血管内皮细胞对平滑肌细胞表型转化的影响

目的分析共培养时大鼠血管内皮细胞(VECs)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化的影响。方法 VSMCs直接种植于培养板表面,VECs则种植于与VSMCs相对的浮胶底面。免疫荧光方法观察和鉴定VECs和VSMCs,RT-PCR和共聚焦显微镜分析表型相关基因的表达。结果原代培养的大鼠VECs呈铺路石样形态,vWF染色阳性。原代培养的大鼠VSMCs免疫荧光染色α-SMA呈阳性。RT-PCR检测结果表明,48h共培养组VSMCs的合成表型相关基因CRBP-1、Smemb的表达水平显著高于单独培养组,分别为1.4倍、1.5倍;72h达到峰值,分别为1.7倍、2.1倍,96h开始下降;共培养组中收缩表型标记物Smoothelin-B和SM-MHC的基因表达水平在48h、72h显著低于单独培养组,96hSmoothelin-B却高于单独培养组。单独培养组上述各基因的变化趋势不变或保持稳定。免疫荧光结果显示SM-MHC蛋白表达在共培养组中96h后从下降转为升高(P<0.05)。结论在共培养体系中,血管内皮细胞对血管平滑肌细胞表型转化的作用表现为先促进向合成型转化,96h后促进向收缩型转化。     

血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖和细胞外基质降解作用的研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管平滑肌细胞(VSMCs)基质金属蛋白酶2(MMP2)活性的影响及其与细胞增殖的关系。方法体外培养大鼠主动脉VSMCs,用AngⅡ进行刺激,采用明胶酶图法检测MMP2的活性。结果经AngⅡ处理12、24、48h后,VSMCs的MMP2活性分别为未处理组的237、196、158倍(P<005)。但AngⅡ对VSMCs增殖的促进作用在刺激3h时较明显(P<005)。结论AngⅡ提高VSMCs的MMP2活性晚于促进VSMCs增殖作用,显示AngⅡ这两种作用具有时相差异。     

环丙沙星对血管平滑肌细胞表型转换的调控作用

目的 研究环丙沙星(ciprofloxacin,CPFX)是否调控血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转换.方法 组织贴壁法分离,培养和鉴定来源于人体的主动脉VSMCs.通过CCK-8检测CPFX干预最佳浓度和时间.随后将VSMCs分为4组:对照组、CPFX组、血管...     

VEGF对人血管平滑肌细胞株功能的影响及相关机制

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)对人血管平滑肌细胞(VSMCs)株增殖及凋亡的影响。方法体外培养的VSMCs细胞株采用0、0.1、0.2和0.4μg/ml的VEGF及0.4μg/ml的VEGF处理体外培养的VSMCs细胞株0、24、48、72 h,采用Western印迹方法检测VSMCs细胞株中磷脂酶C(PLC)-γ1信号通路的磷酸化活化情况,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)和流式细胞仪(FCM)方法检测VSMCs细胞株增殖和凋亡能力的变化情况。采用PLC-γ1信号通路抑制剂U71322阻断VSMCs细胞株中PLC-γ1信号通路后,再以VEGF处理VSMCs细胞株,MTT和FCM方法检测VSMCs细胞株增殖和凋亡能力的变化情况。结果同0μg/ml的VEGF处理组相比,0.1、0.2、0.4μg/ml的VEGF可显著加强VSMCs细胞株的增殖能力(P0.01),并抑制VSMCs细胞株的凋亡水平(P0.01),且这种作用具有计量依赖性。Western印迹结果显示,0.1μg/ml的VEGF处理即可显著活化VSMCs细胞株中的PLC-γ1信号通路,且随着VEGF处理浓度的升高,PLC-γ1信号通路活化水平逐渐升高。当采用U71322阻断VSMCs细胞株中的PLC-γ1信号通路后,VEGF促VSMCs细胞株增殖的能力,以及抑制VSMCs细胞株的凋亡能力均显著降低(P0.01)。结论 VEGF可通过活化PLC-γ1信号通路,进而促进VSMCs细胞株的增殖能力,并抑制VSMCs细胞株的凋亡水平。     

高糖诱导大鼠血管平滑肌细胞转分化的作用

目的:观察高糖对体外培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)功能以及与成骨细胞转分化相关蛋白表达的变化,探讨糖尿病血管病变的可能细胞/分子发病机制. 方法:用组织贴块法建立SD大鼠胸主动脉VSMCs的体外培养技术;高糖(葡萄糖浓度:50 mmol/L)作用该细胞,设相同浓度甘露醇为对照组,观察在不同的培养时间下(3、12h和第3、6、9、12d),采用免疫蛋白印迹法和间接免疫荧光法分别检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和成骨细胞特异性核转录因子(core-binging factor α-1,Cbfα-1/RUNX2)的表达.细胞钙沉积含量测定观察培养细胞钙盐的沉积. 结果:组织贴块法培养的大鼠原代胸主动脉VSMCs呈梭型,α-SMA表达强阳性;高糖作用12h,VSMCs的Cbfα-1表达明显上升;高糖作用9d后,VSMCs的α-SMA表达量较高糖作用前降低近90%;免疫荧光染色显示VSMC细胞呈低强度的α-SMA染色阳性;同时,高糖作用下的VSMCs能够检测到OPN蛋白的表达,与对照组相比差异显著;高糖作用下细胞钙沉积含量明显增加. 结论:持续的高糖作用能够使动脉VSMCs发生向类似成骨样细胞的转分化,提示高糖诱导的VSMCs转分化可能参与糖尿病血管病变的发生发展.     

血管紧张素Ⅰ抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖

目的探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响。方法采用组织贴块法培养VSMCs,取生长良好的第3～5代细胞用于实验。随机分为对照组、AngⅡ组、Ang-(1-7)组、AngⅡ Ang-(1-7)组、AngⅡ Ang-(1-7) (A-779)组,通过3H胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入法测定VSMCs的DNA合成,用结晶染色的方法检测细胞数目,观察VSMCs的增殖情况。结果①与对照组比,AngⅡ(100nmol/L)孵育细胞24h后可明显诱导VSMCs3H-TdR掺入量增加;Ang-(1-7)(1000nmol/L)可减少3H-TdR掺入量。②与AngⅡ组比较,Ang-(1-7)(10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L)呈浓度依赖性的抑制AngⅡ诱导的VSMCs3H-TdR掺入量。加入Ang-(1-7)特异性受体阻断剂A-779后,Ang-(1-7)此作用消失。③结晶染色结果显示,AngⅡ可诱导VSMCs数目明显增加(P<0.05)。Ang-(1-7)可抑制AngⅡ诱导的VSMCs增加,亦呈浓度依赖性(P<0.05)。结论Ang-(1-7)能抑制基础和AngⅡ诱导的VSMCs增殖,通过其特异性受体发挥作用。     

白细胞介素-6对兔血管平滑肌细胞产生C反应蛋白的影响

目的:探讨白细胞介素-6(IL-6)能否诱导体外原代培养的兔血管平滑肌细胞(VSMCs)产生C反应蛋白(CRP)。方法:体外原代培养新西兰兔腹主动脉VSMCs。分别用白细胞介素(IL)-6(10 ng/ml)、IL-1β25 ng/ml或IL-6(10 ng/ml)+IL-1β(25 ng/ml)刺激VSMCs 48 h。对照组用等体积的IL-6的溶剂孵育48 h。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)分别检测培养细胞CRP mRNA和蛋白的表达情况。结果:对照组的原代VSMCs未见CRP的产生。VSMCs与IL-6单独孵育48 h后,CRP mRNA的表达量是对照组的(3.50±1.17)倍,能产生少量CRP,与对照组相比有差异。单独应用IL-1β不能诱导VSMCs产生CRP,但是在IL-1β和IL-6的联合刺激下,CRP mRNA表达量是对照组的(5.92±1.30)倍,CRP的合成亦达最大值。结论:IL-6能诱导原代培养的兔VSMCs产生CRP。尽管单独应用IL-1β不能刺激VSMCs产生CRP,但是它却能显著增强IL-6诱导CRP的表达。     

凝血酶诱导CBP高表达刺激大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究

目的:探讨凝血酶诱导大鼠CBP高表达影响大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用机制.方法:采用10-3、10-2、0.1、1、10 U/ml的凝血酶干预体外培养的VSMCs 30min.RT-PCR法、蛋白印记法分别检测rCBPmRNA和蛋白质的表达变化.流式细胞技术检测细胞周期,评价细胞增殖能力.结果:凝血酶可在...     

外加电场对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

目的探讨电场作用下血管平滑肌细胞(VSMCs)膜表面细胞生长因子受体表达的变化及其对细胞增殖迁移的影响。方法通过外加电场干预装置,对体外培养的大鼠主动脉VSMC直流电场干预,间断显微细胞图像记录和分析,研究不同强度电场(EFs)、不同作用时间下VSMCs迁移和细胞形态的变化;采用免疫细胞化学或免疫荧光染色方法检测EFs干预后,与VSMCs迁移密切相关的血小板衍化生长因子受体(PDGFR)、血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)和2型受体(AT2R)等的表达,研究EFs影响VSMCs增殖及迁移的机制。结果(1)改进的EFs干预装置作用下,VSMCs膜PDGFR表达增加,部分细胞内PDGFR表达上调,呈不对称分布,在EFs阴极面较集中;细胞中AT1R表达亦增加,但无明显不对称分布现象;AT2R表达未见明显改变。(2)150mV/mmEFs长时间作用下,培养的VSMCs有明显的电场趋化性,细胞向阴极迁移的距离明显高于无EFs作用对照组;细胞PCNA表达与对照培养细胞未见明显差异。结论外加直流EFs干预下,大鼠VSMCs发生形状改变和定向迁移。细胞膜向阴极方向伸展,定向迁移依赖于EFs强度,生理强度的直流EFs对VSMCs增殖没有明显影响。EFs作用下,部分细胞生长因子的表达上调和重分布,可能与细胞定向迁移的启动和维持有关。     

骨桥蛋白参与血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移

目的检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对骨桥蛋白(OPN)表达的影响及其涉及的信号传导途径,并探讨OPN在AngⅡ诱导中膜平滑肌细胞(VSMCs)迁移中的作用。方法采用贴壁法培养SD大鼠胸主动脉的VSMCs。以免疫印迹(Western blot)法检测OPN表达。运用Transwell观察反义OPN在AngⅡ诱导的VSMCs迁移中的作用。结果(1)体外培养的大鼠VSMCs在基础状态下表达一定水平的OPN蛋白,经10-7mol/L AngⅡ诱导24 h后,OPN蛋白水平与对照组相比增加1.3倍(P<0.05);(2)预先给予AngⅡ1型(AT1)受体拮抗剂氯沙坦(losartan)、胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190后,AngⅡ诱导的OPN的表达分别下降44.2%、23.6%及72.5%(P<0.05),而其2型(AT2)受体拮抗剂PD123319对OPN的表达没有影响。(3)反义OPN可以明显抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移(每个视野平均迁移细胞数目26.34±5.47 vs 50.23±6.12,P<0.05),而OPN正义、错配义组无此变化。结论(1)AngⅡ上调VSMCs中OPN的表达;(2)AT1受体、ERK和P38MAPK信号系统参与AngⅡ诱导的OPN表达。(3)OPN参与AngⅡ诱导的VSMCs迁移。     

血小板衍生生长因子−C对体外培养血管内皮细胞及间充质干细胞的影响

目的 观察血小板衍生生长因子?C（PDGF-C）对体外培养的血管内皮细胞（VECs）及间充质干细胞（MSCs）的影响。方法　采用培养的大鼠主动脉内皮细胞和MSCs,应用细胞直接计数法、噻唑蓝比色法（MTT法）评价细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞周期,利用Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验测定细胞迁移能力。结果　PDGF-C能明显刺激VECs和MSCs的增殖,增加两种细胞S期细胞的比例,对VECs增殖呈剂量依赖关系,对MSCs的促增殖作用在20μg/L达高峰。同时,PDGF-C促进VECs和MSCs的迁移能力,对MSCs迁移作用强于VECs。结论　PDGF-C可促进培养的VECs、MSCs的增殖与迁移能力。     

小鼠主动脉平滑肌细胞培养及钙化模型的优化

目的 通过改良后的酶消化法进行小鼠主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）原代培养，提高VSMCs原代培养效率及质量，进而建立更快速有效的体外钙化模型。方法 剥离小鼠主动脉中膜并将其剪碎，分别采用改良组织贴块法及改良酶消化法进行小鼠VSMCs原代培养，免疫荧光染色鉴定细胞纯度后，分组（经典钙化组、改良钙化组）进行体外钙化诱导，采用vonKossa染色法评估各组钙化差异。结果 与改良组织贴块法相比，改良后的酶消化法培养原代VSMCs可在短时间内获得大量细胞，鉴定VSMCs纯度>98%，且细胞不易老化，传代存活率高。与传统体外钙化方法比，改良组的钙化更容易且稳定。结论 本研究通过改良的酶消化法提高了原代平滑肌细胞的存活率及培养效率，同时通过改良体外钙化诱导液配方，建立了良好的体外钙化模型。     

骨桥蛋白参与血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移

目的检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对骨桥蛋白(OPN)表达的影响及其涉及的信号传导途径,并探讨OPN在AngⅡ诱导中膜平滑肌细胞(VSMCs)迁移中的作用.方法采用贴壁法培养SD大鼠胸主动脉的VSMCs.以免疫印迹(Western blot)法检测OPN表达.运用Transwell观察反义OPN在AngⅡ诱导的VSMCs迁移中的作用.结果 (1)体外培养的大鼠VSMCs在基础状态下表达一定水平的OPN蛋白,经10-7mol/L AngⅡ诱导24 h后,OPN蛋白水平与对照组相比增加1.3倍(P＜0.05);(2)预先给予AngⅡ1型(AT1)受体拮抗剂氯沙坦(losartan)、胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190后,AngⅡ诱导的OPN的表达分别下降44.2%、23.6%及72.5%(P＜0.05),而其2型(AT2)受体拮抗剂PD123319对OPN的表达没有影响.(3)反义OPN可以明显抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移(每个视野平均迁移细胞数目26.34±5.47 vs 50.23±6.12,P＜0.05),而OPN正义、错配义组无此变化.结论 (1)AngⅡ上调VSMCs中OPN的表达;(2)AT1受体、ERK和P38MAPK信号系统参与AngⅡ诱导的OPN表达.(3)OPN参与AngⅡ诱导的VSMCs迁移.     

血管紧张素Ⅱ对大鼠血管平滑肌细胞弗林蛋白酶表达的影响

目的研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)弗林蛋白酶表达的影响,初步探讨在高血压中,AngⅡ导致纤维化病变形成的作用机制。方法选择体外培养大鼠VSMCs,按实验方案给予不同浓度AngⅡ作用24 h后,采用实时定量PCR和Western blot法,检测各组细胞弗林蛋白酶mRNA及蛋白的表达量;用荧光分析法检测各组弗林蛋白酶的活性。本实验共分为5组;对照组、AngⅡ10~(-7)mol/L组、AngⅡ10~(-6)mol/L组、AngⅡ10~(-5)mol/L组、AngⅡ10~(-4)mol/L组。结果与对照组比较,不同浓度AngⅡ组弗林蛋白酶mRNA表达量及活性均明显升高,AngⅡ10~(-5)mol/L组和AngⅡ10~(-4)mol/L组升高更明显,AngⅡ10~(-4)mol/L组达到最大值(P<0.05,P<0.01)。结论 AngⅡ能够促进大鼠VSMCs中弗林蛋白酶的表达,AngⅡ可能通过促进弗林蛋白酶的表达,使活性转化生长因子β产生增加从而促进纤维化病变的形成。     

脐动脉平滑肌细胞体外培养方法的改进

目的:建立并优化的人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)的体外培养方法。方法:人脐动脉VSMCs的体外原代培养应用优化的组织块贴壁法进行。在分别应用传统细胞培养法和优化后细胞培养法贴壁培养提取的原代细胞10 d后,计数6孔板每孔细胞数目,并做统计比较分析相同时间内原代细胞的数量。以抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体和抗CD31抗体进行免疫荧光染色和倒置相差显微镜观察鉴定培养的细胞。结果:与传统细胞培养法相比,在相同的时间周期内优化实验方法后培养的原代细胞数量较传统多,我们可以在较短时间内得到实验所需的细胞量,因此优化后可缩短细胞的培养周期。原代和传代培养的脐动脉VSMCs生长良好,细胞经冻存、复苏后状态依然良好。光镜下细胞呈典型的"峰-谷"样生长,细胞多为长梭形,具有VSMCs的特征,且传代培养至第7代,细胞生长特性不变。经抗α-SMA、CD31抗体进行免疫荧光染色鉴定证实为VSMCs。结论:优化的组织块贴壁法可缩短原代人脐动脉VSMCs的培养周期,且细胞的生物学特性较稳定,为与平滑肌相关的疾病进展及心血管生长发育的研究奠定了实验基础。     

血管平滑肌细胞在血管钙化中的调控机制研究进展

血管钙化普遍存在于衰老、动脉粥样硬化、慢性肾脏病、糖尿病等病理过程中,是全因死亡和心血管事件的危险因素。近期研究表明,血管钙化是一个主动的高度调控的过程。血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨细胞表型分化和分泌细胞外囊泡作为磷酸钙沉积位点在血管钙化中起着至关重要的作用。表观遗传、氧化应激和内质网应激、炎症、细胞衰老、自噬、钙化抑制剂、钙磷代谢等一系列因素调控VSMCs的钙化。本文主要综述了VSMCs在血管钙化中的调控机制。     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-1的影响

目的　观察同型半胱氨酸 (Hcy)对血管平滑肌细胞 (VSMCs)胶原代谢的影响 ,并探讨其作用机制。方法　采用体外培养大鼠 VSMCs,加入不同浓度 Hcy,测定细胞培养液中羟脯氨酸含量 ,观察 Hcy对 VSMCs培养液中胶原含量的影响 ,并通过酶谱分析、Western blot技术和半定量 RT- PCR方法观察 Hcy对 VSMCs基质金属蛋白酶 - 1(MMP- 1)的活性、分泌量及其 m RNA表达的影响。结果　 Hcy使 VSMCs培养液中胶原含量增加 ,下调 MMP- 1m RNA表达 ,减少其分泌 ,降低其酶活性 ,并呈剂量依赖效应。结论　 Hcy通过抑制 MMP- 1的分泌 ,减少胶原降解而使胶原蓄积。提示 Hcy减少胶原降解可能是动脉粥样硬化的发病机制之一。     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶抑制物-1表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞(VSMCs)基质金属蛋白酶(MMP)-9和基质金属蛋白酶抑制物(TIMP)-1表达的影响。方法体外培养人VSMCs,分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Westernblot蛋白印迹法检测MMP-9mRNA、TIMP-1mRNA和蛋白表达。结果人VSMCs在不同浓度Hcy(100、200、500、1000μmol/L)孵育24h后MMP-9mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组,并提示Hcy呈剂量依赖性诱导人VSMCsMMP-9的表达;但对TIMP-1mRNA和蛋白的表达无影响。结论Hcy可呈剂量依赖性诱导人VSMCsMMP-9的mRNA表达,而对TIMP-1mRNA的表达无明显影响,表明Hcy是在转录水平调控MMP-9的基因表达,这一效应可能是Hcy导致动脉粥样硬化的分子机制之一。     

腺病毒介导反义AT1R转染对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的　观察腺病毒介导反义AT1基因转染对培养的大鼠动脉平滑肌细胞 (VSMCs)增殖的影响。方法　用定向克隆和同源重组方法构建携带人反义AT1基因的复制 -缺陷型重组腺病毒 (Ad/CMV·ahAT1) ,转染体外培养的VSMCs,用RT PCR半定量法和免疫组化法检测AT1R的表达 ,用3 H TdR掺入实验和流式细胞仪检测VSMCs的DNA合成和增殖指数。结果　与对照组相比 ,转染Ad/CMV·ahAT1后 4 8h的VSMCs,AT1R的mRNA表达低 5 0 % ,蛋白表达也显著低于对照组 (P <0 0 1)。给予AngⅡ刺激的VSMCs的3 H TdR掺入量和增殖指数明显高于空白对照组 (分别为P <0 0 5和P <0 0 1) ;转染Ad/CMV·ahAT1组3 H TdR掺入量和增殖指数则显著降低 (与DMEM组比P <0 0 5 ,与AngⅡ对照组比P <0 0 1)。 结论　腺病毒介导的反义AT1R转染 ,通过抑制AT1R的表达 ,明显抑制VSMCs的增殖和AngⅡ刺激的VSMCs增殖     

重组腺病毒载体敲减ApoE-/-小鼠血管平滑肌细胞Orai1基因模型的构建

目的:为探讨Orai1基因在动脉粥样硬化进展中的作用,通过重组腺病毒载体建立ApoE-/-小鼠血管平滑肌细胞(VSMCs) Orai1基因的敲低模型,为深入相关研究奠定基础.方法:构建针对小鼠Orai1基因的重组腺病毒载体.高脂饲养ApoE-/-小鼠至16周龄后处死.取胸主动脉原代VSMCs改为体外培养,细胞分为三组,...