人IL—4重组逆转录病毒载体的构建及在人肿瘤细胞中的表达

利用多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法，从ＰＣＤ－ｈＩＬ－４质粒中扩增得到人白细胞介素４（ｈＩＬ－４）的ｃＤＮＡ－。ＤＮＡ序列测定证实此片段包含完整的ＩＬ－４开放阅读框架。应用ＤＮＡ重组技术，将此ｃＤＮＡ重组于逆转录病毒载休ＬＸＳＮ。用脂质体转染法将此重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７。得到滴度为２．５ｘ１０ＣＦＵ／ｍｌ的感染性病毒。病毒感染人白血病细胞株ＨＬ－６０、Ｋ５６２及Ｂｕｒｋｉｔ淋巴瘤细胞株Ｒａｊｉ，使之表达并分泌ＩＬ－４。逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法证实ｈＩＬ－４ｃＵＮＡ可在上述肿瘤细胞中持续转录。ＥＬＩＳＡ怯证实病肿瘤细胞分辨ＩＬ一４水平可高达３００Ｐ／１０细胞．２４小时。本研究为进一步探讨转ＩＬ一４基因用于血液系统恶性肿瘤免疫治疗的价值提供了基础。     

rhBMP—2 cDNA转染的NIH—3T3细胞对小鼠急性放射损伤的基因治疗

目的：探讨重组人骨形成蛋白－２（ｒｈＢＭＰ－２）ｃＤＮＡ转染的ＮＩＨ－３Ｔ３细胞对小鼠经６．５Ｇｙ，７．０Ｇｙγ射线全身照射引起的放射损伤的基因治疗作用及其机理。     

IL—2,IL—4基因联合转导人胃癌细胞株的实验研究

ＩＬ－２、ＩＬ－４基因联合转导人胃癌细胞株的实验研究周志强刘为纹孙贵银陈文生为了诱导机体产生更强的抗肿瘤免疫反应，我们研究了在同一肿瘤细胞表达两种细胞因子的可行性，将人白细胞介素２、４（ＩＬ－２、ＩＬ－４）基因联合转染到人胃癌细胞株ＳＧＣ－７９０１细...     

IL—6和B7双基因转染的小鼠EL—4肿瘤细胞诱导抗肿瘤免疫作用

目的：探讨ＩＬ－６和Ｂ７双基因转染的小鼠疫苗是否具有协同的抗肿瘤效应。方法：利用含小鼠Ｂ７分子和人ＩＬ－６分子ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体ｐＬｍＢ７ＳＮ和ｐＬｈＩＬ－６ＳＮ分别转染包装细胞株ＣＲＩＰ,经Ｇ１８抗 筛选后以吸Ｂ７或ＩＬ－６外源基因的病毒颗粒感染小鼠ＥＬ－４胸腺癌细胞,观察ＥＬ－４－ＩＬ－６、ＥＬ－４－Ｂ７、ＥＬ－４－ＩＬ６＋Ｂ７细胞在同基因宿主体内的致瘤性及作为抗肿瘤疫苗的能力。结果：相     

外源性hbFGF cDNA导入人角朊细胞及其表达

目的：观察外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因导入正常角朊细胞后,能否表达及分泌ｈｂＦＧＦ,并探讨其机理;为开展临床创面基因治疗提供实验依据和奠定物质基础。方法：采用脂质体包埋ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ转染培养的人角朊细胞,经Ｇ４１８筛选、克隆、扩大及传代培养含转基因的角朊细胞。用特异性ｎｅｏ探针原位杂交显示转基因角朊细胞内含有拟转入的ｐｃＤＮＡ３－ｈｂ     

白细胞介素-2基因转染人骨肉瘤细胞的体外生物学特性

目的 研究白细胞介素－２基因转染人骨肉瘤细胞体外生物学特性,方法：应用逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ将人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ插入人骨肉效率细胞,经Ｇ４１８筛选及ＰＣＲ分析获得阳性细胞,并测定其上清液中ＩＬ－２含量,结果：ＰＣＲ可从阳性细胞基因组中扩增出ＩＬ－２基因片段,并从其上清液中测得每２４ｈ１０＾５细胞ＩＬ－２活性为５０Ｕ－８００Ｕ。结论 逆转录病毒介导的ＩＬ－２ｃＤＮＡ可以在人骨肉瘤细胞系中获     

白细胞介素12对钴照射小鼠造血功能的影响

研究白细胞介素１２（ＩＬ－１２）对机体造血系统的调控作用。方法将ＩＬ－２两亚基的ｃＤＮＡ分别克隆入不同的真核表达载体，并导入同一ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞，获得分泌ＩＬ－１２的基因修饰细胞，经胶原包裹后注射入受辐射的小鼠腹腔，观察其分泌的ＩＬ－１２小鼠造血功能指标的影响。结果ＩＬ－１２可以明显增加受照射小鼠的内源性脾结节的数目，７．０Ｇｙ照射后１０天，空白对照组，母本细胞（３Ｔ３－０）组，及分泌ＩＬ－     

人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性的研究

为了探讨白细胞介素（ＩＬ）－２转基因表达抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳｖ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了人ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）的作用。所构建的人ＩＬ－２重组表达载体ｐＺＩＰｈｕＩＬ－２，以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀技术转染ＰＡ３１７细胞，筛选到Ｇ４１８抗性克隆，分泌假病毒颗粒达１０６ＣＦＵ／ｍｌ。以假病毒颗粒感染２．２．１５细胞系及正常人外周血单个核细胞，分泌ＩＬ－２水平可达６ＩＵ／ｍｌ，明显抑制２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ的分泌表达，与１００ＩＵ／ｍｌ重组的ＩＬ－２一样可诱导出相似的ＬＡＫ细胞活性。而不含ＩＬ－２ｃＤＮＡ的ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）的假病毒颗粒则无此作用。提示逆转录病毒载体。包装细胞系可以成功地实现人ＩＬ－２ｃＤＮＡ的转移和低水平的分泌和表达，并可明显抑制２．２．１５细胞分泌ＨＢｓＡｇ及诱导ＬＡＫ细胞活性。     

人白细胞介素-15cDNA真核表达载体的构建及其在肺癌细胞中的表达

目的观察人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在腺癌细胞内的表达。方法将人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ于ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点正向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ,构建ｐＬ－ＩＬ－１５－ＳＮ的重组质粒。以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导将该重组质粒转染到人肺鳞癌细胞（ＰＧ细胞系）和小鼠肺腺癌细胞（ＬＡ７９５细胞系）。经Ｇ４１８条件培养筛选,获得阳性细胞克隆。再经ＣＴＬＬ－２细胞增殖法测阳性细胞ＩＬ－１５的表达活性。结果获得３个ＰＧ细胞和４个ＬＡ７９５细胞阳性克隆,ＩＬ－１５活性测定显示其表达水平在２４ｈ内分别在１４２～２０１或１３８～１７８Ｕ／（ｍｌ·１０６细胞）。结论ＩＬ－１５ｃＤＮＡ转导的人和小鼠肺癌细胞可表达有生物学活性的ＩＬ－１５。     

细胞因子基因修饰人口腔鳞癌细胞株的建立及鉴定

用ＰＡ３１７包装的携带人ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α或ＩＬ－２ｃＤＮＡ３种逆转录病毒载体用来转染人口腔鳞癌细胞株Ｔｃａ－８１１３。经新霉素衍生物Ｇ４１８筛选出抗性克隆并扩增产生子代株。ＰＣＲ和细胞因子生物活性测定证实细胞因子基因整合入基因修饰细胞并通过细胞分泌相应活性蛋白产物。本研究显示对口腔鳞癌细胞的逆转录病毒介导细胞因子的基因转移方法切实、可靠。基因修饰细胞株的建立为研究其生物学行为提供了实验对象。     

细胞因子基因修饰人口腔鳞癌细胞株的建立及鉴定

用ＰＡ３１７包装的携带人ＩＦＮ－α，ＴＮＦ－或ＩＬ－２ｃＤＮＡ３种逆转录病毒载体用来转染人口脸鳞癌细胞株Ｔｃａ－８１１３。经新霉素衍生物Ｇ４１８筛选出抗性克隆并扩增产生子代株。ＰＣＲ和细胞因子生物活性测定证实细胞因子基因整合入基因修饰细胞并通过分泌相应活性的蛋白产物。     

人白细胞介素—2cDNA导入对卵巢癌耐药细胞株耐药性的逆转

为了构建ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒，并探讨白细胞介素－２（ＩＬ＿２）ｃＤＮＡ导入对顺铂诱民的卵巢癌耐药细胞株耐药性的影响。我们采用ＰＣＲ技术扩增人ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段，构建ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒。导入顺铂诱导的人卵巢癌耐药细胞株，观察其耐药性的改变。结果成功构建了ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒，并在Ｃｏｓ－７细胞高效表达，导入卵巢癌耐药细胞后其对顺铂的敏感性显著升高。说明转导ｐｃ     

人IL—12双亚基共表达载体的构建及其表达

构建人ＩＬ－１２的高效表达载体。方法采用ｐＣＤＮＡ３．１从已克隆ｐ４０ｃＤＮＡ基因与国外提供的ｐ３５ｃＤＮＡ基因上获得相应的编码荐因，分别构建表达载体进行转染。此后，又利用ｐＬＸＰＸＳＮ构建ＩＬ－１２双亚基共表达的逆转录病毒载体转导人肝癌细胞株，并经Ｇ４１８筛选。结果有功能活性的ＩＬ－１２的产生需要ｐ３５和ｐ４０基因的等量共转染，为此，人ＩＬ－１２双亚基共表达载体在转肝癌细胞株并经选择后，上清液中     

应用改建的cDNA表达质粒在哺乳动物细胞进行人IL—4高效…

人工合成人ＩＬ－４ｃＤＮＡ５＇末端３０个碱基序列作为探针，并将其与建立的基因文库进行克隆杂交，获得人ＩＬ－４ｃＤＮＡ片段。将该片段插入πＨ３Ｍ质粒并在猴ＣＯＳ细胞获得表达，再从质粒ｐｄＫＣＲ和ｐｄＢＰＶ－１出发构建了新的表达质粒ｐｄＢＨｈＩＬ－４，经磷酸钙沉淀法导入小鼠Ｃ１２７细胞获得成功转化的细胞克隆，该克隆细胞可高效地分泌ＩＬ－４活性多肽。改进细胞培养方法，有利于产物的提取和纯化；另外，应用测     

构建人白细胞介素2逆转录病毒载体和包装细胞

目的：构建人白细胞介素２（ｈＩＬ－２）逆转录病毒载体及包装细胞。方法：用基因重组法将ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ与ｐＬＮＣＸ重组成正义和反义ＬＮＣＩＬ－２基因。用磷酸钙－甘油法及感染法将ＬＮＣＩＬ－２基因转入ＰＡ３１７包装细胞内。所得克隆Ａ８的ｈＩＬ－２分泌量，ＤＮＡ、ＲＮＡ分别用ＥＬＩＳＡ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交法分析。结果：Ａ８分泌的ｈＩＬ－２量为８．４ｎｇ·（２４ｈ·１０６细胞）１，ｈＩＬ－２基因完整地整合到转导细胞基因组内并有ｈＩＬ－２ｍＲＮＡ表达，细胞上清内病毒滴度为１０６·ＣＦＵ·ｍｌ１。结论：本研究成功地构建编码ｈＩＬ－２的逆转录病毒载体，并筛选出能产生病毒粒子、分泌ｈＩＬ－２的包装细胞。     

IL—4基因修饰对HL—60及其诱导人PBMC增殖反应的影响

为探讨人白细胞介素４（ｈＩＬ－４）ｃＤＮＡ修饰对人髓系白血病株ＨＬ－６０细胞体外生物学特性的影响，构建了ｈＩＬ－４重组逆录病毒载全。用脂质体转染法将其导入包装细胞获高效价病毒上清，用其感染ＨＬ－６０细胞株并筛竿了ＨＩＬ－４高表达克克隆５株，用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测其增殖反应及其讫地的正常人ＰＢＭＣ增殖反应。结果显示，ＩＬ－４同表达克隆体外增殖反应明显强于低表达克隆；丝裂线素处理后，前者诱导的正常     

人白细胞介素—15cDNA真核表达载体的构建及其在肺癌细胞？…

目的 观察人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在腺癌细胞内的表达,方法将人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ于ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨＩ位点正向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ构建ＰＬ－ＩＬ－１５－ＳＭ的重组质粒。以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导将该重组质粒转染到人肺鳞癌细胞（ＰＧ细胞系）和小鼠肺腺癌细胞（ＬＡ７９５细胞系）。经Ｇ４１８条件培养筛选,获得阳性细胞克隆。再经ＣＴＬＬ－２细胞增殖法阳性细胞ＩＬ－１５的表达活性。结果 获得３个ＰＧ     

逆转录病毒介导癌基因疗法体外安全实验

从逆转录病毒ｐＬＸＳＮ与人ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因进行重组，包括ＰＡ３１７细胞，建立逆转录病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ。用病毒上清液转导人淋巴细胞（ＴＩＬ，ＰＢＬ）和３株人腺癌细胞株（ＳＰＣ－Ａ１，ＭＫＮ－ＨｅｐＧ２）对转ＩＬ－２基因的淋巴细胞（ＴＩＬ／ＩＬ－２，ＰＢＬ／ＩＬ－２）和转ＩＬ－２基因的人癌细胞（ＳＰＣ－Ａ２／ＩＬ－２，ＭＫＮ－４５／ＩＬ－２，ＨｅｐＧ２／ＩＬ２）进行体外安     

电离辐射对淋巴细胞DNA合成的影响及适应性反应

目的：探讨淋巴细胞预先接受低剂量电离辐射后，对大剂量照射的适应性反应。方法：用０．０４８Ｇｙγ－射线照射后接受０．５￣８．０Ｇｙ攻击剂量照射，以＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法观察淋巴细胞ＤＮＡ合成能力的变化。结果：淋巴细胞接受低剂量照射时能提高被大剂量的ＤＮＡ合成４．０Ｇｙ的照射时适应性反应最充分。结论：低剂量辐射能诱导淋巴细胞对大剂量辐射的适应性反应。     

人白细胞介素2基因转染角朊细胞稳定表达的检测

目的 观察人白细胞介素２（ＩＬ－２）基因皮肤角朊细胞中的稳定表达及分泌情况。方法 ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导法转染，以Ｇ４１８筛选出阳性克隆并做扩大培养用ＤＮＡ斑点杂交，ＲＮＡ斑点杂交，细胞铺片原位杂交，免疫组织化学，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交分析及噻唑蓝（ＭＴＴ）法检测外源基因在角朊细胞内的表达及分泌情况。结果 ＤＮＡ斑点杂交ＲＮＡ斑点杂交，原位杂交和免疫组织化学以均显著转染组有阳性信号，Ｗｅｓ