重组人白细胞介素-18表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆人白细胞介素 18(IL 18)基因 ,构建重组表达质粒 ,在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素 18(rhIL 18) ,并对其生物学活性进行初步鉴定。方法利用RT PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增出成熟肽编码区cDNA(496bp) ,克隆到表达载体pBV2 2 0质粒中 ,Western印迹证实rhIL 18在大肠杆菌DH5α中获得表达。经分子筛层析法初步纯化后 ,用溴化四唑蓝 (MTT)比色法测定复性的rhIL 18的体外活性。结果rhIL 18表达量占总菌体蛋白的 2 7%左右 ,经纯化得到纯度达 96 %以上的rhIL 18。实验显示rhIL 18协同IL 2 (10U/ml)诱导NK细胞细胞毒活性。结论rhIL 18具有较好的生物学功能 ,应予进一步的研究     

人白介素－12在毕赤酵母中的表达、纯化与活性测定

人IL－12是目前发现的白细胞介素中对人体免疫活性细胞诱导和调节作用最强和范围最广的一种。具有广阔的应用前景。目前，IL－12的重组表达主要使用高等真核表达系统。我们构建了pPIC9k－p35和pPICZα－p40重组质粒，共转化毕赤酵母KM71菌株，获得可以同时表达 IL－12双亚基的稳定表达株，通过离子交换亲和层析、疏水亲和层析进行纯化，获得的 rhIL－12样品纯度大于97％，总得率大于60％，降低了工艺难度，有利于进一步大规模制备工作的开展。此外，本研究才用的纯化工艺获得的纯化样品纯度＞97％，得率＞60％，经 PBMC 细胞法测定，比活性达到1．36×107 IU? mg －1，与商品化的rhIL－12标准品相当，为规模化制备和进一步研究应用提供了坚实的基础。     

组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过PCR的方法从人t-PA基因上扩增到r-PA基因的编码序列，并克隆到pMD18-T载体中，DNA测序与文献报道完全一致，该基因被克隆到多用途表达载体pET28a中，重组表达载体r-PA/pET28a转化E.coliBL21(DE3)，培养表达，SDS-PAGE分析可见M，约39000的蛋白条带，约占细胞内总蛋白的30%以上，体外溶圈法测定活性表明该重组蛋白具有较好的纤溶活性。     

SC55494造血刺激活性的研究

在小鼠前B细胞系BaF3中进行基因转染获得了表达人白细胞介素-3受体（IL－3R）α和α／β亚单位的阳性克隆。细胞增殖功能检测显示，IL-3R激动剂SC55494对表达α和α克隆的造血刺激活性分别比白细胞介素-3（IL-3）高500和100倍，对人骨髓CFU－Mix集落形成的刺激能力比IL－3大20倍，信号传导实验证明，SC55494增强的造血潜能与胞浆信号分子Jak2的酪氨酸磷酸化有关。上述结果意味着SC55494可能会作为生长因子家族的新成员而用于临床。     

TOPO克隆构建SARS-CoV M蛋白基因裂殖酵母表达载体及其稳定性

目的 利用TOPO克隆法构建SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母重组表达载体，并验证重组载体在宿主细胞中的稳定性。方法 运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术从SARS-CoV RNA中扩增出M蛋白基因,AT克隆构建出序列正确的pMD18-T-M重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-M载体上亚克隆出M蛋白基因，与裂殖酵母表达载体pNMT1-TOPO进行TOPO克隆,构建出重组表达载体pNMT1-M,转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性转化子后进行测序鉴定。将序列正确的pNMT1-M重组载体电转化入裂殖酵母TCP1菌株中,在EMM培养基中诱导表达,连续传代100代，在EMM+T培养基中验证其稳定性。结果 RT-PCR获得666 bp的片段,pMD18-T-M重组载体经测序验证序列正确；重组表达载体pNMT1-M经菌落PCR和测序鉴定均正确;重组裂殖酵母菌经诱导后，SDS-PAGE检测出了表达条带;重组表达载体连续传代后,未发现丢失现象。结论 成功地构建出了SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母表达载体，验证了其在裂殖酵母中能稳定地进行遗传,为下一步的表达优化、活性和功能研究垫定了基础.     

内皮抑素基因的获取及其分泌型质粒构建的研究

目的：通过分离、克隆、重组出内皮抑素基因并测定其基因序列，探讨单独或联合其它血管抑制因子基因及其表达产物经纯化作为生物制品可用于肿瘤治疗的研究。方法：采用RT-PCR技术自肝癌组织中扩增出内皮抑素目的基因片段，采用pEZZ18为分泌型质粒载体构建含内皮抑素基因的重组质粒并在大肠杆菌DH5α内进行表达。结果：成功获得内皮抑素基因并经序列测定证实。序列分析显示与已发表的内皮抑素基因无明显差异。克隆至pEZZ18载体构建成功含内皮抑素基因的分泌型重组质粒。结论：构建的重组质粒具有外分泌特性，为成功分泌表达内皮抑素、快速纯化及临床应用打下良好基础。     

人β-趋化因子基因在植物细胞表达的定量测定

为了利用植物细胞作为生物反应器生产基因工程药用蛋白，将克隆的人β－趋化因子RANTES基因经Ti质粒衍生的双生表达载体导入根癌农杆菌（A.tumefaciens)菌株。通过共培养法转化烟草（N.tobacum)外植体，以抗生素筛选转化细胞并再生转基因植株。经生物素标记探针杂交确诊RANTES基因的整合，用免疫斑点印[迹法对重组基因表达水平进行定量测定。结果表明，人RANTES基因已在烟草细胞中成功地整合与表达，这为在植物细胞中大量生产基因重组药物打下了基础。     

表达HA基因的传染性喉气管炎病毒重组体保护鸡抵抗致死性禽甲型流感病毒感染

UL5 0基因是传染性喉气管炎病毒(IL TV)复制的非必需基因 ,UL 5 0能被增强的绿色荧光蛋白基因 (EGFP)所取代 ,它含有人巨细胞病毒立即早期启动子 (PH C MV -IE)和多聚 A尾信号。将克隆的 H5亚型禽流感病毒 (AIV)的血凝素 (HA)基因取代 EGFP表达框 (同时保留 PH CM V -IE和聚 A尾基因 ) ,形成正反两个方向的重组体。与 HA基因转录方向一致的重组体记为 ILTVΔUL5 0 -HAb,相反的为 IL TVΔUL5 0 - HAa。作者用三种活病毒重组体疫苗 IL TVΔUL 5 0 (IL TV缺失了 ΔUL5 0 )、 IL TVΔUL5 0 - HAb、IL TVΔUL 5…     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

人脂联素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人脂联素（adiponectin）基因，并在大肠杆菌宿主系统中高效表达出adiponectin蛋白进行鉴定。方法：从人皮下脂肪组织提取总RNA，确认其正确性后经RT-PCR扩增得到全长cDNA片段，此片段经纯化回收后克隆至pMD 18-T载体，经行DNA序列分析，进一步克隆构建到表达载体至pET-DEST42中，用IPTG在大肠杆菌中诱导表达。结果：含重组adiponeetin质粒的大肠杆菌经0．4mmol／L的IPTG诱导6h后有高表达。结论：adiponeetin基因的克隆构建和在大肠杆菌中的表达获得成功。     

小鼠H—2D^d基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

目的：构建BALB／c小鼠H－2D^d基因的逆转录病毒表达载体。方法：采用反转录PCR从BALB／c小鼠脾细胞基因组中，扩增H－2D^d的编码基因，插入克隆载体pGEM-T中。经EcoR I和Xho I双酶切后，亚克隆法于逆转录病毒载体pMSCV的相应酶切位点，构建pMSCV-H2D^d重组表达质粒，并经双酶切和序列测定鉴定。结果：用EcoR I和Xho I双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pMSCV。克隆H－2D^d的编码基因经序列测定证实，与献报道完全一致。结论：成功构建小鼠H－2D^d编码基因的逆转录病毒载体，为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用及临床移植的基因治疗应用奠定了基础。     

TNFHis-IL-11温度诱导融合表达载体的构建

目的构建TNFHis IL 11温度诱导融合表达载体。方法用EcoRI和PstI消化pGEMIL 11质粒后 ,回收IL 11基因片段 ,以同样的酶切位点克隆入TNFHis表达载体。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α菌株 ,经 4 2℃温度诱导 4 .5h后做SDS PAGE和免疫活性鉴定。结果融合蛋白获得了表达 ,其分子量为 37kD ,其表达量占菌体总蛋白的 2 5 %。免疫印迹反应结果显示 ,表达的融合蛋白可与抗IL 11多克隆抗体产生阳性反应。该融合蛋白经盐酸羟胺裂解后可获得IL 11单体。结论TNFHis IL 11温度诱导融合表达载体构建成功。     

人再生肝脏蛋白磷酸酶-3基因的克隆与测序

目的:从人结肠癌肝转移病灶标本中提取染色体RNA,PCR扩增及克隆人PRL-3基因.方法:收集人结肠癌肝转移标本,提取总RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增PRL-3序列,A-T克隆于pMD-18T载体中,转化大肠杆菌JM109株,提取质粒,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果:通过酶切、PCR与测序三种方法证实所获得的基因片断为PRL-3基因.结论:克隆到序列正确的人源性PRL-3基因,为实现PRL-3基因的高效表达及制备相应抗体奠定了基础.     

人TIMP-2基因逆转录病毒重组体的构建及表达

目的：构建含人ＴＩＭＰ－２基因可调控逆转现毒重组体。方法：通过四步亚克隆将编码人组织金属蛋白酶抑制剂－２（ＴＩＭＰ－２）的基因片段从表达载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中切下,定向插入经改良的逆转录病毒载体ｐＬ－ＭＴ上,以限制性内切酶鉴定插入方向是否正确。结果：结果：限制性内切酶谱分析与理论计算相等。结论：含人组织金属蛋白酶抑制剂ＴＩＭＰ－２基因可逆转录病毒重组体构建成功,为体外胶原代谢的基因调控研究提供     

咪喹莫特抑制哮喘大鼠气道炎症转录水平的研究

目的：探讨咪喹莫特拮抗支气管哮喘气道炎症的分子机制。方法：卵清蛋白腹腔注射与雾化吸入建立大鼠哮喘模型，采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）测定了不同剂量咪喹莫特对哮喘大鼠肺组织白介素（IL）－4mRNA、IL－5mRNA、IL－12mRNA和干扰素（IFN）－γ mRNA表达的影响。结果：咪喹莫特各治疗组及地塞米松组能显抑制哮喘大鼠肺组织中IL－4、IL－5mRNA的表达（与哮喘相比，均为P＜0．001；与空白对照组比，均为P＞0．05），各咪喹莫特组同时能显增加IL－12、IFN－γ mRNA表达（与哮喘组比，均为P＜0．001；与空白对照组比，均为P＞0．05），而地塞米松组不能增加IL－12、IFN－γ mRNA的表达（与哮喘组比，均为P＞0．05；与空白对照组比，均为P＜0．001）。咪喹莫特各治疗组间无显性差异。结论：咪喹莫特能降低哮喘大鼠肺组织中IL－4和IL－5基因转录，增加IL－12和IFN－γ基因转录，进而 抑制嗜酸性粒细胞的聚集、活化，发挥其抗气道炎症的作用。     

新型降钙素的基因合成与克隆表达

借助计算机辅助设计了一种新的人降钙素类似物（新型降钙素）。根据密码子偏爱性原理及基因操作原则了它的基因,运用化学法和酶法相结合的技术合成了该基因,并克隆到质粒ｐＵＣ１９中,ＤＮＡ测序验证正确。该基因被克隆到融合型表达本ｐＧＥＸ－２Ｔ中,重组融合型表达载体ｎＣＴ／ｐＧＥＸ－２Ｔ转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,增减表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析可见Ｍｒ约３１０００的融合蛋白带,融合蛋白占细胞内总蛋白３４％。Ｗｅ     

人再生肝脏蛋白磷酸酶-3基因的克隆与测序

目的:从人结肠癌肝转移病灶标本中提取染色体RNA,PCR扩增及克隆人PRL-3基因.方法:收集人结肠癌肝转移标本,提取总RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增PRL-3序列,A-T克隆于pMD-18T载体中,转化大肠杆菌JM109株,提取质粒,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果:通过酶切、PCR与测序三种方法证实所获得的基因片断为PRL-3基因.结论:克隆到序列正确的人源性PRL-3基因,为实现PRL-3基因的高效表达及制备相应抗体奠定了基础.     

大肠杆菌caiAB基因的克隆与表达

从E.coli MC4100菌株的染色体DNA中利用鸟枪法克隆含编码豆甜菜碱还原酶和L－肉碱脱水酶的caiAB基因片段，并经序列分析验证。由重组质粒pZJD-1480亚克隆得到pT7-A以及pT7-B重组表达质粒，后者转入E.coli BL21(DE3)菌株中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）上分子质量为40ku附近可见明显的表达蛋白带。     

HP450基因的克隆及质粒载体的构建和鉴定

目的HP450基因的克隆载体构建。方法用RT-PCR技术克隆HP450基因,T-A连接到PMD18-T载体,经菌液PCR,酶切鉴定.构建成PMD18-HP450重组质粒载体。结果测序显示完全正确,实现了HP450基因的克隆和质粒载体的构建。结论可以对重组成功的HP450基因进行体外表达和动物的体内应用.     

人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因转移表达及对慢性乙型肝炎细胞免疫功能影响的实验研究

为了探讨人GM－CSF基因转移表达对慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的影响，运用携带人GM－CSF基因的重组腺病毒转染慢性乙型肝炎患者PBMCs，表明以重组腺病毒为载体的人GM－CSF基因在转染细胞中，可持续表达1．26±0．065～2．09±011ngs·ml-1·24h－1水平26天左右。通过观察慢性乙型肝炎患者PBMCs在GM－CSF基因转架前后及分泌GM－CSF细胞和慢性乙型肝炎患者PBMCs已共同培养前后淋巴细胞增殖反应和CD3、CD4、CD8、CD16、CD19淋巴细胞比率的变化，提示GM－CSF基因转染的淋巴细胞及与分泌GM－CSF细胞共同培养的淋巴细胞增殖反应增强（P＜0．01），CD3、CD4、CD8、CD16、CD19淋巴细胞比率无明显变化（P＞0．05）．小剂量IL－2（25IU／ml）存在时，GM-CSF基因转染及与分泌GM－CSF细胞共同培养的PBMCs中CD3、CD4、CD16淋巴细胞比率升高（P＜0.01），CD8、CD19淋巴细胞比率未见明显变化（P＜0.05）。