腺病毒介导Bcl-2基因对原代螺旋神经节细胞存活的促进作用

目的研究外源性细胞凋亡相关基因Bcl-2对原代培养的螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGCs)存活及突起生长的影响,以期找到保护SGCs的有效方法。方法大鼠螺旋神经节细胞原代培养,免疫印迹法(western blot)检测转染AdEasy系统构建携带Bcl-2和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)的腺病毒后SGCs表达Bcl-2蛋白的水平。免疫细胞组织化学染色鉴定螺旋神经节细胞,计数SGCs的数目。结果AdEGFP/Bcl-2组SGCs的存活数目分别高于AdEGFP组及空白对照组,AdEGFP组的存活SGCs细胞数略少于空白对照组。结论Bcl-2蛋白能促进体外SGCs细胞存活,腺病毒本身有轻微的细胞毒性,但表达外源性Bcl-2基因却可以保护SGCs不受腺病毒细胞毒性损害。     

人Bcl-2基因重组腺病毒的构建及其在螺旋神经节细胞中的表达

目的构建表达人Bcl-2基因的重组腺病毒，并研究其在原代培养螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells，SGC)的表达特性。方法采用细菌内同源重组法，从pUC-CAGGS,／Bcl-2质粒中获得人Bcl-2 cDNA，克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上，后者和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌内同源重组，在HEK293细胞中包装成为重组Ad增强型绿色荧光蛋白／Bcl-2腺病毒，电镜观察病毒颗粒，用病毒感染原代培养的大鼠螺旋神经节细胞，在荧光显微镜下观察感染效率，用逆转录聚合酶链反应方法检测Bcl-2基因在螺旋神经节细胞的转录表达，用Western Blot检测其蛋白的表达。结果经酶切鉴定证实重组腺病毒质粒构建成功，电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在，呈规则六边形。荧光显微镜下观测到感染病毒的SGC细胞发出明亮的绿色荧光。分别在mRNA水平及蛋白水平证实有外源性Bcl-2基因的表达。结论细菌内同源重组法是一种简便、高效的制备方法。构建的重组Ad增强型绿色荧光蛋白／Bcl-2腺病毒能有效的感染SGC，并可在SGC中正确地转录和翻译，为进一步研究腺病毒介导的Bcl-2基因对螺旋神经节损伤的保护作用奠定基础。     

腺病毒介导bcl-2基因转染对顺铂所致大鼠螺旋神经节细胞损伤的拮抗作用

目的 通过腺病毒(adenovirus,Ad)载体介导bcl-2基因转染体外培养的新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGC),探讨bel-2蛋白过度表达对顺铂所致SGC损伤的拮抗作用.方法 体外培养新生大鼠SGC,携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒载体Ad-GFP转染SGC,并行神经丝蛋白(NF200)免疫细胞化学染色鉴定,激光共聚焦扫描荧光显微镜下观察.携带bel-2基因的腺病毒载体Ad-bel-2转染SGC,蛋白质印迹法(Western Blot)检测bcl-2蛋白表达.设立Ad-bcl-2转染加顺铂组(A组),Ad-GFP转染加顺铂组(B组),顺铂组(C组)和正常对照组(D组),顺铂作用浓度为2μg,/ml;顺铂作用48 h后,行各组SGC计数,并通过lmageJ软件测量各组SGC轴突长度.结果 成功分离并培养新生大鼠SGC.激光共聚焦扫描荧光显微镜下观察到腺病毒载体可安全高效转染体外培养的SGC.Ad-bcl-2转染3 d后,Western Blot检测有外源性人bcl-2基因的高效表达,而Ad-GFP转染组和顺铂组未检测到表达.顺铂作用后,A、B、C组部分SGC细胞突起变短、萎缩,胞体缩小、变圆,甚至浮起.A组SGC数目明显多于B组和C组(P值均＜0.01),但少于D组(P＜0.05);A组SGC轴突长度明显长于B组和C组,但短于D组(P值均＜0.01).结论 腺病毒能够安全高效地转染体外培养的新生大鼠SGC.bel-2蛋白过表达对顺铂所致SGC损伤有一定的拮抗作用.     

氧化还原因子1对体外培养大鼠耳蜗螺旋神经节氧化损伤的保护作用

目的 观察表达无嘌呤无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1(apurinic/apyrimidimicendonuclase/redox factor 1,APE/Ref-1)的重组腺病毒感染对H2O2所致体外培养大鼠耳蜗螺旋神经节细胞氧化损伤的保护作用.方法 体外培养大鼠耳蜗螺旋神经节细胞,APE/Ref-1腺病毒表达载体感染48 h后,加入不同浓度H2O2(0、10、25、50、100及300 μmol/L)干预1 h,更换正常培养液后继续培养24 h,通过蛋白免疫印迹分析、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、原位缺口末端标记法(TUNEL)分别检测感染后螺旋神经节细胞APE/Ref-1蛋白表达、细胞活力以及凋亡情况.结果 通过腺病毒感染实现了APE/Ref-1基因在体外培养耳蜗螺旋神经节细胞的过表达,H2O2浓度为50～300 μmol/L时,APE/Ref-1组同对照组比较,细胞活力提高、凋亡率降低(P值均<0.01).结论 腺病毒介导的APE/Ref-1过表达对H2O2所致螺旋神经节细胞氧化损伤具有保护作用.     

慢病毒载体和腺病毒载体转染原代培养的螺旋神经节细胞的比较

目的:比较慢病毒载体和腺病毒载体转染新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(SGCs)的不同转染特性.方法:体外培养新生大鼠SGCs,适当滴度的慢病毒载体和腺病毒载体转染SGCs,于病毒转染后3 d(培养后6 d)和转染后7 d(培养后10 d),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白报告基因(GFP)表达情况和SGCs的细胞形态.行SGC...     

腺病毒载体-人神经营养素3基因治疗豚鼠耳蜗神经元损伤

目的在建立卡因酸(kainic acid,KA)致豚鼠耳蜗兴奋性传入神经元损伤动物模型的基础上,观察腺病毒载体携带的人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因在豚鼠耳蜗内的表达及对豚鼠耳蜗KA损伤后传入神经元的保护作用。方法20只健康白毛红目豚鼠随机分成3组。第1组(6只):经右耳蜗鼓阶一次性灌注KA(4 mmol/L,10μl),建立耳蜗兴奋性损伤动物模型,7 d后再经右鼓阶灌注腺病毒载体-人神经营养素3基因复合物(pAdeasy-NT3)10μl作为实验组(Ad-NT3组)。第2组(7只):经右耳鼓阶灌注KA(4 mmol/L,10μl)作为实验对照组(KA组)。第3组(7只):不做耳蜗灌注,作为空白对照组(Blank组)。Ad-NT3组和KA组均于KA处理后第20天处死,观察Ⅰ型螺旋神经节细胞(传入神经元)的形态变化;空白对照组经相同的存活期后处死,观察Ⅰ型螺旋神经节细胞形态,作为正常对照。结果Ad-NT3组灌注pAdeasy-NT3后第13天,应用免疫组化法可检测到耳蜗内NT-3表达明显,其强度大于KA组;而且Ad-NT 3组耳蜗螺旋神经节细胞减少的数量低于KA组(P<0.001)。结论①豚鼠耳蜗兴奋性损伤后第7天局部应用重组腺病毒pAdeasy-NT3仍可减轻KA对耳蜗螺旋神经节细胞的损伤。②对基因治疗而言,在KA造成螺旋神经节细胞不可逆损伤之前有一段宝贵的治疗时机。     

庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤机制初步研究

目的探讨庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞（spiral ganglion cell,SGC）的损伤机制。方法取出生后2～6天昆明种乳小鼠耳蜗,利用酶消化和机械分离相结合的方法分离出SGC,并进行体外培养。将培养4天的SGC用4%多聚甲醛室温固定30min,以小鼠源神经纤维细丝蛋白（Neurofilament-68/200kDa,NF-L＋H）单克隆抗体作为一抗,按照SP法（streptavidin-perosidase法,链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）对所培养细胞进行免疫细胞化学染色,对SGC作出鉴定。将培养第4天的细胞分为4组：空白对照组及3种浓度的庆大霉素干预组（庆大霉素终浓度分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L）,作用48h后收集各组细胞进行透射电镜分析。结果SGC原代培养获得成功,经NF-L＋H抗体免疫细胞化学染色,其胞质及突起均呈阳性反应,染成棕黄色,一般有相对生长的两个突起,为典型的双极神经元。在透射电镜下观察SGC超微结构,3种浓度的庆大霉素组SGC与空白对照组相比,均出现明显的形态学改变,这种改变与凋亡相关。结论庆大霉素对小鼠耳蜗SGC有直接毒性作用,可导致细胞凋亡,线粒体损伤在这一过程中可能具有重要意义。     

Silibinin induced the apoptosis of Hep-2 cells via oxidative stress and down-regulating survivin expression

Silibinin is an anticancer and chemopreventive natural compound, which is extracted from milk thistle (Silybum marianum). It is reported that silibinin has anticancer efficacy in many malignant tumors. Laryngeal carcinoma is the second most common head and neck squamous carcinoma. In the present work, we investigated the effects of silibinin on laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) cell line Hep-2 cells. We found that silibinin induced the decrease of cell viability in Hep-2 cells with a concentration- and time-dependent manner. Moreover, silibinin resulted in the apoptosis of Hep-2 cells and had synergy effects with arsenic trioxide. Intracellular reactive oxygen species (ROS) accumulation increased because of silibinin exposure. ROS scavenger NAC alleviated the cytotoxicity of silibinin to Hep-2 cells. The mitochondrial membrane potential (MMP) was lost in Hep-2 cells treated with silibinin. Subsequently, silibinin induced the activation of caspase-3 in Hep-2 cells and caspase inhibitor Z-VAD-FMK inhibited the cytotoxicity of silibinin in Hep-2 cells. The survivin expression decreased after Hep-2 cells were treated with silibinin. In conclusion, silibinin induced the apoptosis of Hep-2 cells via oxidative stress and down-regulating survivin expression. Therefore, silibinin is a potential therapeutical agent against LSCC in future.     

In vitro neurite outgrowth induced by BDNF and GDNF in combination with dexamethasone on cultured spiral ganglion cells

BACKGROUND: The efficacy of cochlear implant performance depends, among many other factors, on the number of excitable spiral ganglion cells (SGCs) and the nerve-electrode interface. In earlier animal studies it has been demonstrated that neurotrophic factors are effective to improve SGC survival after experimentally induced deafness. With regard to their anti-inflammatoric and anti-proliferative effects, glucocorticoids (e. g. dexamethasone) are potentially interesting therapeutic agents to reduce connective tissue formation around the inserted electrode. The biological effects of a combined intervention of neurotrophic factors with steroids on SGCs are unknown. Therefore the objective of the study was to investigate possible trophic or even toxic effects of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and dexamethasone on neurite outgrowth of cultivated SGCs. METHODS: By using dissociated postnatal spiral ganglion cells (p3-5) for cultivation in the present study, the influence of the mentioned factors in various concentrations and combinations on neurite outgrowth of SGCs was analysed. RESULTS: Our results indicate significant trophic effects for BDNF (50 ng/ml) and a combination of BDNF with dexamethasone (100 ng/ml) on SGC neurite outgrowth. In contrast, single application of GDNF or dexamethasone in different concentrations caused no significant changes on neurite outgrowth when compared to the control condition. CONCLUSIONS: Neurite outgrowth induced by neurotrophic factors could not be observed to be reduced when dexamethasone is given at the same time. Therefore the demonstrated results provide a basis for further animal studies in this field of research.     

过氧化氢体外诱导大鼠螺旋神经节细胞死亡机制的研究

目的:观察过氧化氢(H2O2)对大鼠螺旋神经节细胞(SGCs)的作用,探讨氧自由基损伤SGCs的机制.方法:新生大鼠SGCB原代培养,取培养第4天细胞加入H2O2,浓度分别为0、100、200、500μmol/L,作用2、4、6 h.光镜下观察细胞形态改变,hochest33258及PI染色,计数受损伤细胞的百分比.结果:在H2O2的作用下,原代培养的SGCs随着H2O2浓度的增加以及作用时间的延长,受损伤的细胞数目呈增加趋势.同时,低浓度(100及200 μmol/L)H2O2作用下,SGCs的损伤主要以凋亡表现为主,PI染色多为阴性;高浓度H2O2(500μmol/L)作用下的SGCs损伤以坏死为主.结论:H2O2可以引起SGCs凋亡,且作用有明显的剂量及时间依赖性.凋亡的发生可能和凋亡相关基因的启动有关,但仍需进一步实验证实.