慢病毒介导大鼠卵巢基因转染的实验研究 *

目的 研究活体大鼠卵巢中慢病毒载体介导的基因转染及表达情况。方法 慢病毒载体(携带GFP的Bcl-2-HIV-I)注射大鼠卵巢实质,分别于注射后1、3、7、14、28天处死大鼠（每个时间点实验组n=2,对照组n=2,空白对照组n=2）,通过 Western-blot 电泳检测报告基因的表达。结果 实验组大鼠可见Bcl-2基因的表达,明显高于对照组和空白对照组Bcl-2基因的表达。 结论 慢病毒能有效的将外源基因导入活体大鼠卵巢而无明显毒副作用。     

慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的 以慢病毒作为载体,制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台.方法 慢病毒包装采用三质粒系统.3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G.病毒包装时,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞,培养48 h后,收取含病毒的上清,并通过高速离心浓缩病毒.将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞,通过流式细胞计数仪测定病毒滴度.用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下.在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达.将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠.通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平.结果 病毒液浓缩前的滴度≥106 TU/ml(transducing unit,TU),经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109 TU/ml以上.将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下,注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1 189/1 453),利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132 h观察胚胎,均发现有较强荧光.在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率＞90%,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎.胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28),首建鼠阳性率为60.8%(73/120),转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0%(73/1 453).将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠,阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29).结论 通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠.我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系.     

抑制绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体的构建

目的:构建抑制增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的慢病毒表达载体。方法:选取EGFP的19nt特异性序列,构建针对EGFP的shRNA,用XbaⅠ、XhoⅠ双酶切后定向克隆到慢病毒表达载体pLL3.7中,用包装的慢病毒液感染细胞,用荧光显微镜观察EGFP基因在不同细胞的表达情况。结果:干扰序列正确克隆至含U6启动子的慢病毒载体中,慢病毒感染Hela及J558L细胞后,可有效抑制细胞中EGFP的表达。结论:构建的慢病毒系统有效抑制了EGFP的表达,为后续的基因功能研究提供了有利工具。     

慢病毒-绿色荧光蛋白载体转染人眼睑成纤维细胞的研究

目的 将慢病毒-绿色荧光蛋白载体感染人眼睑成纤维细胞,为诱导性多潜能干细胞研究奠定基础.方法 采用0.25% dispeasⅡ酶冷消化联合组织块贴壁法培养人眼睑成纤维细胞,免疫组化SP法鉴定细胞种类,将慢病毒-绿色荧光蛋白载体以不同的感染复数(MOI值)感染细胞,并于感染48 h后流式细胞仪检测感染效率.结果 该实验方法 能获得大量的成纤维细胞,并且纯度高,当MOI值为40时,其感染效率为95.37%.结论 慢病毒-绿色荧光蛋白载体能够高效稳定感染人眼睑成纤维细胞表达绿色荧光蛋白,是诱导性多潜能干细胞技术研究的理想种子细胞.     

携载增强型绿色荧光蛋白基因慢病毒标记小鼠脐带间充质干细胞示踪方法

目的 探讨慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecent protein,eGFP)转染小鼠脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)。方法 通过组织贴壁法得到mUCMSCs;用生长增殖曲线、成骨、成软骨及成脂分化进行鉴定;以MOI为50、100、150、200携载eGFP的慢病毒载体介导转染mUCMSC,倒置显微镜下观察荧光表达,确定荧光表达率最高的MOI组。结果 eGFP慢病毒以MOI=150转染mUCMSC,效率较高,可直接用于体内示踪。结论 用小鼠脐带可以分离出mUCMSCs,MOI=150时携载eGFP的慢病毒传染mUCMSCs效果最好。     

含绿色荧光蛋白的慢病毒载体的构建及表达

目的　构建以泛醌启动子 (PUB)驱动绿色荧光蛋白 (GFP)表达的慢病毒载体三质粒表达系统 ,并建立其包装细胞系获得GFP的表达。方法　载体的构建采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法。三质粒系统中 ,转移质粒含PUB启动子及标志基因GFP ,包装质粒为ΔNRF ,内含CMV启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点 ,包膜蛋白质粒编码水疱性口炎病毒G糖蛋白 (VSV -G)。载体构建成功后 ,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞——— 2 93T ,12h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况。转染后 72h收集病毒上清 ,采用 6孔板培养感染细胞 ,荧光显微镜计数GFP阳性细胞法测定病毒滴度。结果　成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的质粒pXZ5。转染 2 93T细胞后 12h在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光 ,证实了GFP的表达 ,成功构建了慢病毒载体的三质粒系统 ,建立了慢病毒载体的包装细胞系。 72h后 ,GFP的荧光强度较 12h增强 ,每一视野下 ,GFP表达阳性的细胞比例达 5 0 %左右。病毒浓度的测定在未进行超速离心浓缩的情况下达 2× 10 8U L。结论　成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的的慢病毒载体三质粒表达系统 ,转染2 93T细胞后获得了GFP的表达 ,完成了慢病毒载体包装细胞系的建立     

携带人bcl-2基因的慢病毒表达载体的构建及其在人原代卵巢颗粒细胞中的表达

目的 构建及鉴定bcl-2基因慢病毒表达载体,并观察在体外人卵巢原代颗粒细胞中的表达.方法 采用PCR技术从含有人bcl-2基因的质粒克隆模板pCMV-SPORT6钓取bcl-2基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,通过酶切、测序验证bcl-2基因后,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞.获得携带bcl-2基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-bcl-2,并转染靶细胞人卵巢原代颗粒细胞.通过检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的 蛋白bcl-2进一步验证pGC-FU-bcl-2在靶细胞中的表达.结果 (1)pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-bcl-2共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-bcl-2;(2)目的 基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人卵巢原代颗粒细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功构建了携带bcl-2基因的重组慢病毒载体,转染人卵巢原代颗粒细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究bcl-2的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定基础.     

携载增强型绿色荧光蛋白基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞示踪方法

目的本实验研究旨在研究使用携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP的慢病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cell,BMSCs)的方法,用于解决组织工程骨研究中种子细胞分化、增殖过程中的示踪问题。方法用携带eGFP的慢病毒转染第3代BMSCs,用流式细胞仪检测转染率,获得稳定表达eGFP的BMSCs,并通过描绘生长曲线来判定对BMSCs增殖性能的影响。结果当MOI值为70时,经eGFP慢病毒转染后的BMSCs能够得到活性较好、转染率高的eGFP-BMSCs;转染后各细胞生长曲线呈"S"形,MOI=70与MOI=0时细胞增殖最好,MOI=100会对BMSCs增殖造成影响。结论 MOI=70时携载eGFP基因慢病毒转染BMSC效果最好。     

慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白转导兔角膜上皮细胞的体外实验研究

目的 观察慢病毒载体(lentiviral vectors, LVs)用于兔角膜上皮细胞基因转染的有效性.方法 兔角膜上皮细胞的原代及传代培养并做细胞鉴定;慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(lenti-EGFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection, MOI=0、1、10、50、100、500)转染实验细胞,寻找最佳转染剂量;于转染后24、48、72、96 h运用倒置荧光显微镜观察不同MOI下增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)的表达并计算细胞转染率;RT-PCR 方法检测EGFP基因的表达情况.结果 EGFP于转染48 h即开始有表达,随着转染时间的延长其表达增强.MOI=1、10、50、100时,角膜上皮细胞转染率随着感染复数的增加而增加,分别为(4.5±0.6)%、(30.4±0.9)%、(51.9±1.4)%、(75.4±0.7)%,各组间差异显著(P<0.05);MOI在100与500时,转染率差异不显著(P>0.05),即最适感染复数为100.RT-PCR结果提示转染细胞组EGFP基因有表达.结论 慢病毒载体能够有效转染离体兔角膜上皮细胞.     

携带人Oct4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW.方法 Sac Ⅱ线性化pLentiEF1a-Oct4-IRES-EGFP,回收片段并补平Sac Ⅱ切口,接着BamH Ⅰ酶切该片段,回收2.565 kb片段而获连接用Oct4-IRES-EGFP;EcoR Ⅰ线性化pFUGW,回收并补平EcoR Ⅰ切口,然后BamH Ⅰ酶切该片段,回收9.174 kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用Oct4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定.所构建载体命名为pFUOGW.获pFUOGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Oct4和EGFP基因的慢病毒感染293FF细胞和鼻咽癌细胞株C666-1、CNEI和6-10B以建立相应病毒感染体系.结果 酶切鉴定证实成功构建了pFUOGW,按标准程序生产的携带Oct4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B.结论 成功构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW,为相关后续的研究打下良好的基础.     

增强型绿色荧光蛋白和大鼠血管生长素-1基因共表达的重组慢病毒体外转染大鼠骨髓间充质干细胞

目的：观察共表达的血管生成素-1（Ang-1）基因和增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组慢病毒体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）．方法：体外包装Ang-1基因和EGFP基因共表达的重组慢病毒,测定病毒滴度．转染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转导效率,实时荧光定量PCR,Western blot分别在不同时间点行Ang-1基因mRNA以及蛋白表达的相对定量分析．将转染的rMSCs（Ang-1-rMSCs）与对照组rMSCs培养48h的上清液分别与人脐带静脉内皮细胞（HUVECs）共培养,MTT法检测HUVECs的吸光度值．结果：包装的浓缩慢病毒,滴度为6．1×10^10TU／L．转染rMSCs,5d转染效率为（92．7±3．01）％;实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示Ang-1-rMSCs中Ang-1基因mRNA及蛋白表达水平均以转染后3—7d为高峰,随后开始呈缓慢下降趋势．Ang-1-rMSCs与HUVECs共培养,与对照组rMSCs比较,MTT法检测显示Ang-1-rMSCs能明显促进HUVECs的增殖（P〈0．01）．结论：在体外重组的慢病毒成功转染rM—SCs,其Ang-1基因表达以转染后3—7d为高峰,且转染的rMSCs具有Ang-1基因的生物学活性．     

携带人Sox2和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW.方法 Xho Ⅰ线性化pLentiEF1a-SOx2-IRES-EGFP,回收片段并补平Xho Ⅰ切口,接着BamH Ⅰ酶切该片段,回收2.356 kb片段而获连接用Sox2-IRES-EGFP;EcoR Ⅰ线性化pFUGW,回收并补平EcoR Ⅰ切口,然后BamH Ⅰ酶切该片段,回收9.174 kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用Sox2-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定.所构建载体命名为pFUSGW.获pFUSGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Sox2和EGFP基因的慢病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、人胚肺成纤维细胞(HLFs)和人神经胶质瘤细胞(U87)以建立相应病毒感染体系.结果 酶切证实成功构建了pFUSGW,按标准程序生产的携带SOx2和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染MEFs、HLFs及U87.结论 成功构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW,为相关后续的研究打下了良好的基础.     

大鼠FasL基因重组慢病毒载体介导大鼠肾脏转染的实验研究

目的:使用FasL重组慢病毒载体通过大鼠肾动脉转染SD大鼠肾脏,观察转染后目的基因表达,为进一步进行移植实验奠定基础。方法:SD大鼠30只随机均分为实验组和对照组,实验组大鼠经肾动脉注入10 ng FasL重组慢病毒载体,对照组注入10 ng空白慢病毒载体,于转染后第3、7、15、25、40天分别采集标本,HE和IHC染色,观察组织形态、测定灰度值,并进行统计学分析。结果:各时段HE染色未见细胞形态改变及炎细胞浸润。IHC染色示转染后表达高峰出现于转染后第15天组。15天组与空白对照组差异有统计学意义(P0.05)。结论:大鼠FasL基因重组慢病毒载体成功转染大鼠肾脏并表达目的基因。     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础。方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒。慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度。将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL。重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达。BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P<0.05）。结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达。     

携带人c-Myc和EGFP基因慢病毒表达载体的构建

目的 构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW.方法 Xho I线性化plenti-EFla-c-Myc-IRES-EGFP,回收片段并补平Xho I,接着BamH I酶切该片段,回收2722 bp片段而获连接用c-Myc-IRES-EGFP;EcoR I线性化pFUGW,回收并补平EcoR I...     

大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建Tmub1基因的过表达慢病毒载体(LV-Tmub1),为研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料.方法 化学合成Tmub1基因序列,用BamHI/AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体,PCR产物连接入线性化表达的载体.PCR鉴定引物,再对PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析.使用构建的LV-Tmnb1,转染293T细胞,荧光法检测构建的慢病毒滴度.结果 成功构建了LV-Tmub1,并获得相应的病毒,病毒滴度为2×108 TU/mL.结论 LV-Tmub1为进一步研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础.     

SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达

目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体, 建立稳定表达SOX9的LNCa P细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因, 将其克隆到慢病毒表达载体p LVX-IRES-Puro中, 双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞, 经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.q RT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 m RNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCa P细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株, q RT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体p LVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功, 实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.     

慢病毒携带shRNA对内皮细胞组织因子表达的抑制作用

目的:构建RNA干扰慢病毒栽体,研究慢病毒携带的短发夹干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)对内皮细胞中组织因子(tissue factor,TF)表达的抑制作用.方法:将靶向人TF基因的2条shRNA表达序列克隆到慢病毒栽体pENTRTM/U6的黏性末端,测序鉴定后,与目标栽体pLenti6/BLOCKiTTM-DEST vector进行位点特异性重组,再测序;经脂质体导入293 FT细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并测定病毒滴度.RT-PCR和ELISA检测干扰后内皮细胞TF的表达.结果:将目的序列成功连接到裁体上,并经测序分析证实载体构建成功;在293FT细胞中进行慢病毒包装,收集上清并检测病毒滴度为5×105/TU.RT-PCR和ELISA检测结果证实构建的携带shRNA的慢病毒可显著抑制内皮细胞TF的表达.结论:成功构建了携带人TF基因的RNAi慢病毒载体,慢病毒携带的短发夹干扰RNA能干扰内皮细胞中TF的表达,可为血栓栓塞性疾病的防治提供一种有效的方法.     

携带人miR302和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人miR302和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pFUM3GW.方法 Nhe Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pmiR302ApE以释放miR302,接着补平酶切位点而获连接用miR302:BamH Ⅰ酶切携带EGFP的慢病毒载体pFUGW,接着补平酶切产物.并去磷酸化而获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用miR302连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR302测序.所构建载体命名为pFUM3GW.获pFUM3GW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR302和EGFP基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F以建立相应病毒感染体系.结果 PCR、酶切和测序证实成功构建了pFUM3GW,按标准程序生产的携带miR302和EGFP基冈的慢病毒上清高效率感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)及鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F.结论 成功构建携带人miR302和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUM3GW,为相关后续研究打下了良好基础.     

大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术进一步研究MeCP2功能.方法 设计针对大鼠MeCP2 mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用菌落PCR法、酶切及DNA测序鉴定重组克隆.结果 重组克隆经菌落PCR及酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确.结论 两个大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用RNAi研究大鼠MeCP2功能打下了基础.