人补体受体1型衍生分子融合基因CR1-SCR2D的构建、表达及生物学活性鉴定

目的构建和表达具有抑制补体生物活性的双功能域人补体受体1型衍生分子CR1-SCR2D。方法基于我室前期工作,将CR1-SCR1-3、人工α螺旋肽段linker、SCR15-17 3个DNA片段依次克隆到改造载体pPIC9k(+)和pPICZαB,构建出表达质粒pPICZαB-CR1-SCR2D;电转化毕赤酵母X-33得到阳性重组子,甲醇诱导目的蛋白CR1-SCR2D表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果;经纯化获得CR1-SCR2D并进行糖基化鉴定后,用CH50和AH50法鉴定目的蛋白在体外抑制补体的生物活性。结果成功构建了目的基因的表达质粒pPICZαB-CR1-SCR2D,基因测序正确;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;经镍柱纯化后得到较纯的CR1-SCR2D,糖基化鉴定证明其存在糖基化;CH50法和AH50法结果显示CR1-SCR2D均有较CR1-SCR1-3和CR1-SCR15-17更好的抑制补体生物学活性。结论成功构建了双功能域人补体受体1型衍生分子融合基因CR1-SCR2D,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR2D的分泌表达,该融合蛋白对经典/MBL途径及旁路途径补体激活均具有较好的抑制作用。     

双功能域小分子补体受体1型衍生物的构建、表达、纯化及生物功能鉴定

目的 克隆表达出能够抑制补体活化的双功能域小分子补体受体1型(complementreceptor type 1,CR1)衍生物.方法 从外周血提取总RNA,进行RT-PCR扩增出功能性片段Ⅰ(CR1-SCR1-3);以本室构建的pET-32a-CR1-SCR15-18为模板扩增功能性片段Ⅱ(CR1-SCR15-17);利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法扩增出包含双功能域的融合基因.将融合基因重组于pET-32a(+)载体,转化大肠杆菌Rosetta,经酶切及DNA序列测定鉴定后,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白质进行分析鉴定.蛋白质经Ni柱亲和层析及透析复性后,采用50%补体溶血抑制试验(CH50)进行功能鉴定.结果 酶切及DNA序列测定证实成功构建出了pET-32a-CR1-SCR(1-3+15-17)重组表达载体,IPTG诱导表达后在相对分子质量(Mr)为63×103处有一明显的条带,经Westernblot鉴定为目的 蛋白,Ni柱亲和层析获得纯度约为92%的目的 蛋白,功能试验证实,在0～200 μg/ml的融合蛋白剂量范围内,随着浓度的增加,补体抑制活性增强.结论 成功构建并在大肠杆菌内表达了具有较高生物活性的重组双功能域小分子CR1衍生物,为体内保护实验研究提供实验数据.     

重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性

目的:采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPICgk中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9ksCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定,通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果:获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCRI,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr,约31 1300的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.     

人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中高拷贝表达

目的 构建高拷贝表达重组人组织因子途径抑制因子的毕赤酵母并对蛋白表达条件进行初步优化,为相关研究奠定基础.方法 将PCR扩增得到的TFPI cDNA片段与表达质粒pPIC9K连接构建重组质粒rhTFPI-pPIC9K,采用PCR方法及DNA测序对其进行鉴定.将重组质粒转化酵母细胞GS115,利用G418抗性实验筛选含有...     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。     

融合基因EGFRi-IL-24真核表达载体的构建与表达

人工合成表皮生长因子受体干扰序列(epithelial growth factor receptor interference,EGFRi),应用重叠延伸PCR(Overlapping PCR)技术将其与白细胞介素-24(IL-24)连接,并在其间引入一段柔软短肽(Gly4Ser3)。进行序列分析后,将融合基因EGFRi-IL-24重组到表达质粒pPIC9k中,Sal I酶切线性化重组质粒EGFRi-IL-24/pPIC9k,电击转化毕赤酵母GS115,经G418抗性和PCR筛选得到阳性重组菌株。重组菌株用甲醇进行诱导表达后,通过SDS-PAGE和MTT法分析鉴定蛋白表达产物。结果证实EGFRi-IL-24在毕赤酵母中获得了分泌性表达的活性蛋白,为进一步研究其生物学功能及临床应用奠定了基础。     

抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析

目的：构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体（scFv）基因的酵母表达载体，实现目的蛋白的分泌性表达，并检测其生物活性。方法：采用基因工程和重组DNA技术，从质粒pET28．scFv中切下目的基因片段，定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点，构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv。Bgl Ⅱ线性化后，电转化入受体酵母菌GS115中，筛选阳性重组子，进行甲醇诱导表达，并用RT-PCR、SDS—PAGE、双抗体夹心Dot—ELISA法分析目的蛋白表达情况。结果：通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌，RT—PCR、SDS—PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达，表达量可占培养液上清总蛋白量的18％，双抗体夹心Dot-ELISA法检测，表达产物能够特异识别重组HIV-1 gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应。证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性。结论：成功地实现了scFv基因的分泌性表达，为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据。     

人免疫缺陷病毒Ⅱ型(HIV-2)gag蛋白基因在毕赤酵母中的克隆表达

目的：实现HIV-2HCOgag重组蛋白的分泌表达，为研究HIV—2HCO gag蛋白结构与功能及亚单位蛋白疫苗研究打下基础。方法：将HIV-2HCOgag蛋白基因片段，与分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9重组，构建了相应的重组表达质粒pPIC9-gag，转化GS115酵母菌，经MD／MM表型筛选、PCR扩增筛选阳性克隆，以甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE分析及Wgtem blot证实。结果：获得了HIV—2HCOgag重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中的分泌表达，表达产物可被HIV—2抗血清识别，分子量约为57kD。结论：pPIC9—gag重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生HIV—2HCOgag蛋白，该蛋白具有强免疫学活性。     

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达

目的:研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichia pastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法:采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,0.5%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA法对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12 800。结论:成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。     

重组嵌合抗人CD22四价基因工程抗体在毕赤酵母中的表达及活性检测

目的:采用酵母多拷贝分泌表达载体pPIC9K表达重组嵌合抗人CD22四价基因工程抗体cRFB4FC和cRFB4CH3,并进行活性检测。方法:采用基因克隆技术获得两抗体的基因,然后将其克隆入表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K/cRFB4FC和pPIC9K/cRFB4CH3,经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母SMD1163中,将经G418抗性筛选出的重组酵母菌株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,经ELISA检测生物学活性。采用正交试验优化重组酵母菌株的表达条件以提高抗体的表达量。结果:获得重组表达质粒pPIC9K/cRFB4FC和pPIC9K/cRFB4CH3,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株,经甲醇诱导表达出cRFB4FC和cRFB4CH3蛋白。它们在SDS-PAGE上分别表现为相对分子质量(Mr)约326 000和295 000的蛋白区带,在Western blot分析中均可被山羊抗人IgG Fc单克隆抗体(mAb)识别,经ELISA分析它们都具有较高的生物学活性。优化表达条件后,抗体的表达量分别提高了196.4%和151.7%。结论:抗体cRFB4FC和cRFB4CH3在酵母菌SMD1163中成功获得高效分泌表达,并有免疫学活性。     

人源性抗角蛋白单链抗体在巴氏毕赤酵母的分泌表达

目的：用巴氏毕赤酵母表达人源性抗角蛋白单链抗体。方法：从已构建好的质粒p3MH／ScFv中亚克隆目的片段ScFv并插入酵母表达载体p^PIC9K，构建成重组质粒p^PIC9K／ScFv，并测序鉴定。通过电转将重组质粒p^PIC9K／ScFv整合到巴氏毕赤酵母菌GS115的染色体上。经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后，用含0．5％甲醇的培养基诱导其分泌表达。结果：通过6天的诱导，该系统成功表达了抗角蛋白单链抗体，Western blot实验证实表达产物具有特异性。结论：获得了真核表达的抗角蛋白单链抗体，为其应用研究打下了基础。     

中国株HIV-1结构蛋白基因gag与gp120在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

目的：将中国流行株B亚型HIV－1结构蛋白基因gag和gp120的巴斯德毕赤酵母中进行融合表达。方法：以酵母分泌型表达质粒pPIC9为载体，构建含HIV－1 gag和gp120嵌合基因的重组酵母表达质粒pPICGP。用Sac I将pPICGP线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母GS115，用PCR的方法鉴定阳性酵母转化子。阳性转化子在巴斯德毕赤酵母中用甲醇进行诱导表达，表达产物以SDS－PAGE和Western blot进行分析，并对阳性菌株的遗传稳定性进行研究。结果：12个酵母转化子中共筛选到了8个阳性酵母转化子，其整合率为66．7％。SDS－PAGE和Western blot分析显示，在相对分子质量（Mr）为57000处有1条特异蛋白带，且能与抗p24单抗（mAb)和抗gp120mAb发生反应。酵母转化子在YPD培养基上传代10次后，其外源基因未丢失。结论：在巴斯德毕赤酵母中成功地表达了HIV－1 gag-gp120嵌合基因，且表达蛋白具有特异性，但其Mr较预计计算的值要小，说明嵌合基因中的gp120基因只有部分进行了表达。     

鹌鹑血管内皮生长因子受体Quek1胞外段第2～4 区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定

以PCR法从携带有鹌鹑血管内皮生长因子受体quek1(qVEGFR)的质粒中扩增获得qVEFR胞外段第2～4区cDNA片段,并将其定向克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,获得重组表达质粒pPICZαA-qVEGFR2.然后将用SacI酶线性化的pPICZαA-qVEGFR2质粒电转化到毕赤酵母菌GS115中,经Zeocin抗性和PCR筛选得到阳性重组菌株.重组菌株用甲醇进行诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定蛋白表达产物,结果证实qVEGFR2胞外段第2～4区cDNA在毕赤酵母中获得了分泌性表达,为进一步研究和制备肿瘤蛋白疫苗打下了基础.     

人源性抗角蛋白抗体Fab段在巴氏毕赤酵母菌中的表达及表达条件的优化

目的:用巴氏毕赤酵母表达抗角蛋白抗体Fab段并优化表达条件。方法:将抗角蛋白人Fab原核表达载体p3MH/Fab中的κ链和Fd段基因,分别亚克隆到酵母菌表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建成重组质粒pPIC9K/L和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/L和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选得到高拷贝的转化子。对Mut表型鉴定后,优化pH及甲醇浓度等表达条件。结果:优化表达条件后,成功地表达抗角蛋白Fab段抗体。Westernblot分析证实,表达产物具有良好的角蛋白结合活性和特异性。结论:人源性抗角蛋白Fab段抗体在巴氏毕赤酵母菌中获得成功表达,为其进一步的应用研究打下了基础。     

人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的:构建人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext -Fc,并在毕赤酵母GS115中表达.方法:以pEF-BOSneo-hdll1ext-Fc为模板PCR扩增人Delta-like1胞外段.通过DNA重组构建毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext.-Fc.用MD平板筛选重组子,G418筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE、Western blot分析表达蛋白.结果:hDll1基因的胞外段被有效地扩增.序列分析表明,所构建的含hDll1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,融合蛋白hDll1extFc得到正确表达.结论:成功地扩增了人Delta-likel胞外段,构建了hDll1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体PIC-hDll1extFc,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究奠定了实验基础.     

人sCR1转化克隆菌的快速筛选和鉴定

目的 用G418快速筛选及鉴定重组人可溶性补体受体1型（sCR1）高拷贝转化克隆菌。方法 采用的sCR1重组质粒，经电转化将其克隆入SMD1168细胞中，利用G418的抗性，快速筛选转化克隆菌，并对克隆菌株提取基因组DNA进行聚合酶链反应（PCR）鉴定；该克隆菌经甲醇诱导培养后，对其表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western blot鉴定分析。结果 从G418快速筛选的酵母克隆菌株中提取的基因组DNA进行PCR鉴定，获得了高拷贝整合的重组酵母克隆菌株，经诱导培养后，对其表达产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定分析，该表达蛋白在SDS-PAGE上表现为相对分子质量大于30 000的蛋白区带，在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体（mAb）识别，成功获得高拷贝整合的重组酵母细胞株，可表达出重组人sCR1融合蛋白。结论 经高浓度G418药物快速筛选的高拷贝SMD1168细胞株，用于表达人sCR1融合蛋白。     

人血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和鉴定

目的 研究人血管内皮生长因子（ｈＶＥＧＦ１６５）基因在Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的重组ＶＥＧＦ１６５。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５,转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,１％甲醇诱导表达。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,诱导４ｄ的培养上清中ｈＶＥＧＦ１６５表达量达上清总蛋白的３０％以上。ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有刺激ＨＵＶＥＣ增殖的功能。结论 在Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中实现了ｈＶＥ