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)进行基因突变,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/(Val8)hGLP-1,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:选择大肠杆菌偏爱密码子,将hGLP-1(7～37)第2位的丙氨酸(Ala8)定点突变为缬氨酸(Val8),直接生物合成4个寡聚核苷酸片段并进行基因拼接,形成完整的hGLP-1突变体基因(Val8)hGLP-1,并连接到载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,BamH I与Xho I双酶切电泳鉴定与序列测定,然后诱导表达其融合蛋白。结果:经酶切电泳鉴定与测序分析,证实所合成的突变体基因(Val8)hGLP-1已克隆到pGEX-4T-1中,经SDS-PAGE分析可以诱导表达出融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/(Val8)hGLP-1,为进一步获得重组hGLP-1蛋白奠定基础,为产业化规模制备hGLP-1突变体提供实验依据。     

重组人IL2-MUC1融合蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建表达人IL2-MUC1融合蛋白的工程菌，为制备新型MUC1疫苗提供实验依据。方法：通过PCR方法钓取人IL-2基因片段,将其克隆入pBS-SK-MUC1重组载体中，再将人IL2-MUC1串联基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1。将重组的pGEX-IL2-MUC1转化大肠杆菌BL-21，通过IPTG诱导表达，采用SDS-PAGE 和Western blotting鉴定表达蛋白。结果：经酶切及基因测序证实获得的IL-2基因片段 402 bp及IL2-MUC1基因片段852 bp基因序列正确；构建的pGEX-IL2-MUC1表达载体在BL21大肠杆菌中成功表达GST-IL2-MUC1蛋白，经SDS-PAGE证实其相对分子质量为64 000，与理论预期值相符。Western blotting分析表明该表达产物与抗人MUC1多克隆抗体及抗人IL-2单克隆抗体均具有特异性结合能力。结论：成功构建表达人IL2-MUC1融合蛋白的工程菌，为进一步研究以人MUC1为靶点的新型抗肿瘤疫苗奠定基础。     

一种合成人血小板因子4基因的简便有效方法

目的:用一种简便有效的方法合成hPF4基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达.方法:根据hPF4基因的序列,用touch-down PCR的方法合成hPF4基因,将合成的基因片断克隆到表达载体pCEX-4T-1中,构建了重组质粒pGEX-4T-1-hPF4,并将之转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达由谷胱甘肽转移酶和hPF4组成的融合蛋白.结果:用touch-down PCR的方法成功合成了hPF4基因.融合蛋白形成包含体,表达量约为全菌体蛋白的30%.结论:Touch-down PCR方法可作为合成其它目的基因的简便有效方法.BL21(DE3)/pGEX-4T-1表达系统能高效表达合成的hPF4基因,为下一步hPF4的纯化与生物学活性研究打下了基础.