结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞系恶性转化

目的:研究结晶型硫化镍(NiS)诱发SV-40 Large T抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化作用.方法:体外用不同浓度结晶型NiS多次处理16HBE细胞,软琼脂集落形成和裸鼠成瘤试验鉴定转化细胞的恶性度.结果:细胞培养至35代,发现NiS可诱导16HBE恶性转化.转化细胞排列紊乱,重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P＜0.01),并呈时间剂量依赖关系;转化细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为低分化鳞状细胞癌.结论:结晶型NiS有较强的诱导人支气管上皮细胞恶性转化能力；该转化模型为镍致癌机制的分子水平研究提供了理想的研究系统。     

α粒子诱发转化人支气管上皮细胞系BEP2D中XRCC5等基因的突变检测

目的与方法:用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法观察α粒子诱发人支气管上皮细胞系BEP2D细胞转化过程中相关基因的改变.结果:细胞转化过程中,双链断裂修复基因XRCC5发生碱基突变,改变从转化早期过程就持续存在;而p16基因exon2和hMSH2基因exon12未见变化.结论:XRCC5基因在α粒子照射后早期发生突变,使细胞丧失修复双链断裂损伤的能力,是α粒子诱发支气管上皮细胞转化过程中的启动事件之一.     

结晶型硫化镍及反式-BPDE恶性转化16HBE细胞hMSH2基因甲基化的研究

背景与目的： 对结晶型硫化镍(Nickel sulfide,NiS)及反式二氢二醇环氧苯并芘(anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo[a] pyrene,BPDE)恶性转化及成瘤的人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial,16HBE)hMSH2基因启动子甲基化状况及其mRNA表达进行研究,探讨镍及反式-BPDE的表遗传致癌机制。材料与方法： 采用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)法和RT-PCR法检测结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子甲基化状况及其mRNA表达,与非转化的16HBE细胞进行比较;并用去甲基化因子5-Azac(5-Aza-2′-deoxycytidine)处理有异常甲基化的细胞。 结果： 发现结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区存在CpG岛的高甲基化;与非转化16HBE细胞比较,转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因mRNA表达下降;有异常甲基化的细胞经去甲基化处理后甲基化消失。结论： 结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区CpG岛的高甲基化使其mRNA表达下降,并可能导致hMSH2基因表达抑制,这可能是结晶型NiS及反式-BPDE诱导16HBE细胞转化和成瘤的一种表遗传致癌机制。甲基化的可逆性对今后研究其表型逆转以及药物治疗提供了重要依据。     

硫化镍转化人支气管上皮细胞基因差异表达芯片的研究

背景与目的近年研究发现硫化镍(NiS)可引起人支气管上皮细胞(humanbronchialepithelialcell,16HBE)发生恶性转化及转化细胞致癌性,其机制可能与NiS引起基因突变、多种转录因子的异常表达有关。为此,本研究利用NiS恶性转化的体外培养细胞模型,用cDNA微阵列技术研究经NiS转化后的16HBE细胞基因的差异表达,从基因组水平探讨NiS所致细胞恶变的相关基因差异改变。方法分别提取16HBE和经NiS单独处理发生转化的NiS16HBE细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3dCTP和Cy5dCTP荧光素分别标记制作探针。探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交。以ScanArray4000扫描仪扫描芯片,以GenPixPro3.0软件分析荧光信号,然后对差异表达的基因进行生物学信息分析。结果NiS16HBE细胞样本与16HBE细胞样本比较,呈现差异表达的基因有151个(3.78%),其中81个(53.64%)上调,70个(46.36%)下调。结论NiS的转化作用与应激反应基因、免疫相关基因、DNA合成和修复基因、代谢相关基因、原癌基因和抑癌基因等多类基因的异常表达有关。     

镍化合物诱发恶性转化细胞的端粒酶活性表达

目的：探讨二种镍化合物诱发细胞恶变过程中端粒酶活性的变化。方法：二种镍化合物转化细胞接种BALB／c裸鼠，应用端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP)检测转化细胞和肿瘤细胞的端粒酶活性。结果：结晶型硫化镍和氯化镍诱发的BALB／c-313恶性转化细胞的端粒酶活性均表现为阳性。结论：镍化合物诱发的细胞恶性转化涉及了端粒酶活性改变，提示了端粒酶表达与镍转化作用有关。     

结晶型NiS诱发恶性转化细胞中的p16基因和FHIT基因的变化

目的 检测结晶型NiS诱发永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化过程中脆性组氨酸三联体基因(FHIT)和p16基因的变化,探讨镍化合物致癌的分子机制。方法 采用RT-PCR、DNA序列分析、银染PCR—SSCP方法检测恶性转化细胞、成瘤细胞中FHIT基因和p16基因的变化。结果 与对照组16HBE相比,转化细胞、成瘤细胞p16基因第2外显子、第2-3外显子末见突变,mRNA表达末见异常;FHIT基因第5,6,7,8外显子及第1-4外显子、第5-9外显子末见突变,但发现转化细胞、成瘤细胞FHIT基因的mRNA失表达或出现异常转录本;对其中FHIT基因第5-9外显子的一异常转录本测序分析显示,FHIT第6,7,8外显子缺失,第5,9外显子异常拼接,且中间插入一个36bp的小片段。结论 在结晶型NiS诱发16HBE恶性转化过程中,p16基因在DNA和mRNA水平末见异常改变,提示p16基因在镍致癌过程中可能不发挥作用;FHIT基因在mRNA水平出现缺失或异常转录本,表明FHIT基因在镍致癌过程中可能发挥一定作用;镍诱导的FHIT基因异常,可能是将外源致癌物、染色体脆性部位不稳定性和细胞恶变相联系起来的一个分子事件,FHIT基因可能是镍等外源致癌物作用的主要靶基因之一。     

α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因cDNA文库的构建

目的: 建立α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的文库.方法:抑制消减杂交法(SSH).结果:建立了3个人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库.其中,A差减文库(永生化人支气管上皮细胞BEP2D的cDNA为tester,α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆,B差减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester,BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver) 有301个克隆,C差减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester,BEP2D细胞的cDNA为driver)有586个克隆.,对文库中70个cDNA克隆单向测序后发现:61个cDNA为己知基因,9个cDNA在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因.结论:3个差减文库的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的基因,此为进一步研究α粒子诱导肺癌发生的分子机制奠定了基础.     

氯化镉诱发16HBE细胞恶变过程中TEF-1δ p31异常表达的研究

背景与目的:探讨氯化镉(CdCl2)诱发人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中不同阶段人翻译延伸因子TEF-1δ p31 mRNA表达的变化,以进一步阐明CdCl2致癌的分子机制.材料与方法:应用RT与PCR技术,以及Taqman荧光定量PCR方法,检测不同浓度CdCl2诱发16HBE恶性转化3个不同阶段细胞(转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞)的TEF-1δ p31 mRNA表达量的变化.结果:①相对于非转化16HBE对照细胞,CdCl2诱发恶性转化3个不同阶段细胞的TEF-1δ mRNA表达水平均显著升高(P＜0.01或P＜0.05),5 μmol/L CdCl2处理组各阶段细胞内的TEF-1δ平均表达量分别是对照细胞的3.4、5.2和6.9倍;10 μmol/L CdCl2处理组各阶段细胞内的TEF-1δ平均表达量分别是对照细胞的4.1、6.9和6.3倍;15 μmol/L CdCl2处理组各阶段转化细胞内的TEF-1δ 平均表达量分别是对照细胞的1.4、2.9和8.4倍.提示TEF-1δ的异常表达量与CdCl2诱发16HBE细胞恶变程度之间有正相关关系(r＞0.799.P＜0.01).②16HBE细胞恶变不同阶段TEF-1δ p31的异常表达水平与CdCl2的剂量相关(P=0.001).结论:氯化镉在诱发16HBE细胞恶变过程中,存在明显的人翻译延伸因子TEF-1δ p31异常表达的现象,其表达水平与细胞恶性转化程度和CdCl2的剂量密切相关,这可能是氯化镉诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机制之一.     

α粒子诱发人支气管上皮细胞癌变的DNA修复基因表达谱研究

背景与目的 :DNA修复系统在细胞基因组完整性维持中发挥重要作用 ,本研究探讨α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞癌变的DNA修复基因表达谱变化。 材料与方法 :采用Cy5和Cy3分别标记的癌变细胞BERP35T4和亲本细胞BEP2D的cDNA探针与DNA修复基因cDNA微矩阵杂交、ScanArray3000扫描仪扫描和ImaGene3.0软件分析比较基因表达差异。 结果 :分析比较了人支气管上皮细胞癌变前(BEP2D)和后(BERP35T4)126个DNA修复相关基因的表达谱 ,发现细胞癌变后有10个修复基因的表达降低 ,这些基因分别参与DNA链断裂修复、核苷酸切除修复和碱基切除修复反应 ,3个基因(DNA_PKcs、SMUG和RAD18)表达上调。结论 :细胞DNA修复表达改变是辐射诱发细胞恶性转化的机制之一。     

DNA依赖蛋白激酶在人支气管上皮细胞癌变株和肺癌组织中的异常表达

目的:探讨辐射诱发人支气管上皮细胞癌变株和肺癌组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA dependent protein kinase, DNA-PK)的激酶活性或表达变化。方法:用Western blot和p53蛋白为特异性底物的磷酸化反应分别检测癌变细胞中DNA-PKcs表达和激酶活性,用免疫组化结合病理图像定量分析技术检测肺癌组织和癌旁组织中DNA-PKcs蛋白的表达情况。结果:a粒子辐射诱发的人支气管上皮细胞癌变株BERP35T-1的DNA-PKcs表达水平比亲本细胞BEP2D提高30%,激酶活性显著提高。所检测的14例非小细胞肺癌组织中DNA-PKcs蛋白表达水平普遍高于相对应的癌旁组织,两组之间有显著性差异(P < 0.05)。结论:非小细胞肺癌组织中DNA-PKcs表达增加,可能成为肺癌的一个生物标记物。     

MALIGNANT TRANSFORMATION IN BALB/c-3T3 CELLS INDUCED BY CRYSTALLINE NICKEL SULFIDE

采用细胞灶法测定结晶型硫化镍对ＢＡＬＢ／ｃ－３Ｔ３诱发细胞转化的活性,结果表明当硫化镍浓度≥０．２５μｇ／ｃｍ２时转化率增高（Ｐ＞０．０５）,且有剂量反应关系。各剂量组转化灶细胞共６份经软琼脂培养试验均获阳性结果,而对照细胞则为阴性,提示硫化镍诱发的转化细胞具有锚着不依赖性,即恶性特征。     

黄曲霉毒素B1诱导的恶性转化肝细胞miRNA表达谱的变化

目的：检测黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）诱导的恶性转化肝L02细胞（L02T）的miRNA表达谱,寻找差异表达的miRNA。方法：以含有AFB1的培养液多次间歇性染毒L02细胞获得转化细胞L02T,通过miRNA芯片技术检测和分析对照L02和转化L02T细胞的miRNA表达谱;用实时荧光定量PCR方法对芯片结果加以验证;采用TargetScan软件预测miRNA可能调控的靶基因。结果：获得2组细胞856个miRNA的表达谱,在25个表达差异显著的miRNA中,15个表达上调,10个表达下调;用定量RT-PCR对芯片结果中表达差异的miR-320a、miR-638和miR-98进行验证,并对其中上调显著的miR-638进行生物信息学分析,预测到4个与肝癌相关的潜在靶基因。结论：在AFB1诱导的恶性转化肝L02细胞中筛查出25个表达差异显著的miRNA,差异表达的miRNA可能在细胞恶性转化过程中起重要作用。     

WFDC1基因在肝癌中的表达及其诊断和预后价值

目的：研究WFDC1基因在肝癌组织和细胞中的表达变化,探讨其与肝癌临床病理指标及生存预后之间的关系,为肝癌的诊断以及预后判断提供参考依据。方法：采用qPCR法分别检测肝癌患者的肿瘤组织和癌旁组织、MC-LR诱导的人肝细胞L02恶性转化细胞和肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7中WFDC1 mRNA的表达水平。基于TCGA数据库,分析WFDC1基因在肝癌患者肿瘤组织（331例）和癌旁组织（50例）中的表达及其与临床病理指标和生存预后的关系。结果：qPCR检测结果表明,与癌旁组织比较,WFDC1 mRNA在肝癌组织、MC-LR诱导的L02恶性转化细胞以及肝癌细胞中的表达均显著下调（P < 0.05）。TCGA数据库中WFDC1 mRNA表达分析也表明,肝癌组织的表达显著低于癌旁组织（P < 0.01）,且WFDC1 mRNA的表达下调与肿瘤分级和临床分期高度相关（P < 0.05）。Kaplan-Meier分析表明,WFDC1 mRNA高表达患者生存时间高于低表达患者（Log-rank=4.80,P < 0.05）。ROC曲线分析结果表明,WFDC1 mRNA是一个特异度和灵敏度较好的肝癌诊断指标（AUC=0.829）。结论：WFDC1基因可能是一个抑癌基因,检测该基因的表达水平对肝癌患者的诊断和预后判断具有参考价值。     

乙酸镍对人支气管上皮细胞系的恶性转化研究

目的：建立乙酸镍(niekel acetate)对永生化人支气管上皮细胞系(16BHE)的恶性转化模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法：通过克隆形成率实验确定乙酸镍对16HBEK细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒：每隔20d染毒1次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成试验和鼠体内致瘤试验鉴定细胞恶性转化程度。结果：经乙酸镍多次处理16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论：乙酸镍具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。     

Upregulation of plakophilin‐2 and its acquisition to adherens junctions identifies a novel molecular ensemble of cell–cell‐attachment characteristic for transformed mesenchymal cells

In contrast to the desmosome‐containing epithelial and carcinoma cells, normal and malignantly transformed cells derived from mesenchymal tissues and tumors are connected only by adherens junctions (AJs) containing N‐cadherins and/or cadherin‐11, anchored in a cytoplasmic plaque assembled by α‐ and β‐catenin, plakoglobin, proteins p120 and p0071. Here, we report that the AJs of many malignantly transformed cell lines are characterized by the additional presence of plakophilin‐2 (Pkp2), a protein hitherto known only as a major component of desmosomal plaques, i.e., AJs of epithelia and carcinomatous cells. This massive acquisition of Pkp2 and its integration into AJ plaques of a large number of transformed cell lines is demonstrated with biochemical and immunolocalization techniques. Upregulation of Pkp2 and its integration into AJs has also been noted in some soft tissue tumors insitu and some highly proliferative colonies of cultured mesenchymal stem cells. As Pkp2 has recently been identified as a functionally important major regulatory organizer in AJs and related junctions in epithelial cells and cardiomyocytes, we hypothesize that the integration of Pkp2 into AJs of “soft tissue tumor” cells also can serve functions in the upregulation of proliferation, the promotion of malignant growth in general as well as the close‐packing of diverse kinds of cells and the metastatic behavior of such tumors. We propose to examine its presence in transformed mesenchymal cells and related tumors and to use it as an additional diagnostic criterion. © 2009 UICC     

LncRNA PCA3在甲基丙烯酸环氧丙酯诱导16HBE恶性转化细胞中的表达及意义

目的:探讨长链非编码RNA PCA3(LncRNA PCA3)在甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱导的16HBE恶性转化细胞中的表达水平及意义。方法:收获经8 μg/mL GMA诱导的第30代16HBE恶性转化细胞及同代龄DMSO溶剂对照组细胞,应用高通量LncRNA芯片比较两组样本表达谱的差异,通过差异倍数、邻近编码基因信息分析等策略初步筛选出16HBE恶性转化细胞中LncRNA PCA3及其最可能的相关蛋白编码基因PRUNE2,采用实时荧光定量PCR(qPCR)和全基因组表达谱芯片分析LncRNA PCA3和PRUNE2的表达量,并与同代龄DMSO对照组细胞比较。结果:LncRNA芯片结果显示,与同代龄DMSO组相比,GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中LncRNA PCA3上调7.17倍,PRUNE2下调2.54倍;qPCR结果显示,与同代龄DMSO组[(1.36±0.44)×10^-5]相比,GMA诱导的恶性转化细胞[(2.67±0.63)×10^-5]中LncRNA PCA3表达上调(P<0.05);全基因组表达谱芯片显示,16HBE恶性转化细胞的PRUNE2表达量(10.95)较DMSO组(19.46)明显下调,与LncRNA芯片结果一致。结论:LncRNA PCA3可作为GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中相关特异分子标志之一。     

MMP-7和MMP-9对葡萄胎恶变的预测价值研究

背景与目的:探讨基质金属蛋白酶-7(MMP-7)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在预测葡萄胎恶变中的作用.材料与方法:采用免疫组织化学PV-6000法测定49例葡萄胎(其中8例恶变,列为葡萄胎恶变组)和18例正常绒毛组织中的MMP-7和MMP-9蛋白表达量.采用化学发光法测定了49例葡萄胎患者的308次血人绒毛膜促性腺激素(HCG).结果:MMP-7、MMP-9蛋白表达量在葡萄胎恶变组中的表达分别高于正常绒毛组和葡萄胎未恶变组(P＜0.05),在正常绒毛组和葡萄胎未恶变组的表达差异无统计学意义(P＞0.05).3例血HCG持续阳性和5例血HCG降而复升的患者恶变为侵蚀性葡萄胎.结论:MMP-7和MMP-9可能与滋养细胞的侵袭过程及程度有关,检测葡萄胎患者组织中MMP-7和MMP-9的蛋白表达,可以预测其恶变,并为临床预防性化疗提供依据.