5′-荧光素标记的RelA反义脱氧寡核苷酸在人白血病细胞HL-6O中的分布及稳定性

目的　比较修饰型及未修饰型 Rel A反义脱氧寡核苷酸 ( AS- ODN)在人白血病细胞 HL- 60中的分布及稳定性。方法　将荧光素 ( FAM)标记的硫代磷酸酯修饰型及未修饰型 AS- ODN经脂质体介导或直接转染人 HL- 60细胞 ,应用荧光显微镜及流式细胞仪观察细胞内荧光的时相分布。结果　发现 1μm ol/ L 修饰型 AS- ODN进入细胞后 ,细胞内荧光强度 6h达到高峰。在有脂质体存在时 ,细胞内荧光明显增强 ,12 h后荧光减弱并逐渐消失 ;而 AS- ODN直接转染细胞 ,细胞内特别是核内荧光强度明显比脂质体组弱。未修饰型 AS- ODN直接或经脂质体介导转染 ,细胞内荧光强度均很弱 ,滞留时间不超过 4h。结论　脂质体可以提高细胞对 AS- ODN的摄取及核聚积 ,而硫代磷酸酯修饰型 AS-ODN具有更好的稳定性     

核因子—kB在TNF—α诱导HL—60细胞凋亡中的作用

目的 了解白血病细胞系HL-60中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的核因子-kB(NF-kB）活化与细胞凋亡之间的关系。方法 采用脂质体基在转染技术，将突变的核因子抑制蛋白（IkBα）质粒（PCMV4-1kBαS32//36∧）转染HL-60细胞，于48后测其瞬时表达效应。用间接免疫荧光和Western blot技术检测转染组和诱导及生长抑制效应。结果 TNF-α可诱导非转染组HL-60细胞的NF-kB活化，不能诱导转染组细胞的NF-kB活化，即突变型IkBα可特异性抑制HL-60细胞的NF-kB活化。结论 用突变型IkBα特异性抑制HL-60细胞的NF-kB活化，能明显增加其对TNF-α的敏感性。     

Ⅱ．胃癌细胞SGC-7901中乙酰肝素酶基因和CD44v6表达的关系

目的：探讨乙酰肝素酶（HPA）反义寡核苷酸（AS-ODN）对CD44v6表达的影响。方法：采用脂质体介导HPAAS-ODN转染人胃癌细胞株SGC-7901．RT-PCR检测HPA mRNA的表达，采用免疫细胞化学SABC法观察细胞内CD44v6表达的变化。结果：脂质体介导转染HPA AS-ODN48h后．SGC-7901胃癌细胞内HPA mRNA表达下降，CD44v6阳性表达率转染前69．4％，转染不同浓度的AS-ODN后分别为56．5％，54．1％，46．5％和41．3％。转染后细胞CD44v6表达明显减少（P〈0．01）。结论：HPA AS-ODN可以有效抑制胃癌细胞CD44v6的表达。     

寡核苷酸转染原代培养pMφ的研究

目的研究阳离子脂质体为载体的寡核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODNs)转染原代培养的大鼠腹腔巨噬细胞(pMφ)的时相关系、分布以及转染效率。方法以阳离子脂质体为载体,将荧光标记的圈套ODNs(2.0μg/ml)转染入纯化的大鼠pMφ细胞,分别在30 min、1 h,3 h,6 h,9 h,12 h,18 h,24 h用荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察荧光标记的圈套ODNs在细胞内的动态变化。结果荧光显微镜下转染30 min细胞内便有荧光标记的圈套ODNs出现,转染6~12 h细胞内的荧光最强。激光共聚焦显微镜显示转染30min细胞内荧光标记的圈套ODNs主要分布在胞浆内,随着时间的延长,细胞内尤其胞核内的荧光越来越强,转染6~12h细胞内的荧光最强。Results:结论以阳离子脂质体为载体的哑铃形圈套ODNs可转染入大鼠pMφ细胞并分布于胞浆及胞核。     

Bcl-2shRNA表达载体的构建及其对HL-60细胞生长的抑制作用

目的构建Bcl-2短发夹样RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列的表达载体并研究其对HL-60细胞生长的抑制作用。方法化学合成2段编码短发夹RNA序列针对Bcl-2基因66个碱基的寡核苷酸，克隆到Pgenesil-1载体的u6启动子的下游，重组构建RNAi质粒，同时设立阴性对照；然后经酶切电泳和DNA测序鉴定。采用脂质体介导的转染方法将重组的RNAi质粒转入HL-60细胞后，采用RT-PCR检测Bcl-2mRNA表达水平；采用MTT法测定细胞增殖情况。结果重组构建的两个Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析，结果表明66个碱基成功插入到预期位点，并且序列完全一致。转染Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体分别入HL-60细胞24h，其Bcl-2 mRNA表达水平均降低，但转染Bcl-2 shRNA1引起的Bcl-2 mRNA表达下降更为明显，分别与转染阴性shKNA及未转染组比较，有显著性差异（P〈0.05）。MTT测定显示转染Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体入HL-60细胞在72、96h细胞生长明显受到抑制，分别与转染阴性shRNA、单纯脂质体组及未转染组比较，差异有显著性（P〈0.05）。结论成功地构建了两个Bcl-2 shRNA1、shRNA2表达载体，且Bcl-2 shRNA可序列特异性地抑制HL-60细胞的生长。     

针对c-myc mRNA两个不同位点的c-myc反义寡脱氧核苷酸抑制类风湿滑膜细胞增殖的比较

目的:研究针对c-myc mRNA不同位点的两种反义寡脱氧核苷酸序列(AS-ODN):myc-AUG AS-ODN,myc-CRD AS-ODN,对类风湿滑膜细胞增殖的抑制作用.方法:培养人类风湿滑膜B型细胞,合成反义寡脱氧核苷酸序列并进行硫代磷酸化修饰,以脂质体Lipofectin为载体,转染滑膜细胞,用MTT法检测细胞的增殖情况.结果:myc-AUG AS-ODN,myc-CRD AS-ODN均能抑制滑膜细胞增殖,使细胞数目减少的最大值分别为40.0%和41.4%.myc-AUG AS-ODN抑制滑膜细胞增殖的起效时间早于myc-CRD AS-ODN.在高浓度时寡脱氧核苷酸具有非序列特异性细胞毒作用.结论:两种AS-ODN序列均可用于抑制滑膜细胞增殖.     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对胃癌细胞侵袭和转移的影响Ⅱ.胃癌细胞SGC-7901中乙酰肝素酶基因和CD44v6表达的关系

目的:探讨乙酰肝素酶(HPA)反义寡核苷酸(AS-ODN)对CD44v6表达的影响.方法:采用脂质体介导HPA AS-ODN转染人胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR检测HPA mRNA的表达,采用免疫细胞化学SABC法观察细胞内CD44v6表达的变化.结果:脂质体介导转染HPA AS-ODN 48 h后,SGC-7901胃癌细胞内HPA mRNA表达下降,CD44v6阳性表达率转染前69.4%,转染不同浓度的AS-ODN后分别为56.5%,54.1%,46.5%和41.3%.转染后细胞CD44v6表达明显减少(P＜0.01).结论:HPA AS-ODN可以有效抑制胃癌细胞CD44v6的表达.     

脂质体介导转染bcl-2反义核酸进入HL60细胞的动力学模式和生物学效应

bcl- 2基因是重要的抗凋亡和耐药基因 ,在造血系统恶性肿瘤细胞中普遍高表达。利用 bcl- 2反义核酸有望抑制bcl- 2基因的表达 ,促进细胞凋亡 ,提高肿瘤对化疗的敏感性。　目的　应用阳离子脂质体介导或寡核苷酸直接转染技术 ,建立 HL6 0细胞摄入荧光素标记的 bcl- 2寡核苷酸的动力学模式 ,研究脂质体介导下 bcl- 2反义核酸对 HL6 0细胞的生物学效应 ,初步探讨脂质体的生物学作用。　方法　应用荧光素标记的寡核苷酸 ,凝胶电泳观察脂质体寡核苷酸复合物的形成 ,流式细胞仪测定细胞内的平均荧光强度和 bcl-2蛋白的表达 ,荧光显微镜观察细胞内荧光物质的分布 ,3H-Td R掺入法和 MTT法检测 HL6 0细胞的生长 ,RT- PCR法检测细胞内 bcl- 2 m RNA的表达水平。　结果　 (1)当脂质体与寡核苷酸的质量比合适时 ,两者可形成复合物。(2 )脂质体介导转染法显著提高 HL6 0细胞对寡核苷酸的摄入 ,当脂质体与寡核苷酸的质量比 (μg/ μg)为 2 .0 / 1时 ,细胞内相对平均荧光强度可达寡核苷酸直接转染时的 40倍 ,而且 HL6 0细胞对寡核苷酸的摄入与其浓度和作用时间有关 ,未标记的寡核苷酸竞争性抑制细胞对标记寡核苷酸的摄取。 (2 )细胞内的寡核苷酸可向胞外转运 ,脂质体介导转染后 ,胞内荧光强度衰减缓慢 ,t1 /2 约为 4h,     

阳离子脂质体增加造血系统恶性肿瘤细胞株对寡核苷酸G3139的摄入

目的观察阳离子脂质体DOSPER介导或Bcl-2反义寡核苷酸G3139直接作用时,造血系统恶性肿瘤细胞株对G3139的摄入,为阳离子脂质体和反义寡核苷酸的进一步应用提供依据.方法利用异硫氰酸荧光素标记的G3139,流式细胞仪(FCM)测定造血系统恶性肿瘤细胞株HL60、K562、U937、CA46和CEM细胞内的平均荧光强度.结果 G3139直接作用于细胞时,细胞内荧光强度U937>HL60>CA46>K562>CEM(P<0.05);DOSPER介导转染时,各细胞内的荧光强度均显著高于直接转染时(P<0.01),而且当DOSPER/G3139(μg/μg)为2～3∶1时,转染效率最佳,但此时各细胞间细胞内平均平均荧光强度无明显的差别(P>0.05).结论不同造血系统恶性肿瘤细胞株对G3139的摄入不同,阳离子脂质体DOSPER可普遍提高细胞对G3139的摄入.     

阳离子脂质体介导NF-κB“decoy”ODNS转染巨噬细胞条件的优化

目的：观察NF-κB“decoy”ODNS在阳离子脂质体lipofectin介导下转染小鼠巨噬细胞J774．1的优化参数以及在细胞内的分布。方法：改变ODN与lipofectin比率、转染时间;用流式细胞仪检测细胞内的相对荧光强度和摄取率评价转染效率;荧光显微镜观察细胞内荧光分布;测定细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)观察细胞损伤情况。结果：Lipofectin介导转染显著提高J774．1细胞对NF—κB“decoy”0DNS的摄取;在24孔培养板中,NF—κB“decoy”ODNS与lipofectin比率(W／W)为1：5、转染6h时,转染效率最佳而细胞毒性相对较低;lipofectin介导转染6h后,细胞内荧光物质主要聚集于细胞核和部分细胞质中,而直接转染时荧光物质多分布于细胞质。结论：Lipofectin可增加NF—κB“decoy”ODKS的细胞摄入并改变其细胞内分布;NF—κB“decoy”0DNS与lipofectin比率(W／W)为1：5、转染6h时可获得最佳转染效率。     

胃癌细胞SGC-7901中乙酰肝素酶基因和CD44v6表达的关系

目的:探讨乙酰肝素酶(HPA)反义寡核苷酸(AS-ODN)对CD44v6表达的影响。方法:采用脂质体介导HPAAS-ODN转染人胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR检测HPAmRNA的表达,采用免疫细胞化学SABC法观察细胞内CD44v6表达的变化。结果:脂质体介导转染HPAAS-ODN48h后MSGC-7901胃癌细胞内HPAmRNA表达下降MCD44v6阳性表达率转染前69.4%M转染不同浓度的AS-ODN后分别为56.5%,54.1%,46.5%和41.3%。转染后细胞CD44v6表达明显减少(P<0.01)。结论:HPAAS-ODN可以有效抑制胃癌细胞CD44v6的表达。     

核因子-κB在TNF-α诱导HL-60细胞凋亡中的作用

目的　了解白血病细胞系 HL- 60中 ,肿瘤坏死因子 - α( TNF- α)诱导的核因子 - κB( NF- κB)活化与细胞凋亡之间的关系。方法　采用脂质体基因转染技术 ,将突变的核因子抑制蛋白 ( IκBα)质粒 ( p CMV4- IκBαS32 / 36 A)转染 HL-60细胞 ,于 48h后测其瞬时表达效应。用间接免疫荧光和 Western blot技术检测转染组和非转染组 HL- 60细胞的 NF-κB活化状态 ,同时用流式细胞术和 MTT法分别检测 TNF- α对两组 HL- 60细胞的凋亡诱导及生长抑制效应。结果　TNF- α可诱导非转染组 HL- 60细胞的 NF- κB活化 ,不能诱导转染组细胞的 NF- κB活化 ,即突变型 IκBα可特异性抑制HL- 60细胞的 NF- κB活化。结论　用突变型 IκBα特异性抑制 HL- 60细胞的 NF- κB活化 ,能明显增加其对 TNF- α的敏感性     

阳离子脂质体介导NF-κB"decoy"ODNs转染巨噬细胞条件的优化

目的:观察NF-κB "decoy"ODNs在阳离子脂质体lipofectin介导下转染小鼠巨噬细胞J774.1的优化参数以及在细胞内的分布.方法:改变ODN与lipofectin比率、转染时间;用流式细胞仪检测细胞内的相对荧光强度和摄取率评价转染效率;荧光显微镜观察细胞内荧光分布;测定细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)观察细胞损伤情况.结果:lipofectin介导转染显著提高J774.1细胞对NF-κB "decoy"ODNs的摄取;在24孔培养板中,NF-κB "decoy"ODNs与lipofectin比率(W/W)为1∶5、转染6 h时,转染效率最佳而细胞毒性相对较低;lipofectin介导转染6 h后,细胞内荧光物质主要聚集于细胞核和部分细胞质中,而直接转染时荧光物质多分布于细胞质.结论:lipofectin可增加NF-κB "decoy"ODNs的细胞摄入并改变其细胞内分布;NF-κB "decoy"ODNs与lipofectin比率(W/W)为1∶5、转染6 h时可获得最佳转染效率.     

核因子-кB在TNF-α诱导HL-60细胞凋亡中的作用

目的了解白血病细胞系HL-60中,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的核因子-кB(NF-кB)活化与细胞凋亡之间的关系.方法采用脂质体基因转染技术,将突变的核因子抑制蛋白(IкBα)质粒(pCMV4-IкBαs32/36A)转染HL-60细胞,于48 h后测其瞬时表达效应.用间接免疫荧光和Western bbt技术检测转染组和非转染组HL-60细胞的NF-кB活化状态,同时用流式细胞术和MTT法分别检测TNF-α对两组HL-60细胞的凋亡诱导及生长抑制效应.结果 TNF-α可诱导非转染组HL-60细胞的NF-кB活化,不能诱导转染组细胞的NF-кB活化,即突变型IкBα可特异性抑制HL-60细胞的NF-кB活化.结论用突变型IкBα特异性抑制HL-60细胞的NF-кB活化,能明显增加其对TNF-α的敏感性.     

阿霉素在人白血病敏感细胞株HL-60和多药耐药细胞株HL-60／ADR的分布和积聚变化

目的 了解化疗药物阿霉素(ADR)在人白血病敏感细胞株HL-60和多药耐药细胞株HL-60／ADR细胞内的分布和积聚变化及其与耐药的关系。方法 应用共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞术研究ADR在细胞内的分布和积聚，以及维拉帕米、BSO、布雷菲尔得菌素、氯喹对细胞内ADR异常分布的影响。以3种特异染色线粒体、高尔基体和溶酶体的荧光物质Rhodaminel23、NBD-ceramide和中性红作为探针，鉴定分隔储留ADR的细胞器。结果 与ADR在HL-60细胞核、胞浆均匀分布不同，在HL60／ADR，ADR呈点棘状分布于细胞浆，核内ADR荧光很少。这种分布方式与NBD-ceramide荧光在该细胞的分布极为相似。BSO和布雷菲尔得菌素可逆转ADR在HL-60／ADR的异常分布和积聚，而维拉帕米和氯喹无此作用。结论 ADR在耐药细胞的异常分布和积聚与肿瘤细胞耐药的形成有关。     

抗凝血酶基因T98I和A404T突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究

目的研究抗凝血酶（AT）基因T98I和A404T突变致AT缺陷症的分子机制。方法构建AT野生型和突变体表达质粒（ATwt、ATT98I、ATA404T）并瞬时转染至COS-7细胞或CHO细胞,进行体外表达试验、脉冲-追踪试验和细胞免疫荧光染色;用荧光实时PCR（RT—PCR）检测转染细胞ATmRNA表达量的改变;蛋白降解抑制实验检测突变蛋白在细胞内的降解途径。结果ATT98I未从转染细胞内分泌且在细胞内逐渐降解,ATA404T仅部分从细胞内分泌、大部分未分泌并在细胞内逐渐降解。RT—PCR显示,与野生型ATmRNA相比,突变体ATmRNA不降低。脉冲-追踪试验发现,这两种AT突变体分泌障碍,未在细胞内聚集而是降解。蛋白降解抑制实验显示,突变体ATT98I通过蛋白体酶途径进行细胞内降解。转染细胞荧光染色显示,转染ATT98I质粒的CHO细胞内荧光强度明显减弱、无明显核周聚集,而转染ATA404T质粒的CHO细胞内荧光减弱且弥散分布于胞质、核周有轻度聚集。结论分泌障碍和细胞内降解是AT基因T98I和A404T突变导致AT缺陷症的分子病理机制。     

人fgl2凝血酶原酶基因的真核表达及其凝血功能研究

目的将人fgl2凝血酶原酶基因进行真核表达,了解表达蛋白的分布特点,初步研究其凝血活性。方法将pcDNA3-fgl2重组质粒转化大肠埃希菌,利用脂质体转染至HL-60细胞;RT-PCR法检测其fgl2凝血酶原酶mRNA的表达,间接免疫荧光法标记fgl2凝血酶原酶蛋白,应用激光共聚焦显微镜观察其分布,流式细胞仪检测fgl2凝血酶原酶蛋白在细胞膜的表达;并通过检测转染细胞的促凝活性(PCA)分析其凝血功能。结果 pcDNA3-fgl2真核表达质粒在HL-60细胞中进行了瞬时表达,转染细胞可见明显的fgl2凝血酶原酶mRNA条带。激光共聚焦显微镜观察到转染细胞胞质中可见明显的绿色荧光,流式细胞仪在转染细胞胞膜上未检测到明显的蛋白表达。转染pcDNA3-fgl2重组质粒细胞的PCA明显增高且依赖于凝血酶原。结论成功地将fgl2凝血酶原酶基因在HL-60细胞中进行了瞬时表达;fgl2凝血酶原酶主要在胞质中表达,细胞膜上无分布并可能分泌到细胞外;凝血功能分析显示fgl2凝血酶原酶具有直接激活凝血酶原的功能。     

罗格列酮经PPARγ受体介导HL-60细胞成熟分化

目的：研究人过氧化物酶体增殖物激活受体1（PPARγ）在白血病HL-60细胞分化中的作用．方法：采用Li—pofectamine2000脂质体进行HL-60细胞质粒转染．实验分单纯HL-60细胞培养组,空载体pIRES2-EGFP转染组,10μmol／L罗格列酮干预组和10μmol／L罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染组．荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白（GFP）表达．流式细胞仪检测转染效率,并对转染细胞成熟粒．单细胞特异性标志CD11b和CD14的表达进行分析．结果：转染的HL-60细胞可见绿色荧光表达,phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染效率为55％．流式细胞仪检测结果表明,罗格列酮干预组和罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染组的CD11b＋和CD14＋细胞检出率均显著高于未转染细胞组与空载体转染组（P〈0．05）,且罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染具有协同效应;而未转染细胞组与空载体转染组2种表型细胞百分率差异均无统计学意义（P〉0．05）．结论：罗格列酮可通过激活PPARγ促进HL-60细胞向粒-单细胞成熟分化,有望成为治疗白血病的候选药物．     

死亡相关蛋白激酶对人白血病HL-60细胞凋亡及生存素基因表达的影响

目的：探讨死亡相关蛋白激酶（DAPK）对人白血病HL-60细胞凋亡及生存素（Survivin）基因表达的影响。方法：利用真核表达载体pReceiver-M29-DAPK,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染HL-60细胞,荧光染色法观察细胞凋亡;RT-PCR方法检测SurvivinmRNA表达水平的变化。结果：pReceiver-M29-DAPK转染组的凋亡细胞比例高于pReceiver-M29组和空白组。pReceiver-M29-DAPK转染组Survivin mRNA表达水平低于pReceiver-M29组和空白组。结论：pReceiver-M29-DAPK转染诱导HL-60细胞发生凋亡,生存素基因表达显著下调。     

HOXB1基因转染对HL-60细胞视黄酸代谢和α-干扰素表达的影响

目的探讨同源盒基因B1(HOXB1)转染对HL-60细胞视黄酸代谢和α-干扰素表达的影响.方法采用脂质体介导的质粒转染、RT-PCR及高效液相色谱(HPLC)分析等方法进行分析检测.结果 2.5×10-7 mol/L全反式视黄酸(ATRA)能抑制HOXB1转染及非转染HL-60细胞的增殖,HOXB1的高表达能明显减弱ATRA对HL-60细胞的增殖抑制作用;HPLC分析显示,转染细胞ATRA的代谢减慢;ATRA处理能诱导HOXB1转染及未转染HL-60细胞IFNα表达,加用外源性IFNα能上调ATRA处理HL-60细胞IFNα基因表达.结论 HOXB1转染使HL-60细胞ATRA代谢受抑,ATRA增殖抑制作用减弱,外源性IFNα能上调HL-60细胞IFNα表达.