N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍引起vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定

运用ｍＲＮＡ差异显示（ＤＤ－ＰＣＲ）技术，通过２６对锚定及任意引物组合显示基因的差异表达情况，分离了７个表达有差异的片段．其中３个片段的相关基因属于对Ｎ－甲基－Ｎ′－硝基－Ｎ－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）处理的初级反应基因，２个属于次级反应基因．另有２个片段的差异表达仅在蛋白合成抑制剂环己亚胺（ＣＨＭ）合并ＭＮＮＧ处理时才出现．反向缝隙印迹杂交分析印证了２个片段在ＤＤ－ＰＣＲ中发现的改变，同时分析的本实验室分离的２５个片段中，８个片段的变化被验证与ＤＤ－ＰＣＲ中的改变一致．序列分析结果显示这些片段与许多基因有高同源性，其中包括一些参与信息传导的基因．     

N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱发的vero细胞蛋白酪氨酸磷酸化改变

为了研究细胞信号转导通路在致突变物N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)致非定标性突变作用中的地位,猴肾vero细胞在MNNG处理后0,6,12 h制备全细胞抽提液,用Western印迹法观察细胞蛋白质酪氨酸磷酸化的变化.结果发现0.2 μmol·L^-1 MNNG处理2.5 h后再经0 h和12 h,45 ku蛋白质酪氨酸磷酸化程度增强,经6 h时还有62 ku蛋白质酪氨酸磷酸化程度增强,1 mg·L^-1蛋白合成抑制剂环己米特(CHM)处理vero细胞12 h也可引起45 ku蛋白质酪氨酸磷酸化程度增强.提示MNNG处理可能诱发应激相关信号转导通路的激活.     

N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍致大鼠气管上皮细胞体外转化及细胞遗传学改变

利用原代大鼠气管上皮(RTE)细胞研究N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)的致转化作用，并对转化细胞进行细胞遗传学研究. 结果表明：增殖旺盛细胞(EGV)集落是RTE细胞体外转化最早期的特征，EGV转化频率与MNNG剂量呈明显的剂量反应关系. 从0.3 mg·L^-1 MNNG剂量组分离到2个EGV集落，经消化，传代形成了永生化的细胞系(RTES1,RTES2)，RTES1为多倍体核型，2号和7号染色体数目增加至4个且呈高频发生(100%); RTES2呈二倍体核型. 电镜结果证实转化细胞来自大鼠气管上皮组织. 以上结果提示，原代RTE细胞体外培养模型是研究致癌物定量及致癌机理的理想模型系统.     

N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱发的vero细胞蛋白酪氨酸磷酸化改变

为了研究细胞信号转导通路在致突变物 N-甲基 - N′-硝基 - N-亚硝基胍 ( MNNG)致非定标性突变作用中的地位 ,猴肾 vero细胞在 MNNG处理后 0 ,6,1 2 h制备全细胞抽提液 ,用 Western印迹法观察细胞蛋白质酪氨酸磷酸化的变化 .结果发现 0 .2μmol· L-1MNNG处理 2 .5h后再经 0 h和 1 2 h,45ku蛋白质酪氨酸磷酸化程度增强 ,经 6h时还有62 ku蛋白质酪氨酸磷酸化程度增强 ,1 mg·L-1蛋白合成抑制剂环己米特 ( CHM)处理 vero细胞 1 2 h也可引起 45ku蛋白质酪氨酸磷酸化程度增强 .提示 MNNG处理可能诱发应激相关信号转导通路的激活 .     

低浓度N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍对HeLa细胞DNA聚合酶及拓扑异构酶Ⅱα mRNA表达水平的影响

利用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法， 研究了低浓度甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对HeLa细胞DNA聚合酶(Polα,β,δ,ε)及拓扑异构酶Ⅱα(TopⅡα) mRNA表达水平的影响. 发现经0.2 μmol·L^-1 MNNG 处理2.5 h后，HeLa细胞Polβ mRNA水平在6-24 h内升高约1倍，而Polα,δ,ε及TopIIα mRNA水平则无明显改变. 提示Polβ mRNA水平改变可能参与MNNG诱发细胞遗传不稳定的发生.     

N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍致大鼠气管上皮细胞体外转化及细胞遗传学改变

利用原代大鼠气管上皮（ＲＴＥ）细胞研究Ｎ－甲基－Ｎ′－硝基－Ｎ－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）的致转化作用，并对转化细胞进行细胞遗传学研究．结果表明：增殖旺盛细胞（ＥＧＶ）集落是ＲＴＥ细胞体外转化最早期的特征，ＥＧＶ转化频率与ＭＮＮＧ剂量呈明显的剂量反应关系．从０．３ｍｇＬ－１ＭＮＮＧ剂量组分离到２个ＥＧＶ集落，经消化，传代形成了永生化的细胞系（ＲＴＥＳ１，ＲＴＥＳ２），ＲＴＥＳ１为多倍体核型，２号和７号染色体数目增加至４个且呈高频发生（１００％）；ＲＴＥＳ２呈二倍体核型．电镜结果证实转化细胞来自大鼠气管上皮组织．以上结果提示，原代ＲＴＥ细胞体外培养模型是研究致癌物定量及致癌机理的理想模型系统．     

甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定vero细胞DNA体外复制的保真度

利用在猴肾vero细胞抽提物中建立的DNA体外复制系统，对穿梭质粒pZ189 DNA进行有效的复制后，将复制产物转化至E.coli MBM7070，观察pZ189质粒DNA中突变靶基因supF tRNA基因突变的情况．在烷化剂甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)诱发的遗传不稳定(genetic instability) vero细胞胞浆抽提物中进行pZ189质粒DNA复制, 发现经过体外复制的pZ189质粒中supF tRNA基因突变率高出对照组5-8倍(P<0.05)，证实该细胞DNA复制系统的复制保真度明显降低.     

喂饲酒精对大鼠肝抑制N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍致突变性的影响

本文比较了喂饲酒精4wk的Sprague-Dawley 大鼠肝匀浆上清液(S9)和对照组大鼠肝S9对直接致癌物N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)致突变性的抑制作用。Ames试验表明,喂饲酒精可增强大鼠肝S9抑制MNNG致突变性的能力(p<0.05),并伴有某些解毒酶活性增加。酒精组大鼠肝S9的谷胱甘肽S-转移酶、UDP葡萄糖醛酸基转移酶及氨基比林N-脱甲基酶活性分别为对照组的1.2,1.7和1.2倍。喂饲酒精可增加肝内谷胱甘肽的浓度,但对UDP葡萄糖醛酸的含量无显著影响。本文结果提示,喂饲酒精导致大鼠肝S9对MNNG致突变性的抑制能力增加是与上述解毒酶活性及某些辅因子浓度增高有关。     

甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定vero细胞DNA体外复制的保真度

利用在猴肾ｖｅｒｏ细胞抽提物中建立的ＤＮＡ体外复制系统，对穿梭质粒ｐＺ１８９ＤＮＡ进行有效的复制后，将复制产物转化至Ｅ．ｃｏｌｉＭＢＭ７０７０，观察ｐＺ１８９质粒ＤＮＡ中突变靶基因ｓｕｐＦｔＲＮＡ基因突变的情况．在烷化剂甲基硝基亚硝基胍（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ′－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）诱发的遗传不稳定（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）ｖｅｒｏ细胞胞浆抽提物中进行ｐＺ１８９质粒ＤＮＡ复制，发现经过体外复制的ｐＺ１８９质粒中ｓｕｐＦｔＲＮＡ基因突变率高出对照组５－８倍（Ｐ＜０．０５），证实该细胞ＤＮＡ复制系统的复制保真度明显降低     

一个参与N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱发的遗传不稳定的cDNA片段的分离筛选

为研究甲基硝基亚硝基胍（MNNG）诱发猴肾vero细胞遗传不稳定的机理，采用mRNA差异显示分离到的MNNG处理后表达发生改变的表达序列标识（EST）相关基因进行功能筛选. 利用反义核酸阻断技术阻断其相应基因的表达，以筛选分离参与非定标性突变形成的cDNA片段. 现筛选到10号片段，其相关基因的表达被阻断后，MNNG诱发的vero细胞非定标突变率下降至自发突变水平，提示10号片段相关的基因是非定标突变发生的正相关基因.     

一个参与N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱发的遗传不稳定的cDNA片段的分离筛选

为研究甲基硝基亚硝基胍 ( MNNG)诱发猴肾vero细胞遗传不稳定的机理 ,采用 m RNA差异显示分离到的 MNNG处理后表达发生改变的表达序列标识 ( EST)相关基因进行功能筛选 .利用反义核酸阻断技术阻断其相应基因的表达 ,以筛选分离参与非定标性突变形成的 c DNA片段 .现筛选到 1 0号片段 ,其相关基因的表达被阻断后 ,MNNG诱发的 vero细胞非定标突变率下降至自发突变水平 ,提示 1 0号片段相关的基因是非定标突变发生的正相关基因 .     

POLK和POLH在N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍引起的非定标突变中的作用

目的　研究DNA聚合酶kappa(POLK)和DNA聚合酶eta(POLH)的功能。方法　采用穿梭质粒pZ189介导的突变试验,对建立的阻断细胞系FL POLK- 和FL POLH- 进行非定标突变研究。结果穿梭质粒pZ189在FL POLK- 和FL POLH- 细胞中复制后,其supFtRNA基因的自发突变频率分别为11.2×10 - 4和13 .5×10 - 4,而对照细胞FL和FL M分别为4 .9×10 - 4和3 .7×10 - 4。质粒在接触过N 甲基 N′硝基 N 亚硝基胍的FL POLK- 和FL POLH- 细胞中复制,其supFtRNA基因的非定标突变频率下降。结论　POLK和POLH在维持哺乳类细胞的基因组稳定性中起重要作用,同时它们还参与了哺乳动物细胞非定标突变的形成,如同其同源基因编码的PolⅣ和PolⅤ在E .coli的非定标突变形成中的作用     

低浓度N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍对HeLa细胞DNA聚合酶及拓扑异构酶Ⅱα mRNA表达水平的影响

利用定量逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，研究了低浓度甲基硝基亚硝基胍（ＭＮＮＧ）对ＨｅＬａ细胞ＤＮＡ聚合酶（Ｐｏｌα，β，δ，ε）及拓扑异构酶Ⅱα（ＴｏｐⅡα）ｍＲＮＡ表达水平的影响．发现经０．２μｍｏｌ·Ｌ－１ＭＮＮＧ处理２．５ｈ后，ＨｅＬａ细胞ＰｏｌβｍＲＮＡ水平在６－２４ｈ内升高约１倍，而Ｐｏｌα，δ，ε及ＴｏｐＩαｍＲＮＡ水平则无明显改变．提示ＰｏｌβｍＲＮＡ水平改变可能参与ＭＮＮＧ诱发细胞遗传不稳定的发生．     

用双向凝胶电泳分析低浓度烷化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝胍引起的人羊膜FL细胞蛋白质的表达差异

目的 为了研究哺乳类细胞受到低浓度烷化剂攻击后蛋白表达谱的变化。方法 用双向凝胶电泳结合相应的2-DE分析软件比较烷化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）处理组和二甲基亚砜对照组的FL细胞的蛋白质组的表达差异。结果 MNNG处理后的FL细胞中检测到10个新出现的蛋白点，同时有5个蛋白点在MNNG处理后消失；有30个点在表达量上有显著变化，其中16个点在MNNG处理后表达升高，另14个点则表达量降低。结论 在低浓度烷化剂攻击的FL细胞中有一系列蛋白质表达水平的改变，提示这些发生改变的蛋白质可能参与了哺乳类细胞非定标性突变的发生。     

猪苓多糖通过JAK2-STAT3通路抑制N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基诱导的GES-1细胞上皮间充质转化

目的 研究猪苓多糖抑制胃黏膜上皮细胞(GES-1)间充质转化的作用和机制。方法 应用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基(MNNG,40μmol·L-1)诱导GES-1细胞间充质转化模型,造模同时给予猪苓多糖(1.25、2.50、5.00、10.00 mg·mL^-1)处理24、48h后,CCK-8法检测细胞增殖能力;造模同时给予猪苓多糖(5.00mg·mL^-1)处理48h后,实时定量PCR(qRT-PCR)法检测猪苓多糖对N-cadherin、Snail、Twist、Fibronection及VmentionmRNA表达的影响;Westernblotting法检测E-cadherin、N-cadherin、Snail、Twist、Fibronetin、Vimentin、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2蛋白表达。裸鼠分别sc经MNNG40μmol·L-1处理48 h后的GES-1细胞(5×107·mL^-1,0.2mL)、胃癌细胞SGC7901(5×10⁷·mL^-1,...