铁皮石斛居群差异的研究(Ⅰ)——植物体形态结构的差异

目的：比较分析广西,贵州,云南三省区的铁皮石斛主要居群形态结构的差异。方法：运用光镜对铁皮石斛茎进行比较解剖。结果：将采集到的我国铁皮石斛主产区的主要居群分为二种类型：F型和H型。F型植株的茎相对短而柔软,具粘性,适宜加工成铁皮枫斗;其中广西西林居群和云南广南居群茎的表皮具有较丰富的蜡质,不具下皮层,横切面上维管束密度小,维管束内外侧纤维群不发达,茎尤为柔软,是加工铁皮枫斗的优质居群。H型植株的茎较长,质地较硬,粘性差,不适宜加工成铁皮枫斗。结论：F型和H型居群铁皮石斛茎的形态结构具有明显差异,弄清铁皮石斛居群差异对指导铁皮石斛的采收、加工以及大面积人工繁殖具有重要意义。     

铁皮石斛居群差异的研究ⅡISSR指纹标记方法的建立与优化

目的:针对铁皮石斛ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR分子指纹标记反应体系,为进一步研究铁皮石斛的居群差异奠定基础。方法:通过筛选引物并设定影响铁皮石斛ISSR反应的诸因子的不同浓度,检测IS-SR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立铁皮石斛ISSR稳定可靠的反应体系。结果与结论:首次建立了可用于铁皮石斛ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25μL PCR反应体系中,10×Taq酶配套缓冲液,1.5 U Taq DNA聚合酶,1.2～1.8 mmol.L^-1MgCl₂,80μmol.L^-1dNTP,0.2μmol.L^-1引物,DNA模板约20 ng,退火温度52～60℃;实验表明:Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度等对ISSR反应结果具有较大影响。所建立的铁皮石斛ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可以较好地应用于铁皮石斛的居群鉴别及居群分子生态的研究。     

铁皮石斛人工栽培居群的遗传多样性研究

目的了解铁皮石斛人工栽培居群的遗传多样性,为种质资源的保护与新品种的选育提供基础。方法利用RAPD分子标记对浙江义乌、天台、建德、武义,云南麻栗坡、勐海的14个居群的铁皮石斛和1个居群的紫皮石斛进行遗传多样性分析。结果从225个RAPD引物中筛选出15个引物,对105个铁皮石斛和3个紫皮石斛样本进行PCR扩增,共扩增出138条带,其中133条为多态性条带,多态性条带比率(PPB)为96.38%;14个铁皮石斛居群的多态位点(PPL)在10.79%～76.26%,平均为45.32%。结论全国主产区人工栽培的铁皮石斛遗传多样性丰富,铁皮石斛种质的亲缘关系远近与其地理种源具有显著的相关性,与栽培地点无关。     

铁皮石斛多糖促进毛发生长的实验研究

目的：观察铁皮石斛多糖（DCP）促毛发生长的功效并探讨其作用机制,为铁皮石斛的开发利用奠定基础。方法：采用水提醇沉法提取DCP,并用苯酚-硫酸法测定其多糖含量。取C57BL/6J小鼠30只,用脱毛膏去除其背部毛发建立脱发模型,分为对照组、阳性对照组和DCP组,每日分别涂抹超纯水、米诺地尔酊、DCP（5.0 g·L^-1）l 次,每次 0.2 mL,连续给药21 d,应用小鼠毛发生长情况评分标准对C57BL/6J小鼠给药7,14 d毛发生长情况进行评分,及称量给药21 d C57BL/6J小鼠单位脱毛区域毛发质量评价DCP对C57BL/6J小鼠毛发生长的影响。采用MTT法和RT-PCR法分别评价DCP对人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）增殖和对HaCaT细胞血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达的影响。结果：DCP提取率为29.87%,DCP质量分数为79.65%。DCP组C57BL/6J小鼠的毛发生长平均得分、平均质量均显著优于对照组;DCP组HaCaT细胞生存率和VEGF mRNA的表达水平与对照组比较均显著提高。结论：DCP具有促毛发生长的作用,其机制可能是上调VEGF mRNA的表达。     

铁皮石斛种质资源DNA身份证的构建及遗传相似性分析

该研究利用中国中医科学院中药资源中心筛选出的4对简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)引物对铁皮石斛主产区9个产地29个居群的铁皮石斛样品进行检测,4对SSR引物分别扩增出5,7,4,3条多态性带,根据不同居群的SSR指纹图谱构建DNA身份证。聚类分析可将来自29个居群样本分成四大类,且表现出较好的地域相关性,其中来自云南、贵州、四川的铁皮石斛样品聚为一类,来自安徽和广西的铁皮石斛单独聚为一类,来自广东丹霞、浙江永康、浙江乐清及泰宁的样品聚为一类。采用PopG ene(version 1. 32)软件包对29个铁皮石斛居群进行遗传相似性分析,相似系数变异在0. 403 4～1. 0。基于遗传相似系数可将不同居群铁皮石斛的遗传一致性分成A,B,C共3个等级,地理位置相近或生长地貌相似的居群遗传相似性系数较高,表明其遗传背景较为一致。本研究为铁皮石斛的品种鉴别及优良品种选育提供参考信息。     

铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制差减杂交文库的构建及序列分析

 目的 研究铁皮石斛（Dendrobium officinale）种子接菌共生萌发差异基因表达谱特征。方法 采用抑制差减杂交（SSH）技术,分别以接菌及未接菌培养5周的铁皮石斛种子cDNA作为检测子与驱赶子,构建铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制性消减cDNA文库。结果 对部分克隆产物测序,经GenBank中BLASTx同源比较后,进行基因功能注释,得到100个具有植物同源性的表达序列标签（EST）,主要涉及细胞与染色体结构、RNA合成、信号转导、能量与代谢、蛋白质合成与降解及细胞防御等。随机挑选5个目标基因,实时荧光定量PCR分析发现这5个基因在共生萌发的种子中均上调表达。结论 铁皮石斛种子接菌共生萌发涉及多种途径相关基因表达调控,本实验为兰科植物种子萌发分子机制研究奠定基础。     

铁皮石斛Ty1-copia类反转录转座子反转录酶(RT)序列的克隆与分析

该研究根据Ty1-copia类反转录转座子RT的通用引物,从铁皮石斛浙江临安（C15）和云南广南（A39）种质中扩增得到43条Ty1-copia类反转录转座子RT序列,这些核苷酸序列具有较高的异质性,主要表现为,序列长度变化范围 260~266 bp,终止密码子和移码突变,所有序列均富含碱基AT,一致性为 47.1%~97.7%。经plantCARE软件分析发现受低温、热、光、各种植物生长调节物质等不同胁迫条件作用的调控元件、多个启动子的特征结构TATA box和CAAT box的保守序列及其他一些调控元件。翻译成氨基酸后,有10条序列出现1~4个不同程度的终止密码子突变,5条序列出现移码突变,保守序列“SLYGKQ”发生变异的有 39条序列。其氨基酸序列经过系统聚类后可分为6类;且与其他植物（尤其是单子叶植物的小麦、荸荠）具有较高的同源性,表明它们间可能存在着Ty1-copia反转录转座子的横向传递。     

不同种植年限铁皮石斛多糖、甘露糖含量的测定及其它化学成分比较研究

目的:比较不同种植年限铁皮石斛的多糖及甘露糖含量,并对其正丁醇部位及乙醚部位化学成分进行比较研究,为铁皮石斛种植年限的确定提供参考。方法:采用苯酚-硫酸法测定多糖含量,柱前衍生化HPLC法测定甘露糖的含量,RP-HPLC结合二极管阵列检测器(DAD)法分析铁皮石斛正丁醇部位(360 nm)及乙醚部位(280 nm)分别随不同种植年限的变化情况。结果:铁皮石斛多糖含量随种植年限不同而变化,2年生3年生4年生,2~4年生铁皮石斛随种植年限增加,多糖含量减少。甘露糖含量随种植年限的变化也呈现与多糖相同的变化趋势。铁皮石斛正丁醇部位中黄酮类成分在360 nm下随种植年限变化有一定的变化,2年生中黄酮类化合物相对极性较小,且较集中。3年生极性分布较广,且含量相对较大。4年生主要分布在极性大的黄酮类化合物,含量相对较低。铁皮石斛乙醚部位在280 nm下随着种植年限增加,色谱图峰强度增加明显。结论:从多糖及甘露糖含量考虑,以2年生铁皮石斛含量最高,宜以两年生为用;而结合酚类及黄酮类成分却与此有所背离,具体有待进一步深入研究。     

一测多评法结合双波长法分析不同产地、栽培和加工铁皮石斛黄酮类成分的含量

建立HPLC一测多评法结合双波长法同时测定铁皮石斛中6种黄酮类成分的含量,比较不同产地、栽培和加工的铁皮石斛茎中黄酮类成分的含量,明确引起铁皮石斛黄酮类成分差异性的主要因素.采用资生堂Capcell PAK MGⅡC18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈-0.1％甲酸为流动相,以芦丁为内标物,检测波长...     

太子参脱病毒苗的核糖体ITS序列研究

目的研究太子参脱病毒苗与外界苗rDNAITS区碱基序列的异同。方法运用PCR直接测序法对9种太子参脱病毒苗和4种外界苗的rDNAITS区（包括ITS1、5．8S、ITS2）碱基序列进行了序列测定。结果太子参脱病毒苗与外界苗的5．8S碱基序列完全一致，变异位点基本上位于ITS1的起始端与ITS2的终止端，其中江苏溧阳和安徽宣城的脱病毒苗变异位点较多。使用UPGMA法构建了系统发生树，从分子生物学角度说明了它们之间的内在联系。结论rDNAITS碱基序列的比较分析从分子水平上进一步阐明了脱病毒苗的遗传稳定性。     

韶关丹霞地貌铁皮石斛野生资源调查与生境分析

目的 调查广东韶关丹霞地貌现存铁皮石斛野生资源的生存现状,为野生铁皮石斛就地保护、回归保育及仿野生栽培提供参考。方法 对国内铁皮石斛野生资源情况进行整理,基于本课题组近10年来对广东韶关丹霞地貌野生铁皮石斛资源分布和生境开展的跟踪调查,对11个调查地点的海拔、朝向、铁皮石斛数量、坡位、坡向进行分析,探讨丹霞地貌野生铁皮石斛植物形态和生境特点。结果 调查记录了广东韶关丹霞地貌中的野生铁皮石斛300余丛,约3000 g,处于极度濒危状态;实地观察发现,野生铁皮石斛茎多呈紫红色,长5~10 cm,有“形似蚱蜢髀”的茎条,叶铁锈色斑点明显;丹霞地貌的野生铁皮石斛大多生长在海拔100~500 m的丹霞崖壁中部或近坡顶处,常与苔藓和地衣伴生,一般生长在东南至西南朝向、通风良好、傍水潮湿的丹霞岩壁上,且半阳偏阴、温凉高湿环境下长势较好。结论 野外考察证实,《本草经集注》中记载的“今用石斛出始兴”的石斛为铁皮石斛,其药用历史在1500年以上;丹霞地貌的铁皮石斛为目前国内铁皮石斛的主要种源之一;野生丹霞铁皮石斛因自身繁殖率低、人为长期采摘等原因,现已极度濒危,亟须开展铁皮石斛野生资源的调查与保护工作。     

云南栽培铁皮石斛适宜采收期研究

为了确定云南省不同产地栽培铁皮石斛的适宜采收期,对云南6个产地大棚栽培的铁皮石斛进行周年采样,每月采集1次,检测样品的折干率、甘露糖与葡萄糖峰面积比、浸出物、多糖和甘露糖含量,对不同采收期铁皮石斛的产量(折干率)及质量(指标性成分)进行综合评价。实验结果表明:不同产地云南省栽培铁皮石斛样品折干率在1-4月为高峰期,醇溶性浸出物在9-12月含量较高,多糖和甘露糖含量在1-4月达到高峰期,在10月-翌年2月,甘露糖与葡萄糖峰面积比符合药典标准。根据药典标准要求,综合测定的产量及质量的结果,云南省各产地栽培铁皮石斛的适宜采收期为12月至翌年2月。     

不同光照强度和培养时间下铁皮石斛类原球茎生物量、多糖和生物碱量的动态变化

目的探讨不同光照强度下铁皮石斛类原球茎(PLBs)生物量、主要药用成分多糖和生物碱的动态变化规律。方法以MS为基本培养基,采用光照强度单因素试验设计,烘干法测定生物量,苯酚-硫酸法测定多糖量,酸性染料比色法测定生物碱量,数据采用SPSS 16.0软件包分析。结果铁皮石斛PLBs生物量在光照强度≥2 000 lx下培养40～50 d均较高,生产上需要PLBs维持旺盛的分裂,获得最高生物量的培养条件为光照强度2 000 lx条件下培养40 d,生物量达到0.74 g;多糖量以光照强度2 000 lx下培养30 d最高,达到16.88%;生物碱量以光照强度500 lx下培养30 d最佳,达到0.028 0%。结论不同的光照强度和培养时间对铁皮石斛PLBs的生长、多糖和生物碱的变化有显著影响,适宜的光照强度和培养时间对铁皮石斛主要药用成分的生产具有重要的实践意义。     

束花石斛及其相似种的DNA分子鉴别

目的 :探讨束花石斛与同属相似种 :玫瑰石斛、喇叭唇石斛、报春石斛、兜唇石斛等植物及药材鉴别的DNA分子标记。方法 :对束花石斛及其相似种进行rDNAITS区序列比较研究。结果 :尽管束花石斛及其相似种的外部形态差异较小 ,但在rDNAITS序列上却存在着显著而稳定的差异。在rDNAITS区域中 ,作者共挑选了15个碱基位点用作鉴别束花石斛及其相似种的DNA标记。结论 :根据rDNAITS区碱基序列差异 ,能准确鉴别束花石斛及其相似种植物及药材。     

采用“一测多评”法测定大黄及其制剂中大黄蒽醌类成分的含量

目的:应用"一测多评"法同步测定大黄及其提取物和制剂中5种蒽醌类成分的含量。方法:采用HPLC-DAD测定并计算5种蒽醌类成分之间的相对校正因子,分别以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚为内参物,计算大黄及其制剂中其余4种成分含量,实现一测多评;同时采用外标法测定该药材及制剂中5种成分的含量,与"一测多评"法测定结果进行比较,计算"一测多评"法含量计算结果(Wf)和外标法的含量测定结果(Ws)的相对误差,验证一测多评法的准确性。并采用相对保留值方法对5种成分色谱峰准确定位。结果:以大黄素为内参物时,不同批次大黄药材的相对误差为-3.91%~4.06%;提取物中间体的相对误差-3.22%~3.27%,均<±5%;大黄制剂的相对误差范围在-5.39%~7.00%,相对保留值的RSD 3.87%~9.92%,说明方法准确度高、重复性好。结论:"一测多评"法可作为一个新的质量评价模式用于大黄及其制剂中蒽醌类成分的质量评价,具有快速、准确、廉价、方便等特点。     

铁皮石斛醋酸乙酯部位化学成分研究

目的进一步研究铁皮石斛Dendrobium officinale活性醋酸乙酯部位的化学成分。方法运用大孔树脂、MCI、硅胶、凝胶(Sephadex LH-20)、ODS等柱色谱、制备薄层色谱及制备高效液相色谱法等分离技术,进行化合物的分离纯化,根据~1H-NMR、~(13)C-NMR、MS等波谱数据和理化性质鉴定化合物的结构。结果从铁皮石斛乙醇提取物的醋酸乙酯部位分离得到了34个化合物,分别鉴定为moscatin(1)、黑麦草内酯(2)、柚皮素(3)、橙皮苷(4)、甘草素(5)、2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)-3-oxo-l-propanol(6)、异甘草素(7)、(E)-4-hydroxycinnamicacid(8)、(Z)-4-hydroxycinnamicacid (9)、 coniferylp-coumarate (10)、 sinapylp-coumarate (11)、 tinosporaicacidA (12)、N-trans-coumaroyltyramine(13)、N-trans-feruloyltyramine(14)、丁香脂素(15)、pinoresino(l16)、梣皮树脂醇(17)、lirioresionol(18)、2(5H)-Furanone5-hydroxy-3,4-dimethyl-5-pentyl(19)、丁香酸(20)、十六烷酸(21)、对羟基苯甲酸(22)、对羟基苯甲醛(23)、阿魏酸(24)、二氢松柏醇(25)、十七烷(26)、4-羟基-3,5-二甲氧基反式肉桂醛(27)、dihydro-p-cinnamic acid(28)、(+)-(4S)-(2E)-4-羟基-2-壬烯酸(29)、1,3-benzenediol(30)、对羟基苯酚(31)、水杨酸(32)、对羟基苯乙酮(33)和香草醛(34)。结论化合物2首次从石斛属植物中分离得到,化合物3～7均为首次从铁皮石斛中分离得到。     

药材与资源石豆兰属植物rDNA ITS序列的克隆与分析

目的通过测定11种石豆兰属植物的ITS序列,为石豆兰属植物分子鉴定和遗传多样性研究提供依据。方法利用PCR法从叶片基因组DNA中克隆ITS序列,并借助生物信息学软件对其进行分析。结果 11种石豆兰属植物的ITS全长为633～645 bp,5.8 S序列长度162 bp,ITS1和ITS2序列变异位点丰富,共168个,其中信息位点95个,序列存在大量的转换、颠换和缺失;5.8 S序列较为保守,仅含6个变异位点和2个信息位点;11种石豆兰属植物的遗传距离为0.002 2～0.212 0,其中齿瓣石豆兰与斑唇石豆兰之间的遗传距离最小,亲缘关系最为接近。序列已上传至NCBI,登录号为JN619409～JN619419。结论获得了11种石豆兰属植物的rDNA ITS序列,为石豆兰属植物分子鉴定和遗传多样性研究奠定了基础。     

霍山石斛不同生长阶段遗传稳定性的RAPD分析

目的：研究霍山石斛同一蒴果组培不同生长阶段遗传稳定性。方法：利用从20个随机引物筛选的3个稳定性较好的10碱基引物对已继代7～8次的H23种群进行RAPD检测。结果：发现不同阶段内遗传相似系数较大,在85.409 3%～98.360 6%,其中在原球茎、萌芽期和一叶期存在的变异比两叶期、开花期要显著,但程度都极其微弱。结论：来自同一蒴果的变异非常小,建立霍山石斛稳定的无性快繁系是切实可行的。