蜱中人粒细胞埃立克体DNA的PCR检测及序列分析

目的了解吉林地区蜱种感染人粒细胞埃立克体的情况。方法采用16S rRNA基因特异引物进行半套式PCR,检测吉林省部分林区蜱中人粒细胞埃立克体DNA,并对扩增产物进行克隆和测序,与已知序列进行同源性比较。结果从采集于吉林地区的全沟硬蜱中检出人粒细胞埃立克体的特异性DNA片段,阳性率为1.98%。扩增产物经克隆、测序发现吉林地区人粒细胞埃立克体扩增片段与美国人粒细胞埃立克体分离株(GenBank注册号为U02521)16SrRNA基因序列相对应片段相差2个核苷酸,同源性为99.7%。结论吉林地区的全沟硬蜱携带人粒细胞埃立克体,提示吉林地区可能存在人粒细胞埃立克体病的自然疫源地。     

内蒙古林区蜱咬人群人粒细胞埃里希体病DNA检测

人粒细胞埃里希体病,是1994年美国发现的嗜人类粒细胞埃里希体(human granulocgtic ehrlichia)引起的人粒细胞埃里希体病,一些硬蜱是其主要传播媒介,其临床表现主要有发热、寒战、不适、肌痛、头痛等类感冒症状和恶心、呕吐、意识模糊等,严重者出现肾功能衰竭和中枢神经系统受损。甚至死亡。2001年黑龙江省林区的全钩硬蜱中检测出人粒细胞埃里希体病原体DNA,     

从内蒙采集的全沟硬蜱中分离出莱姆病病原体

1989年5月在内蒙呼盟莫尔道嘎林区采集到游离的全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)和草原革蜱(Dermacentor nuttalli)。从一组全沟硬蜱(20只)中分离出一株螺旋体,经形态及免疫学初步鉴定,为伯氏疏螺旋体。从而,在病原学上提示,内蒙可能也存在莱姆病自然疫源地。     

从西藏微小牛蜱检出类查菲埃立克体和边缘无形体16S rDNA

目的　鉴定微小牛蜱 (Boophilusmicroplus)所携带的埃立克体病原体。方法　依据蜱传埃立克体 16SrDNA序列设计引物 ,建立埃立克体属特异性套式PCR检测微小牛蜱DNA样本 (每份DNA由 2个蜱提取 ) ;克隆DNA样本中的埃立克体 16SrDNA的 5′末端片段并测定其序列。结果　西藏某地的 4 3份蜱DNA样本中有 16份 (37% )经套式PCR扩得阳性片段 ,而四川某地的 2 7份蜱DNA样本扩增结果均为阴性。测定 16SrDNA的 5′末端片段 (～ 4 5 0bp)的序列 ,发现两种序列 ,一种与边缘无形体 16SrDNA完全一致 ,另一种与查菲埃立克体 16SrDNA最相关 ,但它们之间有 7个碱基 (～ 1 6 % )的不同。结论　西藏某地的微小牛蜱中携带有类查菲埃立克体和边缘无形体 ,该类查菲埃立克体可能是一个埃立克体新种     

从新疆采集的全沟硬蜱中分离出莱姆病病原体

1987年5月,在新疆玛纳斯县芦草沟采集19只全沟硬蜱(Ixodes persulcatus),用金黄地鼠接种和纯培养的方法分离出1株形态、免疫学特征与伯氏疏螺旋体(Borrelis burg-dorferi)相同的疏螺旋体,表明当地存在着莱姆病疫源地。     

黑龙江逊克地区森林革蜱斑点热立克次体DNA的检测

目的 调查黑龙江逊克地区蜱传斑点热自然疫源地,发现该地区蜱携带斑点热立克次体的种类。方法 采用斑点热立克次体ompA和gltA基因特异的PCR,检测该地区森林革蜱的DNA样本,并对扩得阳性产物进行测序和聚类分析。结果 从60只森林革蜱中检测有14只扩得斑点热立克次体ompA和gltA基因片段,阳性率为23.33%。随机选择2只蜱的阳性片段进行测序,二者同源性为100%,ompA基因序列与Rickettsia sp.JL-02同源性为99.30%, 与Rickettsia raoultii为99.18%。结论 黑龙江省逊克地区森林革蜱携带与Rickettsia sp.JL-02株亲缘关系相近的斑点热群立克次体。     

聚合酶链反应对脑脊液标本中结核杆菌DNA重复序列的检测

采用聚台酶链反应（ＰＣＲ）对３４例结核性脑膜炎（结脑）患者脑脊液（ＣＳＦ）进行检测，其中５份结核杆菌培养阳性的标本，ＰＣＲ检测均阳性；２９例ＣＳＦ结核杆菌培养阴性的标本，１９例ＰＣＲ检测阳性，总的阳性率为７０．５％。而作为对照的２０例非结脑患者的ＣＳＦ标本则无阳性。利用育法微量结核杆菌与对照菌测试，可以反证本方法的准确性，其符合率为１００％，提示本方法可以用于临床标本中结核杆菌ＤＮＡ的快速检测，不失为一快速，灵敏而又特异的诊断手段。关键词     

广东地区首例人博卡病毒的检出及鉴定

目的 建立人博卡病毒(HBoV)筛查检测平台,了解广东地区支气管肺炎患儿HBoV感染情况.方法 采用PCR技术筛查HBoV核蛋白(NP)基因片段,阳性标本作HBoV衣壳蛋白(VP)基因片段鉴定,并进行核酸序列和进化树分析.结果 从50例住院支气管肺炎患儿鼻咽分泌物中检测出1例HBoV,为广东地区首例,命名为GD-1株.HBoV VP基因部分序列分析与基因库中HBov VP基因序列同源性比对,除与韩国KNIH-2K6GJ2713株同源性为36%、与美国NH4549株同源性为77%外,与其他所有VP基因序列同源性均>95%,与法国株、北京株、加拿大株的同源性>98%.GD-1株HBoV部分VP基因片段与北京CZ株、加拿大株、西班牙株、意大利株等在同一基因进化簇主分枝中,与法国175/03/2002FRA株同在一个侧枝中.结论 广东地区存在HBoV感染,有进一步研究的必要性.     

辽宁省东部山区长角血蜱中SFGR DNA的检测和序列分析北大核心CSCD

目的调查辽宁省东部地区蜱类携带斑点热群立克次体(SFGR)情况及种型分布。方法采集辽宁省本溪、宽甸长角血蜱,提取DNA,采用PCR扩增SFGR ompA基因,并进行测序和聚类分析。结果 65份(368只)长角血蜱标本有7份扩增出SFGR OmpA基因片段,阳性率为10.77%。对其中3份标本的扩增片段(BH36、BH30、KD9)测序后进行聚类分析,ompA基因序列与SFGR河北株暂定种Candidatus R.hebeiii(HQ651815、HQ651817)同处于一个分支,同源性为99.83%~100%;与R.heilongjiangensis和R.japonica遗传距离较近,与其他SFGR遗传距离较远。结论辽宁省东部地区长角血蜱携带SFGR Candidatus R.hebeiii,且感染较普遍。     

山东省首例实验室诊断人单核细胞埃立克体病调查

目的 报告山东省首例人单核细胞埃立克体病的发现、诊治经过及其实验室检测.方法 对该疑似病例开展流行病学调查并填写个案调查表,采集其血标本,套式-PCR技术检测血液中嗜吞噬细胞无形体和查菲埃立克体特异性16S rRNA基因.结果 患者为不明原因发热,伴WBC和PLT减少.嗜吞噬细胞无形体特异性核酸检测阴性,查菲埃立克体特异性核酸检测阳性.PCR扩增阳性产物进行测序并与GenBank中注册的已知序列进行比较分析,显示与查菲埃立克体的同源性＞99％.结论 山东省存在查菲埃立克体感染病例,进一步开展自然疫源地调查十分必要.     

用半套式PCR检测蜱和啮齿动物中查菲埃立克体

目的　了解福建西北部林区查菲埃立克体 (Ehrlichiachaffeensis)的存在情况。方法　用 16SrRNA基因特异引物进行半套式PCR ,检测从福建武夷山和宁化采集的蜱类及野生动物中的查菲埃立克体DNA ,然后对有代表性的标本的扩增产物进行克隆和序列测定 ,并与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较。结果　从该地区的越原血蜱 ,野鼠(褐家鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、社鼠、小家鼠 )和野兔的脾脏和 /或血块中均扩增出了查菲埃立克体的特异片段。越原血蜱成蜱 2 40组 (6 16只 ) ,31组阳性 ,最小阳性率 5 0 %。野鼠脾脏标本 39份 ,2 2份阳性。野鼠和野兔血块标本共 35份 ,14份阳性。 390bp的PCR产物经克隆、测序后分析发现其DNA序列与美国查菲埃立克体分离株对应位置一致。结论　福建西北部林区可能存在人单核细胞埃立克体病的自然疫源地。     

套式PCR应用于恙虫病鼠类标本的检测研究

目的　评价基因扩增法应用于检测鼠类标本调查恙虫病疫源地的作用。方法　用一定量恙虫病东方体人工感染昆明种小鼠 ,攻击后第 3、6、9天处死小鼠取血块及脾脏用特异性套式 PCR技术进行恙虫病东方体 DNA的检测 ,再用该技术测定现场采集的鼠类标本 ,以可从标本中扩增出一段长 88bp的 DNA片段作为实验或现场捕获鼠感染了恙虫病东方体的指标 ,继而估计该地区是否存在恙虫病疫源地。结果　实验感染恙虫病东方体 3天时在两类标本中均不能检出该病原 DNA,而第6天测定时均可发现含有恙虫病东方体 ;从福建闽西北地区采集的 111份鼠类脾脏中检出 1份阳性标本 ,另从江西送检的 2 9份野鼠血块中也检出 1份阳性标本 ,说明采集标本区域已成为恙虫病疫源地。结论　套式 PCR扩增技术具有很好的特异性和敏感性 ,可用于现场鼠类标本的恙虫病病原学的调查。     

我国4省、自治区细粒棘球绦虫DNA限制性片段长度多态性分析

运用 DNA探针pHD5、pEG18、pSM889 结合 Southern blot 杂交技术对采自我国新疆、青海、甘肃和宁夏等地的羊源细粒棘球蚴与采自青海、甘肃的牦牛源细粒棘球蚴进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析。结果表明我国这些省、自治区采集的羊源细粒棘球蚴彼此之间未见有明显而稳定的杂交条带差异,属于同一虫株。青海和甘肃两省牦牛源细粒棘球蚴彼此之间也未见明显而稳定杂交条带差异,据杂交图谱判断似与羊源细粒棘球蚴属同一虫株。     

聚合酶链反应检测肾移植受者尿中人巨细胞病毒的临床应用

为探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测肾移植受者（ＲＴＲ）尿中人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡ在临床工作中的应用及其价值，本组采用ＨＣＭＶ早期及晚期基因组两对引物及ＨＣＭＶ特异性单抗分别建立了ＰＣＲ技术及捕获、间接酶联法（ＭａｃＥＬＩＳＡ，ＩＥＬＩＳＡ）。应用ＰＣＲ检测ＲＴＲ尿中ＨＣＭＶＤＮＡ、ＭａｃＥＬＩＳＡ及ＩＥＬＩＳＡ法检测各受血者中ＨＣＭＶ－ＩｇＭ及ＩｇＧ，并比较其结果，表明：６５例ＲＴＲ尿中ＨＣＭＶＤＮＡ阳性率为６０％，ｌｇＭ及ＩｇＧ阳性者尿中ＨＣＭＶＤＮＡ阳性率各为８１．８％及５４．５％。说明ＰＣＲ应用存在一定局限性，应与血清学等方法相结合，取长补短，才能适应临床需要，充分发挥其应用价值。     

一种简单的检测甲型肝炎病人血清循环免疫复合物中HAV RNA的免疫捕获聚合酶链反应方法

目的 建立一种简单的检测甲型肝炎病人血清循环免疫复合物中HAV RNA的方法。方法 应用差速离心法分离甲肝病人血清中的循环免疫复合物,置于已用抗人μ链包被的离心管中吸咐,再用RT/PCR法扩增,用PAGE银染法检定扩增结果。结果 检测24份甲肝病人血清标本,其中19份为HAV RNA阳性,而检测正常人与乙型肝炎及丙型肝炎病人血清标本均为阴性。结论 该方法简便,敏感性及特异性较高,是检测甲型肝炎病人血清循环免疫复合物中HAV RNA的较好方法之一。     

黑热病患者尿中循环抗原的检测及识别抗原分子的研究

“致死性疾病”在苏丹蔓延。我国黑热病亦回升。急迫需要建立新的、对病人无损伤的诊断方法。作者等已建立用血清ＭｃＡｂ－ＡＳＴ诊断黑热病的方法。本文报道用同法检测病人尿中循环抗原的结果。对１７例确诊黑热病患者尿液的检测，１６例呈阳性反应，阳性率９４％。正常人对照３０例均呈阴性结果。１５／１５例黑热病息者血清ＭｃＡｂ－ＡＳＴ显阳性。同一病倒尿样、血清反应的阳性程度相近。取尿液较之任何采样途经都更为简便，特别是对婴幼儿发病率高的山丘疫区，更为适合。免疫印迹法显示识别出二条特异区带。其分子量分别为４５ｋＤ和２２ｋＤ。进一步鉴定出黑热病患者尿中的Ｌ．ｄ抗原。系国内外首次报道。     

PCR及PCR-ELISA法检测蚊体内马来丝虫幼虫

目的：建立一种检测蚊体内马来丝虫幼虫的灵敏、快速、特异的方法。方法：选择应用PCR及PCR－ELISA法检测马来丝虫幼虫DNA的最佳反应条件，并在该条件下分别以马来丝虫Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期幼虫各1条作模板，测定检测的灵敏度及检测实验室人工感染中华按蚊体内的马来丝虫幼虫。结果：PCR及PCR－ELISA法均能检测出1条Ⅰ期幼虫（L1），而PCR的检测下限为1／10条L1，PCR－ELISA检测下限为1／100条L1；将分离的感染期幼虫加阴性蚊媒进行粗提、扩增及电泳，结果未见明显的扩增条带，扩增产物作ELISA检测，全部为阴 性；个体解剖人工感染的中华按蚊120只，分别收集113只阳性蚊体内的幼丝虫，用两种方法检测，结果均为阳性。结论：初步建立了PCR及PCR－ELISA法检测蚊体内马来丝虫幼虫的方法。     

4种方法检测牛奶等样品中微量隐孢子虫卵囊的比较

目的 评价4种方法检测牛奶等样品中隐孢子虫卵囊污染情况的应用价值。 方法 利用Nested PCR、PCR、饱和蔗糖溶液漂浮及金胺酚-改良抗酸染色4种方法,分别对36份牛奶、73份奶牛粪便及10份污水样品中鼠隐孢子虫卵囊进行检测。 结果 Nested PCR方法的检出率分别为11.11％、23.29％和0,均高于其他3种方法。结论4种检测方法中,Nested PCR敏感性最高、特异性强、稳定性好,可用于微量隐孢子虫卵囊检测。     

恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因体外扩增、克隆及序列分析

目的：构建恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因原核表达质粒pET28α-Pf12,测定Pf12基因序列,并为FCC1／HN株Pf12的体外表达奠定基础。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中扩增出Pf12基因,扩增产物经纯化,用BamHI XhoI双酶切,定向克隆入pET28α质粒,转化大肠杆菌DH5α,再用BamHI XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,并应用PCGENE软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果：筛选出编码FCC1／HN株Pf12基因的原核表达质粒pET28α－Pf12重组质粒的构建,为恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因的体外表达奠定基础。