Ti6Al4V-AlTiN涂层材料的急性毒性试验

背景:AlTiN陶瓷涂层具有高硬度、优良的摩擦磨损性能、良好的化学惰性和附着力强的特点,非常符合生物陶瓷的特征。为能够进入临床安全使用,需全面评价AlTiN涂层的急性毒性。目的:对Ti6Al4V-AlTiN涂层材料进行急性毒性试验研究,为长期毒性试验和其他毒理学试验提供参考依据。方法:将小鼠左右两侧股四头肌内无菌操作一次注入受试样品Ti6Al4V-AlTiN涂层材料,观察注入受试样品后14d动物全身情况及注射局部反应情况,试验中设置生理盐水作为阴性对照。结果与结论:小鼠两侧股四头肌内一次注射受试样品,观察14d后,受试样品各组动物体质量增长与阴性对照组差异无显著性意义。饮食、外观、分泌物、排泄物、呼吸、中枢神经系统及四肢活动无异常、注射局部无充血、红肿、无动物死亡情况及中毒现象。     

黄体酮药膜的局部应用试验

目的：评价黄体酮药膜局部应用安全性。方法：分别用常规方法进行黄体酮药膜的大鼠急性毒性试验、家兔皮肤刺激试验、大鼠阴道局部刺激试验、豚鼠皮肤致敏性试验。结果：大鼠阴道给予黄体酮药膜一天的最大耐受剂量为400mg／kg；家兔皮肤刺激实验结果显示，皮肤无红斑、红肿等刺激反应；大鼠阴道刺激试验结果显示，经阴道给药后子宫无充血、肿胀情况，阴道也未见充血与肿胀等炎性反应；豚鼠皮肤过敏试验结果未见过敏反应。结论：黄体酮药膜大鼠一次经阴道途径给药的最大耐受量为400mg／kg，无皮肤刺激性、阴道局部刺激性与皮肤致敏性，临床阴道应用是安全的。     

纳米羟基磷灰石/硫酸钙复合人工骨的生物安全性研究

目的研制纳米羟基磷灰石/半水硫酸钙(n-HA/CSH)复合型人工骨,并对其进行体内、外生物安全性测试。方法对n-HA/CSH人工骨进行急性全身毒性试验、皮内刺激试验、致敏试验、MTT细胞毒性试验和遗传毒性实验(Ames试验)并与对照组比较。结果人工骨浸取液静脉及腹腔注射后不引起小鼠呼吸、进食改变或死亡,体重稳定。家兔皮内注射72小时后仅出现红斑或微弱水肿,豚鼠皮内注射后未出现过敏反应。MTT细胞毒性试验显示含HA10%、20%、40%人工骨及纯n-HA、CSH的细胞增殖率均在77%以上,细胞毒性均为0～1级,Ames试验表明含HA40%人工骨的不同浓度生理盐水浸取液引起鼠伤寒沙门氏菌回复突变数均不超过阴性对照组的2倍。结论n-HA/CSH复合材料不引起全身毒性反应、皮内刺激反应和急性过敏反应。且无MTT细胞毒性,细胞相容性良好。同时,复合材料的生理盐水浸取液不引起鼠伤寒沙门氏菌回复突变数增加。     

羟丁基壳聚糖的生物相容性研究

目的研究新型温敏性生物材料羟丁基壳聚糖的生物安全性,初步探讨该材料植入体内有无毒副作用。方法将壳聚糖进行羟丁基化制备出温敏性水凝胶,选用小鼠成纤维细胞L929细胞,通过MTS法、倒置显微镜观察等方法进行体外细胞毒性试验。通过SD大鼠尾缘静脉浸提液注射,进行急性毒性试验,通过新西兰兔耳缘静脉浸提液注射及皮内浸提液注射,进行致热原反应试验及皮内刺激试验。结果羟丁基壳聚糖无细胞毒性,不引起试验动物体温升高,无皮肤刺激反应,急性毒性试验不引起试验动物死亡或者其它不适。结论羟丁基壳聚糖材料生物相容性好,是一种安全的生物材料,有望作为新型药物载体应用于临床。     

蛋白体佐剂及用于鼠疫F1-Ⅴ抗原的免疫效果

目的以蛋白体(proteosomes)佐剂,非共价结合鼠疫F1-V重组蛋白为免疫原,探讨滴鼻免疫BALB/c小鼠后诱导的免疫应答和免疫保护效果。方法佐剂与鼠疫F1-V重组蛋白为免疫原非共价结合,滴鼻免疫BALB/c小鼠4次后,采用间接ELISA检测血清特异性抗F1-V的IgG和IgA抗体及抗体亚型分类,并检测鼻咽、肺、小肠及阴道灌洗液中特异性抗F1-V的黏液分泌型IgA;并用流式细胞术检测鼻相关淋巴组织淋巴细胞、脾淋巴细胞、肠系膜淋巴结及小肠PP结T淋巴细胞表型的变化。第4次免疫后7d,用100 LD_(50)的鼠疫141强毒株进行腹腔攻毒。结果(1)以蛋白体为佐剂的鼠疫F1-V抗原与单纯的F1-V组相比,蛋白体疫苗组诱导血清IgG、IgA抗体显著升高(P<0.01),同时蛋白体疫苗组能诱导鼻咽、肺、小肠和阴道内多个黏膜部位特异性IgA抗体的产生,尤其是肺和生殖道冲冼液内抗体升高极为显著(P<0.01);(2)蛋白体疫苗组主要引起IgG1型抗体,主要诱导T_H2型免疫反应;(3)蛋白体疫苗组NALT和SP中CD4~ /CD8~ 比值比PBS对照有显著增高(P<0.01),MLN和PP中CD4~ /CD8~ 比值与PBS对照差异无统计学意义(P>0.05)。(4)小鼠在100 LD_(50)的鼠疫141强毒株腹腔攻毒后鼠疫F1-V重组蛋白组小鼠免疫保护率为0,而蛋白体佐剂疫苗组小鼠免疫保护率为67%。结论以自制的蛋白体为鼠疫F1-V抗原的佐剂滴鼻免疫小鼠,蛋白体不仅提高鼠疫F1-V抗原的系统免疫应答,而且能诱导小鼠呼吸道、消化道和生殖道局部黏膜免疫应答。蛋白体佐剂鼠疫疫苗对100 LD_(50)的鼠疫141强毒株腹腔攻毒具有一定的免疫保护作用,这为鼠疫黏膜疫苗的研制提供候选材料,也为鼠疫黏膜疫苗深入研究奠定了基础。     

注射用Rtnf的全身过敏性和血管局部刺激性作用研究

目的:观察Rtnf是否具有血管刺激作用、全身过敏反应,评价其注射用药的安全性。方法:通过家兔耳缘静脉刺激实验、豚鼠全身主动过敏实验(ASA)观察注射用药Rtnf的安全性。结果:注射用Rtnf对家兔血管内皮无损伤和刺激作用,病理切片观察,耳廓皮肤的表皮和真皮各结构完好,未见变性、坏死、缺失,表皮下乳头层及网织层无炎细胞渗出、无出血,血管内无血栓形成,附件结构正常;豚鼠未出现过敏现象。结论:在本次实验条件下,注射用Rtnf溶血性试验符合注射用药安全性要求;无血管刺激作用;对豚鼠不致敏。     

乙肝消毒液的皮肤刺激与皮肤过敏试验

本文报告乙肝消毒液对家免皮肤的刺激试验及对豚鼠皮肤的过敏试验。结果表明，家兔皮肤对乙肝消毒液无刺激反应；豚鼠皮肤对乙肝消毒液无过敏反应。     

原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强β-磷酸三钙多孔支架的生物安全性

背景：通过纳米羟基磷灰石原位生长明显提高了磷酸钙支架的强度与韧性。 目的：体外评价纳米羟基磷灰石晶须/β-磷酸三钙(nHAW/β-TCP)作为人工骨支架材料的生物相容性。 方法：急性全身毒性试验：30只小白鼠随机分为静脉实验组,腹腔实验组和对照组,分别注射浸提液及生理盐水,24,48,72 h观察动物的一般状态。溶血试验：材料浸提液与稀释人鲜血混合观察红细胞溶解情况,545 nm下检测A值计算溶血率;致敏试验：16只豚鼠随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组,每只豚鼠脊柱两侧皮内注射等体积nHAW/β-TCP支架材料浸提液、生理盐水及二硝基氟苯。于注射后即刻和24,48,72 h观察局部皮肤反应。细胞毒性试验：材料浸提液培养细胞进行细胞形态大体观察,采用CCK-8法观察细胞活性。 结果与结论：急性全身毒性试验：人工骨浸提液静脉及腹腔注射后不引起小鼠呼吸、进食改变或死亡,体质量稳定。溶血试验：nHAW/β-TCP的溶血率小于ISO规定的5%,可认为这种材料无溶血作用。致敏试验：豚鼠皮内注射后未出现过敏反应。细胞毒性试验：CCK-8细胞毒性试验显示不同浓度人工骨浸提液的细胞毒性为0级。提示nHAW/β-TCP复合支架不引起全身毒性反应、溶血反应和过敏反应,且无细胞毒性,生物相容性良好,符合组织工程人工骨支架材料的应用要求。     

不同用途透明质酸钠凝胶的亚慢性毒性和局部植入反应试验的研究比较

本研究将两种不同用途的凝胶产品通过腹腔注射和皮下植入的方式,分别对其亚慢性全身毒性和局部植入反应进行评价。全身毒性试验结果显示:在给药期间,试验组和对照组动物体重增长无明显差异;试验终期血液学和临床血液生化指标均无临床意义差异;大体病理学和组织病理学检查均未见由试验材料导致的脏器改变和组织病理学异常。局部植入的病理学观察发现:凝胶A植入早期有轻微炎症反应,植入后期有轻度组织反应。凝胶B植入早期有轻微炎症反应,植入后14d包囊结构消失。本研究结果表明:凝胶产品的不同特性决定了其在动物体内不同的降解代谢过程,从而决定了其在临床上不同的应用范围。同时,本文对亚慢性全身毒性和局部植入反应两种评价方法在风险管理中的应用进行了比较,以期对生物安全评价选项提供参考。     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

分光光度法测定鼠疫疫苗浓度方法的建立

目的研究鼠疫疫苗浓度与吸光度（A）值之间的相关性,建立通过测定A值来计算鼠疫疫苗浓度的方法。方法确定分光光度法测定鼠疫疫苗浓度的特异性、测定波长及线性范围。4个专业的实验室经对9批成品疫苗进行比浊,测定与细菌浊度标准管（相当于鼠疫浓度7．0亿／ml）浊度一致菌液的A值及标准管对应浓度±20％（即5．6亿／ml和8.4亿／ml）菌液的A值,根据该结果制备鼠疫疫苗浓度测定用参考品。4个实验室应用该参考品对鼠疫疫苗进行协作测定,确定分光光度法测定鼠疫疫苗浓度的可行性。结果确定600nm作为吸光度测定波长,鼠疫疫苗浓度在2．6—10．5亿／ml之间时A值与菌液浓度之间有很好的相关性（r=0．9998,df=3,P〈0．01）。成功制备了3种浓度（即5．6、7．0和8．4亿/ml）的鼠疫疫苗浓度测定用参考品,其A值分别为0．444、0．557和0．651。经4个实验室应用该参考品对鼠疫疫苗进行协作测定,测定误差小于5％。结论分光光度法具有良好的重现性,适用于鼠疫疫苗浓度的测定。     

鼠疫活菌苗0614F株遗传稳定性研究

经多年研究选育出一株具有较好的免疫原性，又有一定残余毒力的可作为鼠疫活菌疫苗的菌株０６１４Ｆ株。为进一步了解该菌苗株的遗传稳定性，对其通过人工培养基、动物各传２０代后的菌株之生物学性状，对实验动物的毒力和免疫力观察其菌体形态、培养特性、生化、毒力因子、Ｆ１抗原含量、质粒分子量等都与原珠无差异。０６１４Ｆ原株及动物传２０代的菌株分别以２５０亿、３００亿菌皮下感染体重２５０～３００ｇ豚鼠，连续观察３０天无一死亡，说明经过动物传代毒力无增强。人工培养基传２０代菌免疫豚鼠后Ｆ１抗体水平与原代无差异；免疫２０天后用１４１毒菌１０亿活菌攻击，０６１４Ｆ组使９１．７％豚鼠得到保护，而同样条件的ＥＶ对照组只能保护５０％，说明经多次人工培养基传代免疫原性无改变，具有稳定的遗传特性。     

抑制肿瘤血管新生的复合肽VBP3局部刺激与全身过敏性实验

目的: 评价抑制肿瘤血管新生的复合肽VBP3的安全性。方法: 同体左右侧自身对比法对3 只家兔进行皮下注射的局部刺激实验。28 只豚鼠随机分为4组:无菌生理盐水(PS)阴性对照组6只,牛血清白蛋白(BSA)阳性对照组6只,复合肽VBP3 低剂量组6只,复合肽VBP3高剂量组6只,进行全身过敏实验;剩余4只豚鼠,牛血清白蛋白阳性对照组和复合肽VBP3 高剂量组各2只,不经致敏直接心脏激发。结果: 抑制肿瘤血管新生的复合肽VBP3 对家兔皮下注射的局部刺激反应轻微;豚鼠实验仅复合肽VBP3高剂量组1只豚鼠出现弱阳性过敏反应,且很快缓解,其余豚鼠未见过敏症状。结论: 抑制肿瘤血管新生的复合肽VBP3在本实验条件下安全。     

Plague in Guinea pigs and its prevention by subunit vaccines

Human pneumonic plague is a devastating and transmissible disease for which a Food and Drug Administration-approved vaccine is not available. Suitable animal models may be adopted as a surrogate for human plague to fulfill regulatory requirements for vaccine efficacy testing. To develop an alternative to pneumonic plague in nonhuman primates, we explored guinea pigs as a model system. On intranasal instillation of a fully virulent strain, Yersinia pestis CO92, guinea pigs developed lethal lung infections with hemorrhagic necrosis, massive bacterial replication in the respiratory system, and blood-borne dissemination to other organ systems. Expression of the Y. pestis F1 capsule was not required for the development of pulmonary infection; however, the capsule seemed to be important for the establishment of bubonic plague. The mean lethal dose (MLD) for pneumonic plague in guinea pigs was estimated to be 1000 colony-forming units. Immunization of guinea pigs with the recombinant forms of LcrV, a protein that resides at the tip of Yersinia type III secretion needles, or F1 capsule generated robust humoral immune responses. Whereas LcrV immunization resulted in partial protection against pneumonic plague challenge with 250 MLD Y. pestis CO92, immunization with recombinant F1 did not. rV10, a vaccine variant lacking LcrV residues 271-300, elicited protection against pneumonic plague, which seemed to be based on conformational antibodies directed against LcrV.     

Immune responses to the oral administration of recombinant Bacillus subtilis expressing multi-epitopes of foot-and-mouth disease virus and a cholera toxin B subunit

Bacillus subtilis has been engineered successfully to express heterologous antigens for use as a vaccine vehicle that can elicit mucosal and systemic immunity response. In this study, a recombinant B. subtilis expressing the B subunit of cholera toxin (CT-B) and an epitope box constituted with antigen sites from foot-and-mouth disease virus (FMDV) type Asia 1 was constructed and named 1A751/CTB-TEpiAs. Its capability to induce mucosal, humoral, and cellular responses in mice and guinea pigs was evaluated after oral administration with vegetative cells of 1A751/CTB-TEpiAs. In addition, its capability to protect guinea pigs against homologous virus challenge was examined. All animals were given booster vaccination at day 21 after initial inoculation and guinea pigs were challenged 3 weeks after booster vaccination. The control groups were inoculated with a commercial vaccine or administered orally with 1A751/pBC38C or an oral buffer. All animals vaccinated with 1A751/CTB-TEpiAs developed specific anti-FMDV IgA in lung and gut lavage fluid, serum ELISA antibody, neutralizing antibody as well as T lymphocyte proliferation, and IFN-γ secretory responses. Three of the five guinea pigs vaccinated with 1A751/CTB-TEpiAs were protected completely from the viral challenge. The results demonstrate the potential viability of a B. subtilis-based recombinant vaccine for the control and prevention of FMDV infections.     

The immunogenic properties of some fractions of pasteurella pestis

Summary It was established that nucleic acids (NA) ofP. pestis possess a specific property of stimulating the immunity in guinea pigs and monkeys in conjoint administration with the live EB vaccine. Conjoint immunization with the live vaccine and NA protected the animals against experimental bubonic (guinea pigs) and pulmonary plague (monkeys). NA ofP. pestis causes no marked immunity in the animals without the live vaccine. Nucleoprotein (NP) and fraction I ofP. pestis, as well as killed microbes of the EB strain, sodium nucleate, and NA ofBr. melitensis, administered together with the live vaccine caused no stimulating effect on the formation of plague immunity in guinea pigs. Fraction I and NA ofP. pestis, as well as sodium nucleate, obtained from yeast in doses and ratios to the live vaccine, depressed the development of immunity to this injection in guinea pigs.(Presented by Active Member AMN SSSR N. N. Zhukov-Verezhnikov) Translated from Byulleten' Éksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 55, No. 1, pp. 77–80, January 1963     

PCV2-ORF2 去信号肽基因的克隆与原核表达及对小鼠免疫效力的评价

 目的 通过基因工程的方法表达猪圆环病毒 2 型的 ORF2 蛋白,并对表达蛋白进行小鼠免疫效力评价,为猪圆环病毒病疫苗的研制提供技术支持。 方法 根据 GenBank 中猪圆环病毒 2 型（PCV-2) ORF2 基因序列,设计了 1 对引物。从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的死亡仔猪病料中提取基因组 DNA,用 PCR 方法扩增出 ORF2 去信号肽基因,将该基因克隆至原核表达载体 pET32a,获得重组质粒,经 PCR﹑酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为目的基因,插入的位置、大小和阅读框均正确,成功构建了重组质粒 pet32a-ORF2,阳性重组质粒转化大肠杆菌 Blgold（DE3）,用 IPTG 诱导表达并确定表达的最佳条件,表达产物经纯化后,以每只小鼠 0.2 mg 免疫 5 周龄的雌性小鼠,然后用 ELISA 检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况。 结果 纯化的重组蛋白能使小鼠产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第 7 d 开始产生抗体,第 28 d 抗体水平达到最高,抗体可维持 7 周以上,并具有良好的安全性。 结论 表达目的蛋白能在小鼠体内产生特异性抗体,为进一步研究猪圆环病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

利用噬菌体随机肽库筛选表达Aβ靶向肽的噬菌体

目的抗Aβ神经毒性的Aβ靶向肽噬菌体的筛选。方法分别合成Aβ1-10序列组成的短肽并将其生物素化;以生物素化Aβ1-10为靶分子,用噬菌体展示技术及液相亲和捕获法筛选出特异性高亲和力的噬菌体;采用生物传感分析技术,通过结合特异性实验和短肽竞争性抑制实验,检测所筛选的噬菌体与靶分子之间的亲和动力学关系。结果经过对靶分子Aβ1-10的3轮筛选,筛出了与Aβ1-10特异性结合的单克隆噬菌体;生物传感分析技术结果进一步表明,靶分子（Aβ1-10）与所筛选噬菌体之间的结合具有高度特异性。结论筛选出了展示特异性高亲和力结合Aβ1-10短肽的噬菌体。     

角质细胞生长因子对老龄鼠胸腺细胞增殖作用的研究

目的观察角质细胞生长因子（KGF）通过恢复胸腺上皮细胞（TEC）数量促进老龄鼠胸腺细胞增殖的作用。方法①体内实验：BALB／C小鼠10只，随机分为KGF处理组和对照组，每组各5只，连续7d分别给予皮下注射重组人KGF（5mg·k^-1·d^-1）和生理盐水，4周后检测小鼠胸腺和脾组织的细胞总数，流式细胞仪分别检测胸腺组织中CD4单阳性（CD4SP）、CD8单阳性（CD8SP）、CD4CD8双阳性（DP）、CD4CD8双阴性（DN）以及脾组织中CD4SP、CD8SP各T细胞亚群的比例；②体外实验：鼠胸腺上皮来源的1C6细胞，分别经含不同浓度（25、50、100、200、400、800ng／ml）的重组人KGF和不含重组人KGF的完全培养液（对照组）作用24h，采用噻唑蓝（MTT）法测定细胞增殖率。结果细胞计数和流式细胞仪检测显示，与对照组相比，KGF处理组平均胸腺细胞总数和CD4SP、CD8SP、DP、DN各T细胞亚群的平均细胞数以及KGF处理组平均脾细胞总数和CD4SP、CD8SP各T细胞亚群的平均细胞数均有明显增加（均P〈0．05）。MTT法检测显示，在低浓度（〈200ng／ml）时，1C6细胞增殖率随KGF浓度的增加不断升高；当KGF浓度为200ng／ml时，1C6细胞增殖率达到最高值；而在高浓度（〉200ng／ml）时，1C6细胞增殖率随KGF浓度的增加又逐渐下降；与对照组比较，浓度为100、200、400ng／ml的重组人KGF对1C6细胞具有明显的促增殖作用（均P〈0．05）。结论KGF可通过恢复老龄鼠TEC数量以及促进胸腺细胞生成和增加成熟T细胞向外周输出而增强机体的免疫力。     

Efficiency of recombinant bacille Calmette-Guérin in inducing humoral and cell mediated immunities against human immunodeficiency virus type 1 third variable domain in immunized mice

Purpose

The third variable (V3) loop of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) envelope glycoprotein has been intensively studied for AIDS vaccine development. Bacille Calmette-Guérin (BCG) is widely used to immunize against tuberculosis and has many advantages as a vaccine vehicle, such as low toxicity, adjuvant potential, low cost, and long-lasting immune-inducing capacity. This work was initiated to investigate the immunogenicity of recombinant BCG (rBCG-mV3) designed to express trimeric HIV-1 V3 loop (mV3) in rBCG-mV3-immunized animals.

Materials and Methods

HIV-1 V3-concatamer was cloned into pMV261, a BCG-expression vector, and then rBCG-mV3 was constructed by introducing the recombinant plasmid (pMV-V3). The recombinant BCG was examined with regard to its expression of V3-concatamer and the genetic stability in vivo and in vitro. The immune responses induced by recombinant BCG were tested in immunized mice and guinea pigs.

Results

The rBCG-mV3 expressed detectable amounts of V3-concatamer when induced by single heat-shock. The recombinant BCG was genetically stable and maintained the introduced mV3 gene for several weeks. V3-specific antibodies were clearly detected 6 weeks after inoculation. The antibody titer rapidly increased after immunization up to 10 weeks, and then maintained for over 4 weeks. IgG2a was prevalent in the V3-specific antiserum. The recombinant BCG was also effective in inducing delayed-type hypersensitivity responses in the immunized guinea pigs. rBCG-immunized mice retained substantial amounts of V3-specific T cells in the spleen, even 5 months after the first immunization.

Conclusion

Recombinant BCG-mV3 is very efficient in inducing humoral and long-lasting cell-mediated immunity against HIV-1 V3 in the immunized animals.