shRNA沉默Survivin基因对胶质瘤细胞U87生物学行为影响的研究

目的 观察短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默Survivin基因对人脑胶质瘤细胞U87增殖、凋亡等生物学特性的影响.方法 通过脂质体LipofectamineTM 2000对胶质瘤细胞株U87转染Survivin shRNA干扰质粒(Suvrivin shRNA-i),以及对照无意义质粒(Suvrivin shRNA-nonsense),应用RT-PCR、Western blot检测转染前后Survivin mRNA和蛋白表达,流式细胞术测定各组细胞的细胞周期及TUNEL测定细胞凋亡形态.结果 转染Survivin shRNA-i组的Survivin mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组(P＜0.05).与对照组相比较,转染Survivin shRNA-i后细胞周期G2/M期阻滞显著,细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 靶向Survivin基因的特异性shRNA能够阻制U87细胞的生长并诱导其凋亡.     

阻断细胞信号传导子和转录激活子6基因表达对人结肠癌细胞凋亡的影响

目的 探讨细胞信号传导子和转录激活子6（STAT）信号传导通路与结肠癌细胞凋亡的关系。方法构建4个STAT6特异的shRNA质粒载体，应用阳离子脂质体瞬时转染人结肠癌细胞HT-29，以阻断Stat6信号通路；分别用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测STAT6 mRNA表达和运用流式细胞术检测磷酸化STAT6蛋白（pSTAT6）表达来筛选有效的小发夹RNA（shRNA）；运用流式细胞术分析细胞凋亡变化；RT-PCR和Western印迹观察Bcl-2和Bax基因表达。结果成功构建并筛选出两个STAT6特异的shRNA质粒载体；STAT6基因沉默的结肠癌细胞中凋亡细胞明显增加，空白对照组细胞早期凋亡率为0．4％，pshRNA-STAT6-1组和pshRNA-STAT6-4组分别为13．0％和8．8％（P〈0．05）；Stat6信号通路被阻断的结肠癌细胞中Bcl-2基因表达明显减少，而Bax蛋白基因表达明显增多（P〈0．01）。结论Stat6信号传导通路能抑制结肠癌细胞凋亡，可能是通过调节Bcl-2和Bax基因的表达发挥作用。     

趋化因子受体CXCR7对人乳腺癌细胞生长、凋亡及细胞周期的影响

目的 通过构建CXCR7短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列的真核表达载体,探讨趋化因子受体CXCR7对人乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖、凋亡、周期的影响.方法 针对CXCR7构建编码shRNA序列的重组表达载体;分别用RT-PCR和Western blot检测CXCR7 mRNA及蛋白表达水平;MTT法检测细胞增殖;TUNEL法检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期.结果 构建针对CXCR7短发夹状RNA序列的表达载体,经酶切及测序证实与设计完全一致;将2个CXCR7shRNA载体(CXCR7-shRNA1;CXCR7-shRNA2)转染MDA-MB-435s细胞后,CXCR7 mRNA及蛋白平均降低;抑制CXCR7的表达后,CXCR7-shRNA组细胞增殖率明显下降(P＜0.05),细胞凋亡增多(P＜0.05),细胞周期无明显改变.结论 重组表达载体CXCR7-shRNA1、CXCR7-shRNA2能有效抑制靶基因CXCR7的表达,进而可抑制人乳腺癌MDA-MB-435s细胞的增殖,促进细胞凋亡,而对细胞周期无明显影响.     

短发夹状RNA靶向抑制HaCaT细胞Hax-1基因的表达研究

目的 观察短发夹状干扰RNA靶向抑制Hax-1基因诱导HaCaT细胞凋亡的作用.方法 构建特异性抑制Hax-1的shRNA表达载体并转染HaCaT细胞;分别采用半定量PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;流式细胞术检测HaCaT细胞的凋亡.结果 Hax-1基因mRNA水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制,HaCaT细胞凋亡率明显升高.结论 靶向Hax-1的shRNA显著抑制了Hax-1基因在HaCaT细胞中的表达,并明显诱导HaCaT细胞凋亡.     

CHK1 shRNA对HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术沉默CHK1基因的表达,观察其对高表达CHK1的宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖、凋亡的影响.方法 构建针对CHK1的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达质粒,将该质粒通过脂质体转染法导入HeLa细胞,以RT-PCR和Western blot法分别检测其CHK1基因和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化,MTT法检测细胞的增殖.结果 shRNA能明显降低HeLa细胞表面CHK1的表达,与对照组和空载体转染组相比, shRNA转染组HeLa细胞CHK1 mRNA水平下降了66%,蛋白水平下降了60%(P<0.05).此外,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显增加,增殖活性明显降低, 而且G2/M期细胞百分率显著下降.对照组、空载体转染组和shRNA转染组的G2/M期细胞百分率分别为(53.96±1.35)%、(54.08±1.39)%和(15.10±0.87)%(P<0.05).结论 CHK1shRNA能明显增加HeLa细胞的凋亡,抑制该细胞的增殖,削弱其G2/M期阻滞,为进一步研究CHK1在肿瘤治疗中的作用机制提供实验基础.     

NHE-1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的 探讨NHE-1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）凋亡的影响。方法 构建NHE-1核酶基因逆转病毒载体,转染体外培养的大鼠PASMC,应用半定量RT-PCR法（sqRT-PCR）测定细胞内NHE-1 mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测（TUNEL法）观察细胞凋亡情况。结果 转染NHE-1核酶基因的细胞,NHE-1 mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低,细胞凋亡率显著增加,电镜示细胞凋亡,凋亡小体形成。结论 NHE-1核酶基因转染可通过NHE-1抑制、细胞内酸化,显著诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡。     

RNA干扰Stat3基因对EC-1细胞侵袭转移和增殖能力的影响

目的：构建针对信号转导子和转录激活子3（Stat3）基因的siRNA表达载体,研究Stat3基因沉默对人食管鳞癌EC-1细胞侵袭转移及增殖的影响.方法：构建pSUPER-EG-FP-Stat3siRNA表达载体,转染EC-1细胞,RT-PCR,Western Blot检测Stat3的表达;Boyden-chamber体外侵袭实验检测siRNA对细胞侵袭转移能力的影响,MTT法检测siRNA对细胞增殖能力的作用.结果：酶切和测序证实pSUPER-EGFP-Stat3siRNA表达载体构建成功;RT-PCR,Western Blot结果表明,siRNA能有效地降解EC-1细胞中Stat3基因的mRNA,下调Stat3蛋白的表达;转染siRNA后,与对照组相比,EC-1细胞侵袭转移和增殖能力明显下降.结论：成功构建针对Stat3基因的siRNA表达载体,可有效沉默Stat3基因在食管鳞癌EC-1细胞中的表达,抑制EC-1细胞的侵袭转移及增殖能力,可为食管癌的基因治疗提供理论依据.     

STAT3基因沉默对结肠癌细胞SW480凋亡的影响

目的:探讨转染信号传导和转录激活子3(STAT3)的短发夹RNA(shRNA)对结肠癌细胞SW480凋亡的影响,为结肠癌的基因治疗提供实验依据。方法:设计、构建针对STAT3的shRNA真核表达载体,脂质体法转染SW 480细胞,MTT法观察细胞增殖情况,流式细胞仪检测检凋亡,QRT-PCR检测STAT3、Bcl-2、Caspase-3mRNA的变化。结果:成功构建了携带STAT3基因的shRNA的重组质粒,PCR和测序证实重组质粒构建正确。重组质粒转染结肠癌细胞后,细胞增值活性明显减弱,细胞阻滞于G1→S期,并出现早期凋亡。重组质粒转染组STAT3 mRNA的表达与对照组相比明显减弱(P<0.01),同时Bcl-2表达增强、Caspase-3mRNA表达减弱(P<0.05)。结论:STAT3 shRNA能抑制结肠癌细胞的增值,促进其凋亡,其促凋亡机制可能与STAT3基因沉默后影响Bcl-2、Caspase-3凋亡基因的表达有关。     

靶向STAT5的siRNA诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡

目的 采用RNA干扰技术阻断STAT5基因的表达,观察其对人肝癌SMMC-7721凋亡的影响.方法 构建3种靶向STAT5的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,采用LipofectamineTM2000转染肝癌细胞SMMC-7721;分别采用半定量RT-PCR、Western blot技术检测转染前后SMMC-7721细胞STAT5 mRNA和蛋白质表达的变化;采用透射电镜技术观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 3条靶向STATS的序列特异性的siRNA可以有效地抑制SMMC-7721细胞STATS mRNA和蛋白质表达,STAT5 mRNA表达抑制率分别为70.43%、43.02%、45.07%,STAT5蛋白表达抑制率分别为67.45%、37.36%、41.86%;转染靶向STAT5的siRNA真核表达载体48 h后出现凋亡细胞的典型形态学变化,并诱导25.61%的SMMC-7721细胞发生凋亡.结论 靶向STAT5的siRNA真核表达载体可以有效、特异地阻断SMMC-7721细胞STAT5基因的表达,并能够诱导SMMC-7721细胞凋亡,STAT5 siRNA在人肝癌的基因治疗中可能具有潜在的应用价值.     

转录因子E2F-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建细胞周期相关转录因子E2F-1RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法：选取E2F-1基因的19nt特异性序列,设计针对E2F-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒48h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度。结果：双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293FT细胞包装E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5×10^7TU/mL。结论：成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为研究E2F-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体。     

短发夹状干扰RNA沉默信号传导和转录激活子3基因表达对大肠癌细胞的影响

目的构建携带信号传导和转录激活子3（STAT3）基因短发夹状干扰RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰STAT3表达对大肠癌细胞HT-29细胞增殖的影响。方法从GenBank STAT3mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,行PCR和测序鉴定。重组质粒瞬时转染大肠癌HT-29细胞,实时定量PCR、Western blot检测STAT3的表达。筛选出最佳重组质粒,转染大肠癌细胞后,MTT检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功构建了携带有STAT3基因的shRNA的重组质粒,PCR和测序证实重组质粒构建正确。3种重组质粒对大肠癌HT-29细胞STAT3的表达有明显的抑制作用。筛选出的最佳重组质粒转染大肠癌细胞后,细胞增殖能力明显减弱;细胞周期分析显示,G0/G1期细胞占（74.80±1.85）%,S期细胞占（15.72±2.26）%,与对照组差异显著（P〈0.01）。结论干扰STAT3基因的表达可以有效抑制大肠癌HT-29细胞的生长。     

RNA干扰A549细胞核干细胞因子基因表达

目的探讨A549细胞株NS基因的表达干扰后,A549细胞株的mRNA表达水平及细胞增殖变化。方法构建NSshRNA真核表达载体,转染A549细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,RT-PCR检测NS基因沉默,MTT检测细胞增殖情况。结果构建的NSshRNA真核表达载体经菌落PCR和测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR检测显示构建的shRNA表达载体转染A549细胞后可显著降低NSmRNA的表达;M1vr结果显示干扰后细胞增殖速率明显减低。结论成功构建了一组针对NS基因的shRNA真核表达载体,转染A549细胞后NS基因表达被特异性沉默,且细胞增殖受到明显抑制,通过RNAi技术实现NS基因沉默可能是一种较有前景的肿瘤治疗方法。     

HBVX基因在HL-7702肝细胞中的表达促进细胞凋亡并上调HSP70基因的表达

目的研究乙型肝炎病毒X（HBVX）基因在肝细胞HL-7702中的稳定表达对其细胞凋亡和表达HSP70的影响,并探讨二者之间的关联。方法将已构建好的HBVX基因真核表达载体pcDNA3-X转染人肝细胞HL-7702,48h后经G418筛选出稳定表达HBVX基因的肝细胞株（L02/HBx）。RT-PCR、蛋白印迹实验鉴定L02/HBx细胞HBVX基因的稳定表达。以转染空质粒肝细胞（L02/pcDNA3）为对照,运用流式细胞分析、TUNEL分析和DNA ladder观察检测L02/HBx细胞凋亡情况。基因芯片技术筛查L02/HBx和L02/pcDNA3两组肝细胞差异表达的凋亡相关基因,并运用蛋白印迹实验技术对差异表达的HSP70基因进行蛋白水平验证。 结果RT-PCR和蛋白印迹实验显示,L02/HBx细胞中有HBVX基因mRNA和蛋白的表达。流式细胞和TUNEL分析显示,L02/HBx细胞组的凋亡率显著高于对照组L02/pcDNA3,DNA ladder可观测到L02/HBx的凋亡现象,而对照组未观测到。两次基因芯片结果筛查出L02/HBx细胞组与对照组差异表达基因HSP70,蛋白印迹实验进一步证实HSP70在L02/HBx细胞中的蛋白表达显著高于未表达X基因的肝细胞组。结论HBVX基因在肝细胞HL-7702中的表达促进了肝细胞的凋亡,上调了肝细胞中HSP70基因的表达,从而在乙型肝炎病毒致肝细胞癌变的过程中起重要作用。     

慢病毒载体介导的shRNA对小鼠T细胞CD28基因表达的影响

目的探讨编码针对小鼠CD28的短发卡状RNA（short hairpin RNA,shRNA）的慢病毒载体对小鼠T细胞CD28基因表达的影响。方法设计并合成3对靶向小鼠CD28的特异性干扰序列和1对非特异性干扰序列,亚克隆入慢病毒载体pLB中,构建出重组慢病毒干扰质粒,行PCR鉴定并进一步测序证实。分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,生产慢病毒颗粒,并依据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平检测病毒滴度。慢病毒感染小鼠脾淋巴细胞,实时荧光定量RT-PCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测CD28的表达。结果PCR鉴定及测序结果证实4种重组慢病毒质粒均构建成功,重组慢病毒滴度均达1×1011U/L。感染T细胞后,CD28基因mRNA和蛋白表达量均有明显下降。结论成功构建了CD28 shRNA慢病毒载体,可有效下调小鼠T细胞CD28基因的表达,其为进一步研究体内沉默CD28基因控制移植物抗宿主病奠定了基础。     

过表达Plk-1对gemcitabine诱导的胰腺癌细胞化疗敏感性的影响

目的观察Plk-1基因过表达对gemcitabine诱导胰腺癌细胞AsPC-1化疗敏感性的影响。方法①将携带有人外源性Plk-1基因的真核表达质粒转染AsPC-1细胞系设为处理组,转染空载体设为对照组,无处理组设为空白组,转染24 h后,提取细胞总RNA和总蛋白,利用RT-PCR法及Western blot鉴定AsPC-1细胞内Plk-1基因和蛋白表达水平。②采用流式细胞术检测转染组细胞凋亡的改变。③不同浓度gemcitabine作用于转染细胞,MTT法测定转染48 h后细胞增殖能力。结果①测序结果表明成功的从AsPC-1细胞总RNA中扩增Plk-1基因。RT-PCR结果表明：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1组及pcDNA3.1/Plk-1组24 h各组细胞内Plk-1 mRNA相对量分别为（2.14±0.16）、（2.18±0.15）、（2.58±0.18）,转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。Western blot结果显示：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1及pcDNA3.1/Plk-1组24 h各组细胞内Plk-1基因的蛋白表达水平为（0.989±0.018）、（1.022±0.021）、（1.243±0.143）,转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。②在gemcitabine作用下,pcDNA3.1/Plk-1转染组细胞凋亡率明显低于未转染组及空载体转染组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。③AsPC-1/Plk-1转染组细胞的生长抑制率亦明显高于未转染组及空载体转染组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论胞浆过表达Plk-1活性分子可明显降低gemcitabine诱导的AsPC-1细胞凋亡,增强其对化疗药物的耐受性。     

Id2 shRNA慢病毒载体的构建及其转染后对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的构建能高效敲减分化抑制因子2(Id2)基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,并观察敲减Id2对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法设计并合成特异性针对Id2基因的shRNA序列,将其构建到慢病毒载体pGCSIL-GFP中。以含有Id2基因的质粒为模板,扩增Id2基因cDNA序列的特异性片段,插入真核表达载体pEGFP-N1-3FLAG。构建含Id2基因质粒和不同靶点的RNAi慢病毒载体,共转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度慢病毒感染U251细胞株。MTT法检测敲减Id2后胶质瘤细胞增殖的改变,RT-PCR检测Id2敲减后U251细胞caspase 3的表达。结果构建后载体的PCR鉴定及DNA测序结果与预期一致。与对照组相比,转染Id2 shRNA的U251细胞增殖降低,凋亡率升高,caspase3表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建的针对Id2基因的RNA干扰慢病毒载体体外转染可抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡。