大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63毒性检测及佐剂效果研究

目的对已构建的大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63进行表达、纯化、毒性检测,并对其佐剂活性进行研究。方法采用已知的最佳诱导表达条件进行诱导表达,诱导表达产物经亲和层析、纯化浓缩后,进行毒性检测。将纯化后的mLT63联合幽门螺旋杆菌(Hp)亚单位疫苗UreB、Omp11经口途径免疫BALB/c小鼠,免疫后取血清、胃组织提取液、粪便提取液进行ELISA试验,检测其中的特异性抗体水平,将结果进行统计分析。结果经家兔回肠袢毒性试验验证本室构建大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63没有毒性,mLT63联合Hp亚单位疫苗UreB、Omp11免疫小鼠实验证实mLT63具有佐剂活性。结论本室构建、表达的大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63无毒,并具有免疫佐剂的活性。     

人护骨素-谷胱甘肽转硫酶融合蛋白基因的构建与表达

目的 克隆人护骨素(OPG)成熟肽段编码区基因并研究在大肠杆菌中OPG-谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合蛋白的表达。方法 采用RT-PCR从人骨肉瘤细胞系MG63的总RNA中扩增OPG成熟肽段编码区cDNA，构建原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌后经0．1mmoL／L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白，以SDS—PAGE电泳及Western印迹鉴定蛋白表达，应用谷胱甘肽-Sepharose4B柱亲和层析纯化目的蛋白。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，转化菌株可表达人OPG-GST融合蛋白，蛋白表达量约为菌体总蛋白的15．5％。Western印迹表明在相对分子质量66000处融合蛋白能与人OPG多克隆抗体特异性结合。经亲和层析后获得纯度为95．7％的OPG—GST融合蛋白。结论 获得人OPG成熟肽段全长cDNA，在大肠杆菌中表达OPG—GST融合蛋白并以亲和层析法进行纯化。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA与IntiminC300融合蛋白的构建表达

目的构建表达肠血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7Ⅲ型分泌蛋白EspA与紧密粘附素G端免疫保护性片断（Intindn C300）的融合蛋白（EspA-IntiminC300）。方法采用PCR技术从EHEC0157lH7基因组中扩增EspA的编码基因espA及IntiminC300的编码基因eaeC300，T-A克·隆后依次构建至表达载体pET-28a（＋），转化宿主细胞E．coliBL21（DE3），测序鉴定，IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测其表达量及表达形式，亲和层析法纯化目的蛋白，免疫印迹分析免疫反应性。结果PCR法自EHEC0157tH7基因组中分别扩增出了约580bp（espA）和900bp（eaeC300）的目的片段，将二者融合构建了重组质粒pET-28a（＋）-espA-eaeC300，测序结果与理论预测值一致性为99．9％（1501／1502）。融合蛋白在工程菌中表达量约40％，PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量（Mr）约54×10^3Da，破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形武表达，包涵体洗涤后纯化，获得目的蛋白纯度约90％。免疫印迹显示融合蛋白能分别与兔抗EspA和IntiminC300血清发生免疫反应。结论高效表达了融合蛋白（EspA-IntiminC300），此融合蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性，为研制EHEC0157：H7多亚单疫苗奠定了基础。     

人重组载脂蛋白E在大肠杆菌中的表达和纯化

用含有载脂蛋白EcDNA的PET32a原核表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），使之高效表达载脂蛋白E-thioredoxin融合蛋白，利用融合蛋白上的一段组氨酸序列，用镍离子亲合层析柱进行分离纯化。由于在载脂蛋白E和thioredoxin之间存在凝血酶的识别位点，用凝血酶消化后，经SephacrylS-300凝胶过滤得到人重组载脂蛋白E。用此方法可以从1L大肠杆菌培养液中纯化20-30mg高纯度的各种载脂蛋白E异构体和非自然存原突变体。方法简便，产量高，纯度达95%以上。     

重组人神经肽Y融合蛋白的表达、纯化及生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-NPY转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni2+-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析NPY蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a-NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白.重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了NPY的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-NPY在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对NPY蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

大肠杆菌LTKA63突变体的构建及重组LTKA63免疫佐剂活性机理的研究

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)基因减毒突变体LTKA63及其原核表达系统,探讨重组LTKA63(rLTKA63)粘膜免疫佐剂活性的机制。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA基因,利用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序。采用无His-tag的原核表达载体pET-15b,构建LTKA63原核表达系统,通过SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA基因条带。与报道的LTA序列比较,所克隆的LTA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.03%~99.61%和98.33%~99.22%。LTA基因定位突变后获得序列正确的LT-KA63突变体。rLTKA63表达量占细菌总蛋白的15%左右。rLTKA63作用后Th1和Th2细胞较阴性对照组分别增加21.9%和36.2%。结论本文成功地构建了LTKA63原核表达系统,所表达的rLTKA能同时激活Th1和Th2细胞。     

重组人神经肽Y受体Y1融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y1受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定,表达产物包涵体经Ni2+-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y1受体蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a- Y1重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y1融合蛋白.重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了Y1受体的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-Y1在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y1受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

重组人神经肽Y受体Y5融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y5受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y5转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni2+-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y5受体蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a-Y5重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y5融合蛋白.重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了Y5受体的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-Y5在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y5受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y2受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y2转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western 印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni~(2+)-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y2受体蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a-Y2重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y2融合蛋白.重组蛋白经Ni~(2+)-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了Y2受体的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-Y2在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y2受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

恶性疟原虫疫苗研究Ⅵ．多价保护性抗原的免疫原性

利用工程菌ＰＷＲ－１／ＪＭ１０９以融合蛋白的形式表达人工合成的恶性疟重组基因ｐｆＣＭＲ。经培养、ＩＰＴＧ诱导后收集菌体、超声波破菌、透析、电泳纯化等步骤，分离表达蛋白。结果在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中显示６５ｋＤ蛋白诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的体液免疫和细胞免疫反应进行了观察。结果表明，纯化后的蛋白免疫鼠血清能与表达产物粗提物产生特异的免疫反应，其抗体滴度高达１∶５１０２；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ在６５ｋＤ处亦产生特异免疫反应；另在体外用ＰＨＡ和粗提物以及纯化蛋白刺激免疫鼠脾细胞，其Ｔ淋巴细胞转化率分别高达４４．２０±５．２６％、２４．００±４．７４％和３３．５０±３．８４％。提示融合蛋白中含有恶性疟原虫抗原Ｔ－／Ｂ－细胞位点。     

Combinations of protein polysaccharide conjugate vaccines for intranasal immunization

The ability of 2 mutants of heat-labile Escherichia coli enterotoxin (LTK63 and LTR72) to enhance the immunogenicity of 2 protein polysaccharide conjugate vaccines, Neisseria meningitidis group C (MenC) and Haemophilus influenzae type B (Hib), both of which are conjugated to the nontoxic mutant of diphtheria toxin (CRM197), after intranasal (inl) immunization in mice was evaluated. In addition, the question of whether combining both vaccines in a single formulation with heat-labile E. coli enterotoxin mutants reduced the response to either vaccine was investigated. The results showed that potent serum antibody responses against MenC and Hib could be elicited by inl immunization in combination with the mucosal adjuvants. Moreover, IgA mucosal responses were induced only in animals immunized through the inl route. Finally, the coadministration of 2 conjugate vaccines simultaneously did not adversely affect the responses against either. These studies support the rationale for developing mucosal vaccines, based on combining protein polysaccharide conjugates with heat-labile E. coli enterotoxin mutants, for infants and young children.     

马链球菌兽疫亚种中国株的类M蛋白基因抗原表位片段的克隆与表达

目的　构建马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp zooepidemicus)中国株的类M蛋白基因抗原表位片段的重组表达质粒 (pET -Szp) ,并检测表达产物的免疫反应性。 方法　根据GenBank登录的马链球菌兽疫亚种纽约分离株w6 0类M蛋白基因序列设计和合成引物 ,以该菌中国分离株ATCC35 2 4 6的基因组DNA为模板 ,扩增类M蛋白基因 5’端第 5 83～ 10 6 8bp片段 ,并按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pET - 32a(+)中 ,将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1株 ,用IPTG诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和免疫印迹对表达蛋白进行初步分析。结果　扩增出 4 86bp的马链球菌兽疫亚种ATCC35 2 4 6的类M蛋白基因片段 ,该基因在大肠杆菌表达系统中经诱导 ,得到分子量为 5 0 0 0 0的表达产物 ,免疫印迹表明该产物具有特异的免疫反应性。结论　成功构建了表达马链球菌兽疫亚种中国株类M蛋白片段的重组表达质粒 ,并实现在大肠杆菌中表达 ,为重组类M蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

日本血吸虫腺苷酸激酶基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的　将亚克隆入 pET3 2a( +)质粒的日本血吸虫腺苷酸激酶 (adenylatekinase ,AK )基因进行表达及蛋白纯化 ,并对表达产物的免疫反应性进行评价。　方法　将重组表达质粒 pET3 2a( +) AK转入宿主菌大肠埃希菌BL2 1,异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达后超声裂菌 ,离心 ,取上清进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE) ;将SDS PAGE后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上 ,分别用 6 组氨酸 ( 6 His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6wk的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清为一抗进行蛋白质印迹试验 (Westernblotting) ;用金属Ni螯合物亲和层析树脂 (Ni NTA)层析柱纯化目标蛋白 ;以纯化后的融合蛋白为包被抗原 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测正常兔血清和血吸虫感染兔血清。　结果　重组菌用IPTG诱导表达后进行SDS PAGE ,于相对分子质量 (Mr) 40 0 0 0处见一特异表达带 ,与预期表达的融合蛋白大小相符 ;Western印迹分析显示该重组的融合蛋白带有预期的 6 His基团 ,且能与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清发生特异性反应 ;ELISA结果显示纯化的重组AK蛋白可以特异识别血吸虫感染兔血清。　结论　AK基因在工程菌中以可溶性融合蛋白的形式得到表达 ,该重组蛋白与血吸虫感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清具有特异的免疫反应性。     

幽门螺杆菌粘附素与大肠杆菌LtB融合疫苗的口服免疫与预防试验

目的　观察幽门螺杆菌粘附素HpaA与大肠杆菌LtB融合蛋白质经口服免疫BALB/c小鼠后机体产生的免疫应答和蒙古沙鼠免疫预防作用。方法　用PCR方法扩增HpaA和LtB目的基因片段 ,将LtB与 pPIM质粒连接后 ,再与HpaA基因连接 ,转化大肠杆菌DH5α ,经酶切获得含有ltB -hpaA的pPIM -ltB/hpaA融合质粒。将重组质粒转化E coliBL2 1(DE3) ,筛选获得重组工程菌 ,经发酵、包涵体提取 ,复性 ,纯化获得LtB -HpaA。BABL/c小鼠设正常对照组、单独rHpaA对照组、CT +HpaA实验组、融合蛋白LtB -HpaA组和rLtB +rHpaA实验组 ,免疫 4周后检测血清抗原特异性IgG、IgA和胃冲洗液、肠冲洗液中sIgA。蒙古沙鼠分 3个实验组 ,正常对照 (PBS)组 ,单独HpaA免疫组和LtB -HpaA组 ,免疫 4周 ,于末次免疫后 14天灌活力良好的H pyloriSS1活菌 ,1个月处死动物 ,采集标本 ,用细菌培养和病理切片检查评价蒙古沙鼠的免疫保护作用。结果　融合蛋白LtB -HpaA组及将CT和LtB作为外粘膜佐剂的CT +HpaA组和LtB +HpaA组中血清IgA和IgG、胃冲洗液和肠冲洗液中sIgA含量明显高于单独HpaA组和对照组 ,差异非常显著 (P <0 0 0 1)。蒙古沙鼠融合蛋白rLtB-HpaA组比单纯rHpaA组效果明显 (rLtB -HpaA组保护率为 80 % ,单独rHpaA为 2 0 % )。 结论　融合蛋白质LtB     

人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析

目的 构建HIV-1 HXB2株Tat基因半胱氨酸富集区3'末端移位突变体,经原核表达和纯化,分析该突变体蛋白(Tat-cct)的免疫原性.方法 用PCR方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸)移位至Tat基因的3'末端,获得其突变体DNA序列,并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,转入大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化.以Tat-cct融合表达蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法对该抗血清进行免疫原性检测分析.结果 pET32a-Tat-cct重组质粒可在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,纯化后其融合蛋白相对分子质量约为31 000.Tat-cct重组蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白(1～101位氨基酸)均呈特异性结合反应.结论 Tat突变体重组蛋白Tat-cct能在大肠埃希菌中有效表达.并较好保留其免疫原性,为HIV-1 Tat疫苗的基础研究提供了有价值的实验结论.     

弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白基因的序列分析及其在大肠埃希菌中的表达

目的?摇分析弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白7（dense granule protein,GRA7)基因的异同及在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白。 方法 从弓形虫不同分离株（RH株、ZS2株和GT株）的基因组中特异地扩增出GRA7基因，将目的基因定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠埃希菌JM109并测序。利用互联网上的在线工具CLUSTALW进行序列分析。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）体外诱导pGEX-4T-1/GRA7重组质粒菌的表达，对表达的目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），分别以抗抗谷胱甘肽巯基转移酶（GST）抗体、人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Western blotting分析。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，ELISA 法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。 结果 弓形虫不同分离株GRA7的基因序列相同；pGEX-4T-1/GRA7重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白，Western blotting分析表明该蛋白为GST融合蛋白，且能被人抗弓形虫阳性血清所识别；ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合，而与抗弓形虫阴性血清无反应。 结论 弓形虫不同分离株GRA7基因具有高度保守性；GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达，且该重组蛋白具有一定免疫反应性。     

阴道毛滴虫重组蛋白AP33的制备、鉴定和初步应用

目的 克隆阴道毛滴虫(T.v)重组蛋白AP33的基因(ap33基因),构建其原核表达系统,鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性和免疫原性。方法 从阴道毛滴虫临床分离虫株Tv317抽提总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增ap33基因,T-A克隆后测序,构建pET32a(+)的ap33基因表达载体,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21DE3株,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用抗阴道毛滴虫全虫抗体蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性,用兔抗重组融合蛋白AP33血清的免疫双扩散试验鉴定重组融合蛋白AP33的免疫原性,用阴道毛滴虫临床分离虫株全虫抗原包被的ELISA鉴定重组蛋白AP33的免疫原性。ELISA检测滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体。结果 克隆的ap33基因与已报道的相应核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高。重组融合蛋白AP33表达量较大,能与抗阴道毛滴虫全虫抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗AP33蛋白抗体。T.v临床分离虫株重组蛋白AP33表达率高,能刺激机体产生抗体。ELISA检测50例滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体,阳性率为78.0%(39/50)。结论 构建了阴道毛滴虫ap33基因原核表达系统,重组融合蛋白AP33具有良好的抗原性和免疫原性。     

Construction of prokaryotic expression system of ltB-ureB fusion gene and identification of the recombinant protein immunity and adjuvanticity

AIM: To construct ItB-ureBfusion gene and its prokaryotic expression system and identify immunity and adjuvanticity of the expressed recombinant protein.METHODS: The ureB gene from a clinical Helicobacter pylori (H pylon) strain Y06 and the ItB gene from Escherichia coli (E. coli) strain 44851 were linked into ItB-ureB fusion gene by PCR. The fusion gene sequence was analyzed after T-A cloning. A prokaryotic recombinant expression vector pET32a inserted with ltB-ureB fusion gene (pET32a-ltB-ureB) was constructed. Expression of the recombinant LTB-UreB protein (rLTB-UreB) in E. coliBL21DE3 induced by isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG) at different concentrations was detected by SDS-PAGE. Western blot assays were used to examine the immunoreaction of rLTB-UreB by a commercial antibody against whole cell of Hpylori and a self-prepared rabbit anti-rUreB serum, respectively,and determine the antigenicity of the recombinant protein on inducing specific antibody in rabbits. GM1-ELISA was used to demonstrate the adjuvanticity of rLTB-UreB.Immunoreaction of rLTB-UreB to the UreB antibody positive sera from 125 gastric patients was determined by using ELISA.RESULTS: In comparison with the corresponding sequences of original genes, the nucleotide sequence homologies of the cloned ltB-ureB fusion gene were 100%. IPTG with different dosages of 0.1-1.0 mmol/L could efficiently induce pET32a-ltB-ureB-E, coli BL21DE3 to express the rLTB-UreB.The output of the target recombinant protein expressed by pET32a-ureB-E.coli BL21DE3 was approximately 35% of the total bacterial proteins, rLTB-UreB mainly presented in the form of inclusion body. Western blotting results demonstrated that rLTB-UreB could combine with the commercial antibody against whole cell of H pylori and anti-rUreB serum as well as induce rabbit to produce specific antibody. The strong ability of rLTB-UreB bindingbovine GM1 indicated the existence of adjuvanticity of the recombinant protein. All the UreB antibody positive sera from the patients (125/125) were positive for rLTB-UreB.CONCLUSION: A recombinant prokaryotic expression system with high expression efficiency of the target fusion gene ltB-ureB was successfully established. The expressed rLTB-UreB showed qualified immunogenicity, antigenicity and adjuvanticity. All the results mentioned above laid a firm foundation for further development of Hpylorigenetically engineered vaccine.