LETM1基因真核表达载体的构建

[目的]构建线粒体LETM1基因真核表达载体．[方法]从肾癌细胞株293T细胞中提取mRNA及合成cDNA,设计并合成线粒体LETM1基因引物,用PCR方法扩增LETM1基因,连接到真核表达载体pCMV-3Tag-6上,构建重组质粒pCMV-3Tag—LETM1,经酶切和测定序列进行鉴定．[结果]构建了重组质粒pCMV-3Tag—LETM1．[结论]成功地构建了线粒体LETM1真核表达载体．     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

先天性长QT综合征KCNQ1基因真核表达载体的构建及表达

目的　在原核表达载体pSP6 4 KCNQ1的基础上 ,构建KCNQ1的真核表达载体。方法　先将pSP6 4 KC NQ1通过限制性酶切得到KCNQ1cDNA ,将后者克隆入 pEGFP N1中 ,构建中间过渡载体 pEGFP KCNQ1;将pEGFP KCNQ1和 pIRES EGFP分别用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切 ,把KCNQ1cDNA克隆到 pIRES EGFP ,即构建了pIRES EGFP KCNQ1。然后利用Effectene转染试剂介导将pIRES EGFP KCNQ1转染HEK2 93细胞。 结果　在原核表达载体 pSP6 4 KCNQ1的基础上 ,获得了KCNQ1的真核表达载体 pIRES EGFP KCNQ1,并使其在HEK 2 93细胞中成功表达。结论　该法可成功构建、表达KCNQ1的真核表达载体 ,为进一步的功能研究奠定了基础。     

lefty1基因真核表达载体构建鉴定及转染

目的:构建lefty1基因与pcDNA3.1(+)相融合的真核表达载体,并在lefty1基因的下游加上Flag标签,转染人肾小管上皮细胞株验证重组质粒活性。方法:设计并合成lefty1基因上下游引物,同时加上Flag标签序列,PCR扩增基因,并将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,双酶切图谱分析和扩增产物测序鉴定所构建的真核表达载体。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag和pcDNA3.1(+)分别转染至人肾小管上皮细胞株HK-2,qPCR和Western blot检测lefty1在mRNA和蛋白水平的表达。结果:以lefty1基因质粒模板扩增得到的片段约1 150bp,双酶切得到目的基因片段,测序的结果显示与lefty1基因序列相同。转染肾小管上皮细胞后,pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag能表达lefty1蛋白。结论:成功构建lefty1基因真核表达载体,为一步研究lefty1基因功能奠定了基础。     

MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达。方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌（HCC）组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建pcDNA3．1-MAGE-1重组质粒．重组质耗用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达。结果RT-PCR获得长度为927bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3．1（＋）真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确,并存转化细胞中检测到了MAGE-1的表达。结论 真核表达质粒pcDNA3．1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株。     

EB病毒包膜糖蛋白gp85真核表达载体的构建

Epstein-Barr病毒（EBv）属疱疹病毒r亚科嗜淋巴细胞病毒属的DNA病毒。该病毒感染与我国南方的鼻咽癌关系密切，是重要的肿瘤相关病毒。EB病毒穿入B细胞需要3种糖蛋白复合物gp85-gp25-gp42的参与，穿入上皮细胞需要gP85-gp25复合物的参与，gps5缺陷的EB病毒不能穿入B淋巴细胞或粘附上皮细胞。gp85在病毒的吸附和穿入靶细胞中起重要作用。是抗EB病毒感染的重要靶抗原，因此克隆并表达EBV的膜蛋白抗原片段gp85。对研究EBV的某些生物学特性有着重大作用。本文把EBV膜糖蛋白抗原性较强的gp85膜外区的编码基因BXLFR，克隆至pPIC9K质粒。构建毕赤酵母表达系统的重组质粒。     

SDF-1α基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建SDF-1α真核表达载体，为研究SDF-1α基因功能提供工具。方法：从大鼠平滑肌细胞中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增SDF-1α的基因编码区序列，将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3．1上，并用PCR、酶切法和DNA测序鉴定。结果：PCR和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pcDNA3．1／SDF-1α。通过对SDF-1α基因编码区cDNA序列测序证实其与GenBank中的已知序列一致。结论：成功构建了SDF-1α真核表达载体，为SDF-1α基因功能研究奠定基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达的载体构建及鉴定

目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物,以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列;将X基因连接到真核表达载体pCDNA3.1上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

uPA基因真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因真核表达载体,并转染人肝癌细胞,为进一步体外研究uPA在肝癌发生发展中的作用奠定基础.方法:从肝癌组织中提取RNA,通过RT-PCR的方式,获得基因uPA的全长cDNA,并克隆于含有HA2-标签(tag)的真核表达载体pCMV上,酶切鉴定,质粒测序鉴定,用pCMV-uPA-HA2进行细胞瞬时转染及WesternBlotting鉴定.结果:经过测序证实得到获得包含uPA基因的pCMV-HA2真核表达载体,瞬时转染细胞有蛋白表达.结论:克隆了人肝癌的uPA基因,成功构建真核表达载体.     

三叶因子2基因真核表达载体的构建

目的：构建TFF2-pcDNA3．1真核表达载体．方法：应用体外基因拼装方法合成TFF2,然后TA克隆于pGM—T easy载体中．阳性克隆经测序鉴定．再经双酶切消化后,插入真核表达载体pcDNA3．1上,经酶切鉴定与测序证实．结果：合成的TFF2经TA克隆后,筛选得到的阳性克隆,经测序鉴定,与设计的TFF、2基因序列完全一致．经酶切连接并成功插入pcDNA3．1上．结论：成功构建了TFF2基因的真核表达载体,为以后的胃溃疡研究奠定了基础．     

PS1基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建PS1基因真核表达载体,为PS1基因功能研究提供工具.方法 从C57BL/6小鼠不同胚胎中提取总RNA,采用反转录-聚合酶链反应扩增PS1基因编码区,将其克隆入pMD18-T载体中.通过聚合酶链反应,酶切和DNA测序鉴定.结果 PS1在9日龄小鼠胚胎的cDNA中高表达.测序显示融合基因GFP-PS1和PS1-...     

HO-1基因真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1的构建及表达

目的:构建人HO-1真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1并检测其表达。方法:利用分子生物学技术,将hHO-1基因与质粒pcDNA3.1连接,构成重组质粒并用RT-PCR及Western blotting方法检测重组载体在Eca-9706细胞中的表达情况,最终确定重组载体是否构建成功。结果:用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,RT-PCR检测,Western blotting检测证明hHO-1成功克隆入表达载体pcDNA3.1中。结论:本部分实验成功构建了能够在细胞内大量表达HO-1基因产物的真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1,为进一步实验奠定基础。     

新城疫病毒NP蛋白的真核表达载体的构建

目的 研究新城疫病毒核衣壳蛋白基因的生物学作用及其抗人喉鳞癌的作用。方法 利用含有新城疫病毒Ｖ４株核衣壳蛋白基因ｃＤＮＡ的原核质粒ｐＵＶＮＰ４及真核质料ｐｃＮＤＡ３,采用基因重组技术构建了含有ＣＭＶ含动子、ＢＧＨｐｏｌｙＡ信号序列的表达新城疫病毒核衣壳蛋白的真核表达质粒。结果 酶切分析表明重组质粒中含有新城疫病毒Ｖ４株核衣壳蛋白基因。结论 重组质粒为表达新城疫病毒核衣壳蛋白基因的真核质粒。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。     

干扰素β1a基因真核表达质粒的构建和表达

目的：构建干扰素β1a(IFN-β1a)的CHO表达体系，探讨人IFN-β1a在真核细胞中的表达效果。方法：采用全基因合成法获取重组人IFN-β1a基因，并通过点突变将IFN-β1a的17位半胱氨酸进行修饰，合成的基因经PCR扩增，连接入 pSV2-dhfr 质粒中，构建重组真核表达质粒 pSV2-dhfr-IFN-β1a。将质粒转染至 CHO-dhfr－细胞中，经 MTX 加压筛选，获得稳定生长的能够持续表达IFN-β1a的单克隆细胞株；提取细胞基因组DNA，进行PCR 鉴定。收集细胞培养上清液，采用 Wish 细胞病变抑制法检测转染细胞中 IFN-β1a的抗病毒活性。结果：重组真核表达质粒 pSV2-dhfr -IFN-β1a 经 PCR 及双酶切鉴定证明构建正确；以转染细胞基因组 DNA 为模板，可扩增出 IFN-β1a 基因；转染后重组细胞表达的 IFN-β1a具有抗病毒活性，达到3×105 IU·mL^－1。结论：IFN-β1a基因真核表达质粒构建成功，并在 CHO 细胞中成功表达了具有较高生物学活性的 IFN-β1a 蛋白。     

SPRR1A基因真核荧光表达载体的构建

目的:构建可在真核细胞中表达SPRR1A(small proline-rich repeat protein1A)的荧光表达载体。方法:应用PCR技术扩增出编码SPRR1A的全长基因,将SPRR1A DNA克隆到pEGFP-N1质粒,通过抗性基因筛选阳性克隆,经酶切和测序鉴定。结果:酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank提供的序列(L05187)一致。结论:成功构建了SPRR1A真核荧光表达载体。     

大鼠野生型Egr-1基因及Egr-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型早期生长应答基因-1(early growth responsegene-1,Egr-1)及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察Egr-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默Egr-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠Egr-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3对shRNA序列分别克隆到真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his-A和pGCsi.U6.neo.GFP中。经酶切分析及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染至大鼠GMC中,随后进行Western blot检测Egr-1蛋白的表达及筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性内切酶酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建正确。Westernblot分析表明,构建的pcDNA3.1/Egr-1质粒在大鼠GMC中能够表达;Egr-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:成功构建了大鼠野生型Egr-1基因和其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究Egr-1基因的生物学功能提供了必要的实验工具。