人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。     

大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选

目的构建大容量人源Fab噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,插入噬菌体载体pCANTAB5H中,构建人源Fab噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,随机挑取96个单克隆进行phage-ELISA鉴定,筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为5×1010的噬菌体抗体库,从中筛选到11株阳性克隆,对其进行测序鉴定,表明该11株克隆的序列均一致,ELISA证实其对抗原CD276具有较强的结合性。结论构建了大容量人源Fab抗体库,从中获得具有抗CD276的人源Fab抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。     

胰淀素Fab抗体的筛选及初步鉴定

目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性.方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,提取其质粒、切除gⅢ、自身环化并转入大肠杆菌中,以IPTG诱导表达可溶性抗体,最后用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定抗原结合活性和特异性.结果:成功筛选并表达了抗胰淀素的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE蛋白电泳,在相对分子质量约为47 kD处可见一蛋白条带.ELISA和Western blot证实了该Fab片段与胰淀素抗原的结合活性和特异性.结论:利用噬菌体抗体库技术获得了人源性的特异抗胰淀素Fab抗体,为临床进行下一步研究奠定了基础.     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

抗人巨细胞病毒中和性人源基因工程抗体的研究

目的 研究抗人巨细胞病毒(HCMV)人源基因工程抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术。首先从HCMV感染者外周血中分离淋巴细胞，提取RNA，逆转录后用特异性引物扩增轻、重链基因。然后插入噬菌体载体pComb3，构建噬菌体抗体库。使用纯化的HCMV病毒裂解物对噬菌体抗体库进行4轮富集，然后通过ELISA筛选阳性克隆，并对获得的克隆进行功能鉴定。结果 克隆和表达了3株抗HCMV人源Fab抗体，经ELISA证明均具有抗原结合活性，间接免疫荧光试验证明具有较高的特异性，最后通过病毒中和试验证明其中2株具有中和活性。结论 获得2株抗HCMV人源Fab抗体，具有一定的中和活性，为下一步研究抗HCMV人源全抗体奠定了基础。     

人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定

目的 用重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体(scFv).方法 用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果 从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论 通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.     

人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

目的选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞为材料,构建人噬菌体抗体库,并从中筛选抗bFGF抗体克隆。方法收集自身免疫病患者外周血,提取淋巴细胞总RNA后逆转录得到cDNA第一链,经PCR扩增重链Fd段和轻链基因,分别构建到噬菌粒载体pComb3中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL1Blue,以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人噬菌体抗体库。经过3轮固相筛选,获得能结合bFGF的抗体克隆,并用ELISA进行进一步鉴定及筛选,获得具有高亲和力的抗bFGF噬菌体抗体克隆。结果构建的人源噬菌体抗体库库容为2.5×107,经3轮筛选获得具有bFGF特异性的Fab噬菌体抗体克隆。结论构建了人噬菌体Fab抗体库,并能够从中筛选出与bFGF特异结合的抗体克隆,为bFGF抗体药物研究奠定基础。     

利用噬菌体抗体库制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ抗体

目的： 制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ（β2GPI）抗体Fab片段。方法: 以人β2GPI为抗原,从人源性天然抗体库中筛选特异性Fab抗体,并用ELISA方法对所获抗体进行抗原结合活性和特异性鉴定。结果: 通过4轮“亲和吸附-洗脱-扩增”筛选,获得2株抗β2GPI抗体。酶切去掉载体上的噬菌体基因III,得到了可溶性表达的Fab段。经过鉴定,所获抗体具有良好的抗原结合活性和特异性。结论: 利用人源性天然抗体库成功制备了2株抗β2GPI Fab抗体,为深入研究该抗体在抗磷脂抗体综合征发病机理中的作用和探讨新的治疗措施奠定了基础。     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

抗恶性疟SERA噬菌体抗体库的构建及单链抗体的筛选与鉴定

目的 研制用于疟疾简便,快速诊断试剂盒的试剂。方法 利用噬菌体抗体库技术,构建抗恶性疟原虫丝氨酸重复抗原（SERA）的噬菌体抗体库。经3轮“吸附－洗脱－扩增”的富集反应后,从中筛选抗SERA的阳性克隆株,并进行可溶性诱导表达,最后用ELISA和Western blot等进行鉴定。结果 成功地构建了中等库容的噬菌体抗体库,并从中筛选到9株抗SERA的阳性克隆株,表达的单链抗体的相对分子质量大小约为31kDa,能与SE47‘抗原起特异性结合反应。结论 成功地构建了抗SE47‘的噬菌体抗体库,从中筛选制备的单链抗体为研制疟疾快速诊断试剂盒奠定了基础。     

从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：以表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体,对其抗原结合活性的序列进行分析鉴定。结果;经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗角蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判断所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

以鼠源重链Fd片段为模板导向筛选人源性抗γ-精浆蛋白抗体轻链

目的:以鼠源抗γ-sm抗体重链Fd片段为模板,筛选人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链。方法:利用RT-PCR从前列腺癌患者外周血淋巴细胞扩增出全套的人抗体轻链基因,克隆入含鼠源性抗γ-sm抗体重链Fd片段的噬粒载体pComb3X/mFd中,电转化大肠杆菌XL1-Blue后建立人-鼠杂合的Fab抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切和随机测序,对所建杂合库的库容、重组率和多样性分别进行鉴定,以M13K07辅助噬菌体超感染,利用亲和纯化的γ-sm为抗原,对挽救展示的噬菌体抗体库进行3轮淘筛和克隆鉴定。最后对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测。结果:构建成功1.2×107CFU、重组率为90%、多样性好的杂合人-鼠噬菌体抗体库。利用纯化的γ-sm3轮亲和淘筛后,5个克隆成功诱导表达特异性的pIII融合抗体。ELISA进一步检测表明,5个克隆均呈特异性阳性反应,其中2个克隆亲和力较高,测序显示其所含轻链基因序列完全相同,可变区来源于IGKV4-101胚系基因家族。结论:利用鼠源Fd片段为模板,导向筛选杂合噬菌体库,成功筛选到人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链。     

人源性抗HBsAg抗体Fab段噬菌体呈现文库的构建、筛选及阳性克隆核苷酸序列测定

目的:构建一个经HBsAg主动免疫的人lgG1抗体噬菌体展示文库,通过特异的淘筛(panning)获得与HBsAg有较高亲和力的Fab抗体,并测定其编码序列。方法:从一经乙肝疫苗免疫的自愿者的外周血分离淋巴细胞提取RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增重链Fd和κ轻链cDNA。依次将PCR产物克隆进载体pComb3H相应的位点,构建成噬菌体呈现库,并以HBsAg包被的96孔板对抗体库进行3轮淘筛,将所获克隆分别与HBsAg进行ELISA反应,挑取显色大于对照20倍以上的阳性克隆进行DNA测序。结果:lgG1的Fd段和κ轻链cDNA得到扩增,构建了一实际库容量为1.8×10⁵的噬菌体呈现文库。通过特异性淘筛,获得与HBsAg有较高新合力的3株Fab抗体并测定其编码序列。DNA序列测定结果表明,3株抗体中两株的Fd段完全一样,且3株的轻链完全一样。结论:成功构建了一个经HBsAg抗原免疫的人源抗体Fab段噬菌体抗体库,筛选得到了3株特异性抗体的Fab片段。     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。     

人源性抗乳腺癌单链抗体库的筛选与初步鉴定

目的:本研究旨在已构建的大容量人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的基础上,筛选出高亲和力的特异性单链抗体(scFv)并对抗体基本特性进行初步鉴定。方法:以人乳腺癌细胞系MCF-7为靶标,经过4轮淘洗,筛选出高亲和力的特异性抗乳腺癌scFv,并对其结构序列进行分析;通过ELISA和Western blot方法,鉴定scFv的亲和力和特异性,以及其蛋白的基本表达情况。结果:成功构建具有高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库,获得scFv的长度约为750 bp,ELISA证实所得抗体对乳腺癌细胞具有良好的亲和力和高度的特异性,IPTG诱导表达及Western blot结果显示,scFv为相对分子质量(Mr)30 000的可溶性蛋白。结论:本研究在已构建的大容量抗乳腺癌单链抗体库的基础上,筛选获得了高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库。研究结果为进一步获得可应用于临床诊断和治疗的乳腺癌靶向性抗体奠定了良好的基础。     

Isolation and characterization of human neutralizing antibodies to rabies virus derived from a recombinant immune antibody library

A human immune Fab library was constructed using RNAs from peripheral blood lymphocytes obtained from rabies virus hyperimmune volunteers on phagemid vector. The size of the constructed Fab library was 2 × 10⁷ Escherichia coli transformants. After four rounds of panning on whole inactivated rabies virus (PV-11), phage clones displaying rabies virus-specific human Fab were selected. The specificity of soluble Fab antibody fragments, derived from positive phage clones was verified by ELISA. Among 20 specific Fab clones, the genetic sequence of 6 of them (FabRV01, FabRV02, FabRV03, FabRV04, FabRV05, and FabRV06) was analyzed. The variable heavy (VH) and variable light (VL) domains were found to share 90% and 93% homology with sequences encoded by the corresponding human germline genes, respectively. The soluble Fab fragments, expressed in Escherichia coli were purified by a single step Nickel-NTA affinity chromatography via a hexa-histidine tag and their binding specificities to rabies virus were confirmed. Three of the Fab antibodies, FabRV01, FabRV02 and FabRV03, showed binding characteristics to rabies virus glycoprotein antigenic site III with affinities in the K_D range 7 × 10⁻⁹ to 5 × 10⁻⁸ M. The Fab fragments showed dose-dependent neutralization properties for the challenge virus standard (CVS-11).     

从噬菌体抗体库筛选人源性抗白细胞介素8抗体

目的: 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗IL- 8单链抗体(scFV)。方法: 采用原核表达载体pRSET- IL- 8在大肠杆菌BL21(DE3)中表达IL- 8 His融合蛋白, 并通过亲和层析纯化。以该融合蛋白为固相抗原, 对噬菌体抗体库进行 3轮淘筛, 并对所获阳性克隆进行抗原结合活性测定和DNA序列测定。结果: 获得 2株特异性抗IL- 8噬菌体抗体。对其DNA序列测定结果表明, 其VH基因均属于人IgGVH3亚群, Vλ基因分别属于人VλDPL5和VλDPL2亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术可不经免疫制备人源性抗IL- 8抗体, 为银屑病及相关疾病的临床应用提供了条件。     

人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选

用聚合酶链伸反应从人外周血淋巴细胞克隆出Ｆｄ段和ｋ链基因，重组到表达载体ｐＣＯＭＢ３中，构建了人源性噬菌体抗体，将乙肝病毒表面抗原固相化对噬菌体抗体库进行了三轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，使特异性噬菌体抗体得到了富集，筛选到了抗ＨＢｓＡｇ的人单抗。