嗜热吸水链霉菌抗原诱导大棚肺动物模型

目的探讨嗜热吸水链霉菌抗原对豚鼠是否能引起大棚肺及制作大棚肺动物模型的方法。方法成年豚鼠32只,体重300~400 g,雌雄各半。随机分为模型组A、B、C组,对照组D组,每组8只。模型组予嗜热吸水链霉菌抗原制剂1.5 mg（0.3 ml）、对照组予0.9%无菌生理盐水0.3 ml鼻内滴注,每周连续滴注3天。A组滴注1周,B组连续滴注3周,C、D组连续滴注12周。结果 1.病理改变：A组出现肺泡炎改变;B组可见非坏死性肉芽肿形成;C组可观察到肺成纤维细胞数目增多。2.影像学改变：A组可见双肺大片磨玻璃样改变;B组可见双肺多发性片状略高密度影;C组可见肺内小结节影及肺气肿征象。3.肺组织研磨培养后A、B、C组均可见嗜热吸水链球菌生长。结论嗜热吸水链霉菌抗原可以引起豚鼠典型大棚肺病变,结合病理和影像学变化证实,所建模型具有大棚肺的主要特征。     

探讨不同剂量嗜热吸水链霉菌抗原诱导大棚肺动物模型

目的探讨不同剂量嗜热吸水链霉菌抗原是否能引起豚鼠大棚肺,及制作大棚肺动物模型的方法及最适宜的嗜热吸水链霉菌抗原剂量。方法 40只成年豚鼠随机分为A、B、C、D组,每组10只。B、C、D组为模型组,分别予嗜热吸水链霉菌抗原制剂1.0 mg（0.2 ml）1、.5 mg（0.3 ml）2、.0 mg（0.4 ml）3种剂量鼻内滴注;A组为对照组,予0.9%无菌生理盐水0.3 ml鼻内滴注。每周连续滴注3 d,连续滴注12周。结果 B组于第2周末,C、D组均于第1周末出现明显肺泡炎改变;B组于第4周末、C组于第3周末、D组于第2周末可见肉芽肿形成;C组在12周末可观察到肺成纤维细胞数目增多,B组无明显纤维化改变,D组豚鼠多在第3周因肺部感染死亡。模型组CT影像上均可见弥漫性磨玻璃影,后可见双肺多发性、边缘模糊的斑片状及微小结节状影,多呈小叶中心型。模型组肺组织均可见嗜热吸水链球菌生长。结论嗜热吸水链霉菌抗原可以在豚鼠引起典型大棚肺病变。1.5 mg（0.3ml）可作为构建嗜热吸水链霉菌抗原诱导的大棚肺动物模型的标准剂量。     

白塞病相关自身抗原Kinectin的表达型cDNA文库筛选与鉴定

目的研究白塞病患者血循环中的自身抗体及其针对的细胞内靶抗原.方法应用免疫印迹-化学发光法对39例白塞病患者血清进行初步研究,以含有高滴度抗体的患者血清作为“探针”免疫筛选表达型λZAP噬菌体cDNA文库并鉴定候选克隆,通过真核转录、翻译以及免疫沉淀实验分析阳性克隆表达产物的抗原性.结果文库筛选获得6个独立候选克隆,均为人Kinectin部分全长cDNA,以其中最大克隆的基因表达产物为抗原基质的免疫沉淀研究显示,23.1%（9/39）的白塞病患者血清呈阳性反应,正常人以及系统性红斑狼疮、干燥综合征患者对照阴性.结论Kinectin是白塞病相关自身靶抗原;抗Kinectin抗体与白塞病免疫发病机制的关系值得深入探索,抗体可能对疾病具有潜在血清学诊断价值.     

吸水链霉菌应城变种种内融合子FR—008产生的新抗生素灭…

本文报道吸水链霉菌应城变种种内融合子ＦＲ－００８产生的新抗生素（简称ＦＲ－００８抗生素）对３种蚊虫幼虫的灭蚊活性以及蚊龄，温度，紫外线在ＦＲ－００８抗生素灭蚊活性的影响，实验证明，ＦＲ－００８抗生素３种蚊虫幼虫均有较强的致死作用。对３龄致倦库蚊，白纹伊蚊和中华按蚊幼虫的２４ｈＬＤ５０分别为１．３３０９μｇ／ｍｌ，２．０１１３μｇ／ｍｌ和２．８３１７μｇ／ｍｌ。不同虫龄对ＦＲ－００８抗生素的敏感性不     

伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库构建

目的　构建伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库。　方法　提取伯氏疟原虫K173株(NS)与青蒿素抗性株(AR)的总RNA ,superSMART法合成双链cDNA,分别以NS为消减方(driver),AR为试验方(tester)及AR为driver,AS为tester进行双向抑制性消减PCR(SSHPCR)。富集的差异表达cDNA克隆到pMD18T载体构建消减文库。　结果　NSAR和ARNS消减文库分别获得395个和506个阳性克隆,从NSAR和ARNS文库中随机挑取108个克隆PCR鉴定,分别有100个和104个含插入片段,大小在0.25～2kb之间。　结论　成功构建了伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库。     

广州管圆线虫成虫cDNA文库抗原基因的筛选

目的从广州管圆线虫成虫cDNA文库中筛选特异性抗原基因。方法用大鼠感染血清做免疫探针,筛选广州管圆线虫成虫cDNA文库,对筛选得到的阳性克隆作交叉反应试验,PCR扩增外源基因插入片段并测序,用在线生物信息学软件进行同源性比对,推导氨基酸序列和蛋白质结构及进行功能分析。结果获得15个阳性克隆,分属三种基因,1个属中间纤维(IF)家族基因,3个与旋盘尾丝虫和秀丽杆线虫的真皮抗原同源,11个属主要精原蛋白(MSP)家族基因。其中1种基因表达产物没有发生明显交叉反应。结论从广州管圆线虫成虫cDNA文库中初步筛选出1个潜在特异性抗原基因和1个可能的主要抗原基因。     

嗜肺军团菌htpA基因的克隆及其原核表达

目的克隆并检测嗜肺军团菌htpA基因在原核系统中表达情况,为进一步研究HtpA蛋白的免疫性能作必要的准备。方法采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得军团菌热休克蛋白A基因htpA,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGhtpA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,转化宿主菌大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了291bp完整的htpA基因,构建了原核表达重组质粒pGhtpA,并检测到约36kDa的GST-htpA融合蛋白质表达条带。结论成功克隆了嗜肺军团菌htpA基因并使HtpA蛋白在原核表达系统中得到了有效的表达,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

肝片吸虫cDNA文库构建及诊断候选抗原基因筛选北大核心CSCD

目的构建肝片吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,筛选肝片吸虫病候选诊断抗原基因。方法构建肝片吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,利用感染肝片吸虫绵羊血清对该文库进行初筛和复筛。挑取阳性噬菌斑,PCR扩增后测序,对测序结果进行生物信息学分析。结果成功构建了肝片吸虫成虫cDNA表达文库,初级文库库容约2×107pfu/800μl,插入片段长度为400bp～2 000bp,重组率约98%。共筛选和鉴定16个阳性噬菌斑,测序分析其中的2个为已报道的诊断抗原基因,4个为新发现的肝片吸虫病候选诊断抗原基因,10个为肝片吸虫未知抗原基因。结论成功构建了肝片吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,筛选获得4个肝片吸虫病候选诊断抗原基因,为肝片吸虫病早期诊断和检测试剂盒的研制奠定了基础。     

伊氏锥虫cDNA表达文库的构建

目的构建伊氏锥虫cDNA表达文库。方法利用DEAE-纤维素柱从小鼠血液中纯化伊氏锥虫,Trizol法提取总RNA,采用poly(A)Quik mRNA Isolation kit分离纯化mRNA。运用cDNA Synthesis Kit合成cDNA,以XR-λZAP为载体,构建伊氏锥虫cDNA表达文库。结果伊氏锥虫cDNA表达文库重组率为98%,滴度为0.9×106pfu/ml,扩增后滴度为1×109pfu/ml结论成功构建伊氏锥虫cDNA表达文库,为伊氏锥虫免疫相关因子的基因筛选奠定了基础。     

2 338条胎儿心脏cDNA文库的表达序列标签测序分析

目的：寻找在心脏发育过程中具有重要功能的新基因，并研究其表达模式的特点。方法：随意选择8－10周龄胎儿心脏cDNA文库的克隆进行表达序列标签（ESTs)测序，结果与GenBank/EMBL/DDBJ核酸数据库进行同源性比较，其中与已知基因匹配的1550条ESTs用来研究8－10周龄胎儿心脏基因表达特点，并将其与10－12周龄胎儿及成人心脏的基因表达模式相比较，结果：所测2338条ESTs中，69．03％与已知基因匹配，33．18％与其他ESTs或基因组DNA相似，7．57％既不匹配于已知基因，亦不与其他ESTs或基因组DNA相似，发现了心脏发育过程中基因表达的某些特点。结论：大规模随机选择cDNA克隆，并进行ESTs测序是寻找新基因和系统研究不同组织或同一组织不同发育时期基因表达模式的有力工具。     

人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的　构建人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库。方法　从人大肠癌组织中提取总RNA ,RT PCR反转录合成cDNA第 1链 ,用长距离PCR技术合成cDNA第 2链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段后与λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 ,构建成cDNA噬菌体表达文库。转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,测定重组率。用EXTagTM酶做PCR和SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小。结果　构建成含 2 .39× 10 6pfu/ml重组子的人大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 %。插入的外源cDNA片段大小为 5 0 0bp～ 4kb ,平均长约 1.4kb。 结论　成功构建高质量人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,适合于免疫筛选cDNA克隆的人大肠癌相关抗原基因。     

用SEREX方法筛选HCC抗原及hcct-19表达谱的检测

目的:用SEREX方法鉴定HCC表达的肿瘤抗原,检测hcct-19的表达谱．方法:将HCC表达文库铺板,IPTG诱导蛋白质表达,BSA封闭．同1:1 000稀释的预吸收 HCC患者血清反应后,与1:5 000稀释的羊抗人抗体反应,在BCIP／NBT的作用下显色,挑取阳性克隆噬菌斑块,重复筛选和铺板3次,直至得到一致的单克隆免疫阳性重组噬菌体．挑取阳性克隆噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,PCR产物纯化测序, 序列结果用BLAST软件同GenBank中的已知基因进行对比分析．检测阳性克隆抗原基因 hcct-19在部分正常组织、肿瘤组织及肿瘤细胞株中的表达,半定量RT-PCR方法检测阳性克隆抗原基因在肝癌及癌旁组织中的表达．结果:共得到31个阳性克隆,代表14个不同的 cDNA序列,其中10个为已知功能的基因,4 个为未知功能的基因．在已知功能的基因中, RFC2、NDUFA4及MCART1首次被发现与 HCC有关．hcct-19在部分正常组织、肿瘤组织及肿瘤细胞株中表达,在肝癌组织中的表达强度明显高于癌旁组织(13．2±2．7vs2．9±0．3, P<0．05)．结论:本实验筛选出的HCC抗原有助于进一步阐明HCC的形成过程．hcct-19可能作为一个过量表达的基因参与了HCC的发病过程．     

应用干扰RNA体外抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒N基因的表达

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒N蛋白的融合表达载体pEGFP-C1-N以及针对SARS冠状病毒N基因的小发卡型shRNA表达载体pshRNAN，观察shRNA对SARS冠状病毒N基因复制和表达的影响。方法将构建成功的pEGFP-C1-N与psh RNA-N共转染293细胞，于转染后24、48、72h观察GFP表达的强弱，采用Western Blot分别检测GFP与N蛋白的表达，逆转录PCR检测N基因的mRNA。结果pshRNA—N作用组绿色荧光强度明显弱于未干扰组，Western Blot和逆转录PCR结果也证实pshRNA—N对N基因和N蛋白的表达有明显抑制作用，而无关序列的shRNA无此作用。结论针对SARS冠状病毒N基因的shRNA具有显著和特异的抑制N蛋白表达的作用。     

鼠疫菌特异基因的克隆表达和抗原性分析

目的 在大肠埃希菌中克隆表达鼠疫菌特异基因(YPO1089.pst、ymt),分析重组蛋白的抗原性.方法 利用PCR技术扩增目的 基因,PCR产物经纯化、双酶切后,与质粒载体pET-30a(+)相连接并转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞.经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达目标蛋白,并进行10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白免疫印迹分析其特异性,最后采用亲和层析法纯化诱导表达的融合蛋白.结果 成功构建了pET-YPO1089、pET-pst和pET-ymt 3个重组表达质粒,经优化诱导表达条件,重组的rYP01089、rPst和rYmt在大肠埃希菌中均得到了稳定高效地表达;免疫印迹结果表明重组的rPst可与鼠疫阳性血清发生特异性的免疫反应;目标蛋白经纯化后纯度可达95%以上.结论 鼠疫菌的特异性抗原能够在原核蛋白表达系统中获得高效表达,rPst具有敏感且特异的免疫学特性,实验结果为开发新型鼠疫诊断试剂奠定了基础.     

人原发性肝癌组织cDNA文库的构建及鉴定

目的构建人原发性肝癌组织cDNA文库,筛查与原发性肝癌发生特异相关的基因,为探讨原发性肝癌的发病机制及基因治疗奠定基础。方法提取人原发性肝癌组织总RNA并纯化其mRNA;逆转录合成单链cDNA,长距离聚合酶链反应(PCR)合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K水解并纯化后,进行SfiⅠ酶酶切;将酶切产物进行分级分离,回收0.4 kb以上的组分,并与λTriplEx2载体连接;将连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;检测未扩增文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增;检测扩增后文库的滴度和重组效率,随机挑取14个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果未扩增文库的滴度为1.37×106pfu/ml,重组效率为97.46%;扩增后文库滴度为1.28×109pfu/ml,重组效率为99.06%;插入片段平均长度为0.95 kb,长度在1.0~2.0 kb的4个,0.75~1.0 kb的4个,0.5~0.75 kb的6个。结论已成功构建一个乙型肝炎肝硬化基础上发生的人原发性肝癌组织cDNA文库。     

血吸虫感染抗性人血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库

目的分析血吸虫感染抗性人血清中起免疫保护作用抗体针对的日本血吸虫蛋白抗原谱,为日本血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原分子。方法采集血吸虫流行病区感染抗性人血清,免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对获得的阳性克隆核苷酸进行序列分析,并利用软件对所筛基因编码的抗原分子进行表位预测。结果共筛选出29个持续阳性克隆,对其进行测序,获得25个基因,包括5种已知基因(其中日本血吸虫肌球蛋白12个、丝氨酸蛋白酶抑制剂2个、细胞色素b1个、延伸因子1-α1个和线粒体编码区1个)和5个未知基因,软件分析显示不同抗原分别具有多个不同的抗原表位。结论获得的阳性克隆插入基因片段可能编码潜在的日本血吸虫病疫苗分子,其中日本血吸虫肌球蛋白为主要抗感染蛋白分子。